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ai14转基因小鼠原理AI14转基因小鼠是一种常用的转基因模型，被广泛应用于生物医学研究领域。
它的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中，从而使小鼠表达人类或其他物种的特定基因。
通过对AI14转基因小鼠的研究，科学家们可以深入探究与这些特定基因相关的生理和病理过程，为人类疾病的预防和治疗提供重要的基础。
AI14转基因小鼠的制备过程基本分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：科学家们首先需要确定他们想要研究的特定基因，这通常是与某种生理过程或疾病相关的基因。
选择目标基因的确定是研究的关键，它直接决定了后续实验的方向和结果。
2. 构建转基因载体：转基因载体是将目标基因导入小鼠基因组的工具。
科学家们通常使用质粒或病毒载体来构建转基因载体，其中包含了目标基因的DNA序列以及一些调控元件，如启动子、终止子和增强子等。
这些调控元件可以确保目标基因在适当的组织和时间点表达。
3. 转基因小鼠的制备：一旦构建好转基因载体，科学家们就可以将其导入小鼠的基因组中。
目前常用的方法是通过胚胎干细胞技术或直接注射载体DNA进入受精卵。
这些转基因载体会在小鼠的细胞中随着细胞分裂被复制，并最终导入小鼠的生殖细胞中。
4. 筛选和鉴定转基因小鼠：为了确定哪些小鼠成功地导入了目标基因，科学家们通常会对小鼠进行筛选和鉴定。
这包括对小鼠的DNA 进行PCR分析、Southern印迹等实验技术，以确定目标基因是否成功导入小鼠的基因组中。
5. 遗传稳定性的维持：一旦获得了目标基因转基因小鼠株系，科学家们需要确保这些转基因小鼠的遗传稳定性。
为此，他们通常会进行多代交配，并对后代进行基因型分析，以确保目标基因的稳定遗传。
通过AI14转基因小鼠模型的研究，科学家们可以深入研究特定基因在生理和病理过程中的作用。
例如，他们可以观察和分析目标基因在小鼠身上的表达模式以及对生理功能的影响，进而揭示该基因的功能机制。
此外，科学家们还可以利用AI14转基因小鼠模型来研究某些疾病的发生机制，寻找潜在的治疗靶点，并评估新药物的疗效。
转基因小鼠制备方法一、引言转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。
转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。
二、转基因小鼠制备的一般步骤1. 选择目标基因和载体转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。
目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。
载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。
2. DNA构建在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。
这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。
构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。
3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞）转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。
首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。
然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。
4. 转基因小鼠制备转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。
这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。
内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。
外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。
5. 转基因小鼠鉴定转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。
通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。
三、常用技术1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。
通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。
ELISA检测小鼠Cre实验报告本研究采用原核显微注射方法制备受Cre重组酶调控表达的、非免疫耐受的卵清蛋白-HBsAg转基因小鼠，以期为乙肝防治提供更好的动物模型。
试剂及仪器携带目的基因OVA-HBsAg的表达载体pCCALL-Anton由中科院生物物理所王盛典教授惠赠。
在目的基因OVA-HBsAg上游加入CMv增强子及鸡β -actin启动子，并加入两个同向的LoxP位点，以实现后续Cre酶对其表达的调控(图1A)。
目的基因构建成功后，连接入pCCALL2表达质粒(图1B)。
KSOM小鼠胚胎培养基购自Millipore发育良好的CS7BL/6J×DBA母鼠，腹腔注射PMSG10U，48h 后注射HCG 10U促排卵，与CS7BL/6J公鼠按1：1合笼，次日清晨检阴栓阳性有文八体鼠。
取受精卵置于KSOM培养基于37℃培养sh，在显微注射仪上将经内切酶Apa Ⅰ作用线性化的pCCALL-Anton注射入受精卵雄性原核内。
取注射后存活的受精卵移植到假孕KM母鼠的输卵管内，待其怀孕产仔后，进行检测。
转基因小鼠的鉴定剪取约1cm长鼠尾下游引物： 5'-GATACATAGAGGTTCCTTGAGCAGT-3'。
反应条件： 94℃Smin； 94℃ 30s、s2℃ 30s、72℃40s，35个循环；72℃ 5min。
扩增片段318bp。
1.2.3OVA-HBsA转基因小鼠的繁育、传代扩群为尽快扩群,并使子代小鼠背景趋于一以,OvA-HBsAg转基因小鼠首建鼠建成后，与CS7BL/6J小鼠杂交进行传代、培育。
对所得子代小鼠进行PCR 鉴定，并用ELISA法检测HBsAg表达[检测波长450nm，参比波长630nm，吸光度(A)值>0.10s为阳性]。
PCR条件如1.2.2所述。
对PCR阳性鼠，于眼眶后静脉丛采血300u，37℃放置2h后，3000r/min离心10min,取上清，采用ELISA方法检测HBsAg表达。
转基因小鼠制备实验方法1.计划设计：首先确定研究目的和研究对象基因的功能。
根据目的，选择适合的转基因策略。
2.构建转基因载体：根据研究对象基因的序列，设计合成含目标基因的转基因载体。
一般可选择质粒、病毒载体或者合成RNA/DNA方式构建转基因载体。
3.构建胚胎干细胞（ES）或受精卵DNA库：通过开展反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方式，从小鼠胚胎组织中制备出RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化成cDNA；之后，利用特定引物扩增目标基因的cDNA片段，将其克隆到适当的表达载体中，最终构建ES细胞库或者受精卵DNA库。
4.转染、筛选和克隆：将所构建的转基因载体导入到ES细胞或者受精卵中，使其整合到其基因组中。
然后，采用药物筛选、DNA分子标记、PCR和Southern blot等方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，获得含有目标基因的ES细胞克隆或者转基因小鼠胚胎。
5.基因敲除或添加：6.培养和培育：将获得的转基因ES细胞或者受精卵注入到养殖母鼠子宫中进行妊娠，然后等待幼鼠出生。
根据需要，可将转基因小鼠进行进一步培养、繁殖和鉴定。
为了进行转基因小鼠的后代繁殖，需要对转基因小鼠进行基因型鉴定和表型分析。
7.基因鉴定和表型分析：通过PCR、Southern blot、Western blot、RT-PCR或者其他的基因鉴定技术，对转基因小鼠的基因型进行鉴定。
同时，可以通过行为学、生理学和病理学等方法对转基因小鼠进行表型分析。
8.数据分析与结果解读：对表型数据进行统计分析，绘制图表或者进行统计学分析。
根据实验设计和方法，对实验结果进行解读，并得出相关结论。
总结起来，转基因小鼠制备是一个复杂而严谨的实验过程。
通过设计转基因载体、构建DNA库、转染和克隆、培养和培育小鼠以及基因鉴定和表型分析，可以成功制备目标基因转基因小鼠，并用于研究其功能、调控机制以及在疾病中的作用。
第1篇一、实验背景随着生物技术的飞速发展，转基因技术在医学、农业等领域发挥着越来越重要的作用。
小鼠作为生物医学研究中常用的实验动物，其基因编辑技术的应用为疾病模型构建、药物筛选和基因功能研究提供了有力工具。
本实验旨在通过基因编辑技术构建转基因小鼠模型，研究特定基因在小鼠体内的表达和功能。
二、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠，雄性，8周龄。
2. 基因构建材料：目的基因（GFP基因）、启动子（CMV启动子）、荧光素酶报告基因（Luc基因）、pEGFP-C1质粒载体、pGL3-Basic质粒载体。
3. 实验试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、PCR引物、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、细胞培养试剂等。
4. 仪器设备：PCR仪、凝胶成像系统、实时荧光定量PCR仪、细胞培养箱、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因构建：将GFP基因和Luc基因分别插入到pEGFP-C1和pGL3-Basic质粒载体中，构建重组质粒。
2. 重组质粒转染：将构建好的重组质粒通过脂质体转染法转染C57BL/6小鼠胚胎干细胞（ES细胞）。
3. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
4. 胚胎细胞传代培养：将阳性细胞克隆进行传代培养，筛选出稳定表达的细胞系。
5. 胚胎细胞冻存：将稳定表达的细胞系进行冻存，以备后续实验使用。
6. 胚胎移植：将冻存后的胚胎细胞进行移植，获得转基因小鼠。
7. 转基因小鼠表型鉴定：通过GFP荧光显微镜观察转基因小鼠体内GFP表达情况，并通过实时荧光定量PCR检测GFP基因在转基因小鼠体内的表达水平。
四、实验结果1. 重组质粒构建：成功构建了含有GFP基因和Luc基因的重组质粒。
2. 转基因小鼠胚胎细胞筛选：通过GFP荧光筛选，得到阳性细胞克隆。
3. 胚胎细胞传代培养：成功传代培养出稳定表达的细胞系。
4. 胚胎移植：成功获得转基因小鼠。
人源化小鼠构建方法及应用人源化小鼠是指将人类基因或组织移植或置入小鼠中，使其具有人类的某些特性或功能。
目前，人源化小鼠主要包括两种方法：转基因小鼠和异种移植小鼠。
这些方法在医学研究中具有广泛的应用，如研究人类疾病机制、药物筛选、组织移植等方面。
转基因小鼠是通过将人类基因导入小鼠的遗传背景中，使小鼠体内表达人类基因。
这可以通过不同的方法实现，比如使用逆转录酶来制备转基因载体，然后将其导入小鼠胚胎干细胞中，使其成为转基因小鼠的一部分。
此外，还可以使用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，直接对小鼠基因组进行编辑，以达到引入人类基因的目的。
通过转基因技术，可以研究人类基因在小鼠中的表达、功能以及相关疾病的发生机制。
例如，科学家可以通过将人类脑部相关基因导入小鼠中，研究神经发育、认知功能等方面的问题。
异种移植小鼠是将人类组织或细胞移植到小鼠体内，使其具有人类组织的特性。
这可以通过将人类的干细胞或器官移植到小鼠体内，再使其发育成熟。
例如，通过将人类胰岛细胞移植到小鼠体内，可以研究胰岛素的产生及调节机制，这对于糖尿病治疗具有重要意义。
此外，还可以将人类癌细胞移植到小鼠体内，用于研究肿瘤发生、生长机制以及药物疗效的评估。
人源化小鼠在医学研究中具有广泛的应用。
首先，在研究人类疾病机制方面，通过引入人类基因或组织，可以更好地模拟人类体内的生理和病理过程。
例如，通过转基因技术引入与阿尔茨海默病相关的人类基因，可以模拟该疾病发生的机制，从而更好地研究该病的预防和治疗。
其次，在药物筛选方面，人源化小鼠可以用于评估新药的疗效和毒副作用。
通过将人类基因或细胞引入小鼠体内，可以更准确地评估药物在人类中的药效和安全性。
此外，人源化小鼠还可以用于研究器官移植和再生医学。
通过将人类干细胞移植到小鼠体内，可以研究干细胞的分化和发育过程，从而为再生医学的研究和临床应用提供基础。
然而，人源化小鼠也存在一些问题和限制。
首先，转基因小鼠与人类的差异可能会导致研究结果的偏差。
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。
具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。
这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。
2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。
质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。
3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。
4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。
5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。
这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。
6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。
通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。
一种过表达nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和
应用
一种过表达Nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和应用，涉及基因工程技术、动物模型构建及应用，特别涉及一种过表达Nlrp3的转基因小鼠模型及其构建方法和应用。
转基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
1. 设计并合成包含目的基因Nlrp3的DNA序列的质粒载体；
2. 将合成的质粒载体注射到小鼠受精卵中；
3. 将注射了质粒载体的受精卵移植到代孕母鼠体内；
4. 代孕母鼠产下幼崽后，提取幼崽的基因组DNA进行PCR检测，筛选出
转基因小鼠。
通过上述方法，可以成功构建出过表达Nlrp3的转基因小鼠模型。
该模型可以用于研究Nlrp3基因在疾病发生和发展中的作用，为疾病治疗和药物研发提供有价值的实验动物模型。
同时，该模型还可以用于评估和筛选针对
Nlrp3基因的治疗方法和药物。
以上内容仅作参考，您可以通过相关资料进一步了解有关该技术的详细信息。
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。
利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。
只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。
特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。
随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。
使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。
2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。
图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。
通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。
（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。
2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。
默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。
浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。
生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。
例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。
转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。
将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。
将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。
手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。
(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。
用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。
)在研究心血管疾病时，主要运用显微注射法、基因打靶或基因剔除等方法制备各TG M模型Gordon等人首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有种外源DNA顺序的TGM。
1982年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”（supermouse）曾引起整生物学界的轰动。
这方法外源DNA整合率高、容量，DNA长到50kb仍然有效，实验周期缩短，因而应用较广泛，是制备TGM的一种常用方法。
这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（HCG）促使超排卵。
处理后与可育雄鼠交配。
次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（fou nder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有5 0%机率带有整合的基因供实验用。
也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠内脏提取RNA，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。
表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）或放射免疫测定（RIA）等。
亦可取胚胎进行分析。
显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。
我国已有少实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白TGM研究。
如果外源DNA含有突变失活的基因，定点整合人ES细胞染色体后取代原来的同源序列，即是基因剔除。
将这样的ES细胞转入小鼠胚胎，便可得到基因剔除的基因小鼠。
采用突变基因（mutated gene）剔除正常基因以产生定位突变（target mutation）。
即首先选定需要突变基因的全部或部分DNA序列，通过插入、修饰、删除或置换等手段落使其突变，成为靶载体，将靶载体导入小鼠ES细胞中，使之与细胞染色体内同源的靶序列进行重组，达到定位突变细胞内该基因的目的。
然后在细胞水平和分子水平筛选富集发生突变细胞，并注射到小鼠囊胚腔内，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中，所产生的子代雄性嵌合鼠与正常雌鼠交配可获得生殖系携带该突变基因的纯合鼠。
最后对纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产生等进行分析。
目筛选真正发生了同源重组的ES细胞的方案有数种，如正负双向选择法（positive and negative selection,PNS）、标记基因的特异位点表达法及PCR法，其中用得最多的方法首推PNS法。
其基本原理是：构建含有一段与靶基因同源序列（10～15kb）的载体，该序列的一个外显子插有neo r基因作为正选择的标志，在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）基因作为负选择，HSV-tk基因由邻近的neo r基因启动子调节。
用电转移（electroporation）法将重组体导入ES细胞，继续作体外培养，并以新霉素（G4 18）和致死核苷类似物（GANC）作双重筛选。
因随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体细胞DNA中，HSV-tk+基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡。
如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neo r基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗G418有正选择作用，对GANC无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的（图23-3）。
Plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺ApoE基因的TGM模型，并利用这一AS小鼠模型研究了饮食和遗传因素对AS的影响。
图23-3 正负双向选择法示意图a：同源重组；b：随机整合；neo r：新霉素抗性基因；HSV-tkc：疱疹病毒胸苷激酶基因；GeneX：干细胞内源基因（与导入基因同源）；G418：新霉素；GANC：抗致死的核苷类似物GANC；GANC：核苷类似物参与合成，细胞致死。
近几来，随着对基因失活方面研究的深入，引发了基因剔除技术的一大飞跃，产生了条件性基因剔除（conditional gene knockout）。
条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。
目前多采用Cre-loxP重组系统（Cre-loxP-m ediated gene replacement ,Cre-loxP recombination system）。
其中Cre重组酶来源于侵染大肠杆菌P1噬菌体。
分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动DNA 分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxP的特异位点（loxp site），且不需要其他的蛋白质因子。
在Cre酶存在时，两个loxP位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxP位点。
其原理如图23-4所示。
研究发现，在哺乳动物细胞中Cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。
图23-4 Cre酶作用原理1Cre基因转译成Cre酶；2Cre酶作用于基因组上loxP位点；3Cre酶使两个loxP位点联合；4两个loxP位点发生同源重组切除X基因及一个loxP位点而仅留下一个loxP位点。
Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至内源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因HSV-tk及neo r、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。
在此新构建的NDA序列中，在可选择性标记基因和正常基因片段的两侧都连有loxP位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码Cre重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxP位点之间的HSV-tk、neo r及正常的野生型基因均在Cre酶的作用下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxP位点，其Cre-lo xP重组系统进行条件性基因剔除程序如图23-5所示。
条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破，将给动脉粥样硬化的研究增加更便利的条件。
图23-5 Cre loxP重组系统进行条件性基因剔除程序1有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；2将一个loxP位点插在野生型基因片段的3’端；3将新构建的DNA序列整合到基因组上；4在Cre酶的作用下切除HSV-tk、n eo r野生型基因及一个loxP位点；5经过Cre-loxP重组系统作用后所形成的DNA序列。
广义的转基因动物是指通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。
转基因动物可通过插入目的基因用于过表达基因研究，或是通过插入目的基因的shRNA来降低目的基因的本底表达，也可通过同源重组的方法获得基因Knock-in 和Knock-out小鼠。
小鼠作为最优秀的实验动物模型，在转基因动物研究领域也同样得到了广泛验证。
转基因小鼠的制备技术主要有两类，DNA原核显微注射法和胚胎干细胞囊胚显微注射法。
DNA原核显微注射法通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。
此方法是最经典的用于制作转基因动物的方法，也是目前应用最广泛的方法，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。
由这种方法制备的动物品种属于狭义的转基因动物的范畴。
由这种方法制备的转基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷贝首尾相连的形式，其整合到基因组的具体机制目前并没有完全研究清楚。
胚胎干细胞囊胚显微注射法是在体外将外源基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞通过显微操作仪注入动物囊胚，此胚胎干细胞可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。
胚胎干细胞体外培养时保持未分化状态，当被注入囊胚腔后，可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可实现基因的转移。
