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[课件]核酸分子杂交与应用PPT

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核酸分子杂交课件

核酸分子杂交课件
探针标记
将标记物（如放射性同位素、荧 光染料等）连接到探针上，以便 于后续的信号检测。
杂交反应
预杂交
将样品和探针在一定温度和盐浓度下 进行预杂交，使探针与非目的序列的 核酸分子结合，排除非特异性结合。
杂交
将预杂交后的样品和探针进行杂交， 使探针与目的序列的核酸分子结合。
信号检测
放射自显影
对于放射性标记的探针， 可以通过放射自显影技术 检测杂交信号。
背景干扰
由于非特异性结合或交叉杂交的存在，可 能会导致背景干扰，影响结果的判断。
A 对探针质量要求高
探针的长度、纯度、标记方式等因 素都会影响杂交的效率和特异性， 因此需要高质量的探针才能获得可
靠的结果。
B
C
D
实验条件要求高
核酸分子杂交实验需要严格的实验条件， 如温度、盐浓度等，操作不当会影响实验 结果。
02
核酸分子杂交的基本步 骤
样品制备
01
02
03
细胞或组织破碎
通过物理或化学方法破碎 细胞或组织，释放出核酸 分子。
核酸提取
利用离心、沉淀、洗涤等 手段去除细胞碎片和蛋白 质等杂质，提取出核酸。
核酸变性
通过加热或化学试剂使核 酸双螺旋结构解开，形成 单链。
探针制备
目的基因克隆
将目的基因从生物体中克隆到载 体中，形成重组DNA分子。
生物信息学
利用生物信息学技术对核酸分子杂交 数据进行深入分析，挖掘更多有价值 的信息。
自动化与高通量技术
自动化技术
通过自动化技术实现核酸分子杂 交的快速、准确和高效检测，提
高检测效率。
高通量技术
利用高通量技术实现大规模样本 的同时检测，提高检测通量。

核酸分子杂交与应用 PPT课件

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2020年7月6日星期一
39
2020年7月6日星期一
40
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2020年7月6日星期一
41
2020年7月6日星期一
42
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示：
的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何 核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物 作用。将待标记的探针模板与随机引物一 起退火，合成标记探针。
2020年7月6日星期一
16
2020年7月6日星期一
17
标记步骤
• 1、冰浴中，在一微量离心管内顺序加入下 列溶液，并混匀
20mmol/L
DTT
1μl
5mmol/L dATP、dGTP、dTTP 1μl
• 优点：
• 可根据需要人工合成相应的序列；
• 因片段短，只有一个核苷酸突变，其Tm值 也有明显变化，特别适用于点突变的检测
• 杂交速度快特异性强
• 缺点：所带标记物少灵敏度低；片段短杂 交体不稳定
2020年7月6日星期一
8
探针的标记
• 切口平移法 • 标记原理：是目前实验室是最常用的一种
脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌 DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的 dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。
10x切口平移缓冲液
0.5mol/L
Tris.Cl(pH7.2)
0.1mol/L 1mmol/L
MgSO4 二硫苏糖醇(DTT)

核酸分子杂交技术 ppt课件

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ppt课件
15
一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针

基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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26
(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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27
(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11




二、核酸分子杂交的基本原理

根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。

《核酸的分子杂交》PPT课件

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亲缘关系； 2）用来揭示核酸片段中某一特定基因
的存在与否、拷贝数及表达丰度。
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Home 6
二、核酸探针的制备
探针（Probe): 一段带有检测标记的与目的基
因或目的DNA特异互补的已知核 苷酸序列。
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7
探针的制备方法
探针长度一般以50~300bp为宜。
制备方法：
1）利用DNA重组技术
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印精迹选杂课件交ppt的技术流程
21
（二）Northern印迹杂交
与Southern杂交类似。检测 目的RNA的存在与否及含量。
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22
（三）Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经 PAGE电泳并染色后，转移到滤膜 上固定，再用“抗体-抗原”免疫 反应或“DNA-protein”结合反应 鉴别滤膜上的蛋白质。
两者比较：后者不及前者敏感，但后者保 存时间较长，无同位素污染。
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12
一个理想的标记物：
1）标记前后探针的基本结构、化学性 质相同;
2）特异性强、本底低、重复性好； 3）操作简单、节时； 4）安全、无环境污染。
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13
2、探针的标记方法
（1）缺口平移法
（2）随机引物标记法
（3）末端标记法
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
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2
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3
Content of Table
一、核酸分子杂交技术的原理 二、核酸探针的制备 三、核酸探针的标记 四、核酸分子杂交技术
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《核酸杂交技术》PPT课件

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二、核酸杂交的概念 核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)是指具有互补序列的两 条核酸单链在一定条件下按碱基配对原 则形成双链的过程。 通过将标记的已知核酸片段作为探针， 与待测标本核酸进行杂交反应，即可观 察到样本核酸中相应的基因。


①
②
③ ④

根据检测对象和手段不同可将杂交枝术分 为不同类型，常见的有四种类型 Southern印迹杂交（DNA印迹杂交） Northern印迹杂交（RNA印迹杂交） 原位杂交技术（in situ hybridization） 斑点及狭缝杂交(dot blot hybridization) 根据杂交体系的不同，核酸杂交可以分为 液相杂交和固相杂交。


3．电转移法
是通过电泳使凝胶中的带电荷样品沿着与凝胶平 面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，结合到固相 膜上，是一种简便、快速、高效的转移方法。 核酸电转移法一般选用尼龙膜而不是硝酸纤维素 膜作为固相膜

第四节 核酸分子杂交技术
一、 Southern印迹杂交（Southern blotting)
随机引物法（random priming)
Klennow片段 3'ATCGTAGCGATTAGGCCTACCGA5' 5'TAGCA3'
假设：dGTP用32P
①将探针模板变性，与随机引物退火； ②加Klenow 片段，以一种标记dNTP 和三 种普通dNTP 为底物，合成标记DNA； ③变性解链，得到标记DNA 探针
固相杂交是将待测核酸先固定在固相支持物上， 然后与溶液中的游离探针进行杂交，形成的杂交 体结合在固相支持物上。
第二节 核酸探针与标记

《核酸分子杂交》课件

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实验步骤
1
样品制备
获得需要研究的核酸样品并进行提取和
合成探针和标记物
2
纯化。
设计和合成与目标核酸互补的DNA或
RNA探针，并标记探针以便检测。
3
杂交反应
将待测核酸样品与探针和标记物进行杂
杂交产物的检测和分析
4
交反应，使它们结合形成杂交分子。
通过不同的检测方法对杂交产物进行分 析和表征，如凝胶电泳、放射性测量等。
核酸杂交的种类
DNA-DNA杂交
两段DNA互相结合形成双链 DNA。
RNA-DNA杂交
RNA和DNA互相结合形成 RNA-DNA杂交分子。
RNA-RNA杂交
两段RNA分子互相结合形成 双链RNA。
应用
检测病原微生物、基因 突变、肿瘤等
核酸分子杂交可用于诊断病 原微生物感染、检测基因突 变和肿瘤相关标记物。
《核酸分子杂交》PPT课 件
核酸分子杂交是指不同DNA或RNA进行结合形成杂交分子的过程。它在分析 核酸序列的同源性和差异性、检测特定序列的核酸以及研究DNA和RNA的结 构、功能和互动关系方面非常重要。
定义
核酸分子杂交是指来自不同DNA或RNA的单链或双链核酸互相结合形成杂交 分子的过程。
重要性
研究基因表达、基因调 控等
通过核酸分子杂交，我们可 以研究基因的表达模式和调 控机制。
设计新型药物和检测方 法
利用核酸分子杂交技术，可 以设计基于核酸的新型药物 和高灵DNA和RNA的结
性和差异性
核酸
构、功能和互动关系
核酸分子杂交可用于比较 DNA或RNA序列，帮助我 们了解核酸之间的相似性 和差异性。
通过配对互补的探针和标 记物，核酸分子杂交可用 于检测具有特定序列的核 酸分子。

《核酸分子杂交》课件


核酸分子杂交的历史背景
01
1952年，S.E.Luria和 M.Delbrück在研究噬菌体的变 异性时，首次提出了分子杂交 的概念。
02
1961年，R.W.Powell和 E.M.Maxam将分子杂交技术应 用于DNA的化学分析。
03
1973年，J.K.Hershey和 M.Chase用分子杂交技术成功 地检测到了噬菌体PSU-13的基 因组DNA。
利用纳米材料如金纳米颗粒、碳纳米 管等，可以实现核酸分子的高效富集 和信号放大，提高杂交信号的强度和 特异性。
在核酸分子杂交中，纳米技术可以用 于构建高灵敏度的传感器和检测器， 实现对基因组中特定序列的快速、准 确检测。
生物信息学在核酸分子杂交中的应用
生物信息学是利用计算机科学和统计学 的方法，对生物学数据进行分析和解读
洗脱
去除未结合的核酸分子，留下 与目标序列结合的核酸分子。
检测
对杂交产物进行检测，确定目 标序列的存在。
核酸分子杂交的原理
互补性
通过碱基互补配对原则，使单链核酸分子与目标 序列结合形成双链结构。
特异性
由于碱基互补配对原则，使得核酸分子杂交具有 高度的特异性。
温度依赖性
通过调节温度，可以控制核酸分子的变性和复性 ，从而控制杂交过程。
比较转录组
利用核酸分子杂交技术，可以对不同 条件下的转录组进行比较，揭示基因 表达的差异和变化规律。
基因突变检测
突变筛查
通过核酸分子杂交技术，可以对基因进行突变筛查，为遗传性疾病的诊断和治 疗提供依据。
突变定位
利用核酸分子杂交技术，可以快速、准确地定位突变位点，为突变机制和功能 研究提供帮助。
基因组测序与比较基因组学

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（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
.
3
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸
分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核
酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使
.
18
（二）待测DNA样品的电泳分离 1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 3、分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交 所用分子量标准可用核素标记
.
19
（三）凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的
（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比
（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性
.
15
6、非特异性杂交反应：
（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附
（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉
.
9
3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）
dC dt =K2C2 将（1）积分
（1）
一半CC单o 链=D1N+1AK分2C子ot 复性时，（2）式中的（2）CCo 为21
1
1
2 = 1+K2Cot
Cot1/2=
1 K2
（3）
Cot1/2值越大，复性速度越慢
.
10

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一、概念：
1、分子杂交〔hybridization) :有一定同源性的两条 核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱 基互补退火形成稳定的双链分子的过程 。
3、转膜的方式：
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:
(1)毛细管转移。本方法由Southern创造，故又称为 Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单, 不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信 号较弱。
(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼 龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用，可直 接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大，温度 难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般 是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上， 再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的一个贮液槽中流 下，洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优 点是快速，在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常 琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得 到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小 心，会使凝胶碎裂，并且在洗膜不严格时，其背景比毛 细转移要高。
2、固体支持物的种类：
带正电荷的尼龙膜、硝酸纤维膜、PVDF膜
尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型； 硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格 最廉价；PVDF膜介于二者之间。

第一节 核酸分子杂交-PPT

第二十章常用分子生物学技术的原理及应用The Principle and Application of Common Used Techniquesin Molecular Biology掌握：1.分子杂交技术的概念及基本原理2.Southern、Northern、Western印迹法的适用范围。

3.聚合酶链式反应的概念及基本原理4.了解基本概念学习要求学习要求第二十章 常用分子生物学技术第一节 核酸分子杂交第二节 聚合酶链反应第三节 基因文库第四节 生物芯片技术第五节 生物大分子相互作用研究技术核酸的分子杂交：碱基序列互补的单链核酸，根据碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。

以DNA的变性和复性为理论基础复性RNA DNA•将探针与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应，探针的序列如与NC膜上的核酸序列相互补，就可结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其他检测手段就可判断膜上是否有同源的核酸分子存在。

•硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC 膜)探针(probe)的概念用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的已知被标记的DNA片段或RNA片段探针的种类o寡核苷酸探针o基因组DNA探针o cDNA探针o RNA探针•常用探针标记方法：1.放射性核素标记(放射自显影）2.生物素标记（酶联反应-显色）3.地高辛标记（酶联反应-显色）4.分子信标（荧光）第一节 分子杂交技术 – 应用1.Southern印迹杂交法：检测特异DNA片段2.Nouthern印迹杂交法：检测特异的RNA片段3.Western印迹杂交法：检测蛋白质（一）Southern blottingl1975年，英国Edwen Southern创建l检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。

l原始文献出处：Southern EM. Detection ofspecific sequences among DNA fragmentsseparated by gel electrophoresis. J Mol Biol，1975, 98(3):503-517.（一）Southern blotting10×SSC转移缓冲液Whatman 滤纸凝胶Whatman 滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g与探针同源杂交的基因组DNA DNA 酶切片段内切酶NC 膜或尼龙膜Southern转膜---如何转膜？•常用方法：毛细管虹吸印迹法电转印法真空转移法电转印法Southert blotting用途•1、酶切图谱分析•2、特定基因定性和定量•3、基因突变分析•4、限制性片段长度多态性的分析（二）RNA 印迹技术(Northern blotting)相同点：Alwine JC , et al . Method for detection of specific RNA s in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes.Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74(12):5350-5354原始文献出处名称相对于Southern blotting•转移的是RNA •转移前无需酶切•转移效率较高•变性方法不同点原理均为毛细作用。

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2018/12/6 16
RNA酶保护分析法的应用： mRNA定量 mRNA未端定位
内含子在相应基因中的位置
2018/12/6 17
RNA酶保护分析法的主要步骤： 1、制备待测RNA 从细胞或组织中 提取总RNA或mRNA； 2、RNA探针标记 采用体外转录的 方法制备和标记探针； 3、分子杂交：将待测样品RNA和 RNA探针在液相中杂交，杂交前将 样品和探针变性，破坏二级结构； 4、RNA酶消化单链RNA； 5、电泳分析杂交分子。
2018/12/6
2
2018/12/6
3
核酸分子杂交的基本原理与分类 核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。 维持结构稳定的力有三：1、两条链 间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负 电荷。 变性：在理化因素作用下，双螺旋结 构间的氢键断裂，两条链解开形成单 链的过程。
2018/12/6 4
2018/12/6
5
变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
2018/12/6
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2018/12/6பைடு நூலகம்
7
影响变性的因素： 1、碱基组成 DNA分子中G＋C含量 越高Tm越高。在1×SSC溶液中， 两者之间的关系可以用经验公式表 示： Tm＝(G+C)%×0.41+69.3
2018/12/6
11
3、温度 温度过高，有利于DNA变 性而不利于复性； 4、离子强度 5、DNA分子的复杂性 DNA总量一 定时，基因组越复杂，其中特定顺 序的拷贝数越少，互补顺序的浓度 越低，复性反应速度越慢。
2018/12/6
12
分子杂交技术就是利用了核酸分子的 变性与复性原理，使变性的核酸分子 与检测核酸分子在碱基互补的条件下 形成杂交双螺旋的过程。 探针(probe)：在核酸变性实验中，为 使杂交体与单链核酸分子区分开来所 使用的带有标记的单链核酸分子。
其中，69.3为无G＋C存在时的Tm值。 (G+C)%每增加1％，Tm约上升 0.41oC。
2018/12/6 8
影响变性的因素： 2、溶液的离子强度 DNA链骨架上 的磷酸基团带有较多的负电荷，它 们之间的静电相斥作用是其双链的 不稳定因素之一。在无盐的水中， DNA在室温下就会变性，加入盐后， 正离子可以封闭磷酸基团的负电荷， 使DNA稳定性增加，Tm值升高。
2018/12/6
15
RNA酶保护分析法(RPA)：利用 RNase A和RNase T1能专一性降 解单链RNA而双链RNA受到保护的 特点，用体外转录合成的放射性标 记的RNA探针与待检mRNA 进行液 相杂交，使互补序列RNA探针和待 测RNA形成杂交体，用RNase降解 非杂交部分RNA后分析杂交结果。
2018/12/6
13
核酸分子杂交分类： 以杂交分子分类：DNA与DNA杂交； DNA与RNA杂交；RNA与RNA杂交。 以探针标记分类： 以杂交介质分类：液相杂交与固相杂 交。 液相杂交：菌落杂交、Southern印迹 杂交、Northern印迹杂交、原位杂交及 基因芯片等技术。
2018/12/6 14
核酸分子杂交与应 用
核酸分子杂交：来源相同或不同的 DNA甚至DNA与RNA分子变性后，在 合适的条件下通过碱基互补形成双链 杂交体的过程称核酸分子杂交 (molecular hybridization)。核酸分子 杂交技术是目前生物化学和分子生物 学研究中应用最广泛的技术之一，也 是临床分子检验的重要技术。
的结合核酸分子的能力；2、与核酸分子 结合后不影响与探针的结合；3、与核酸 分子的结合稳定牢固；4、非特异性吸附 少；5、具有良好的机械性能便于操作。 2018/12/6
2018/12/6 19
核酸酶S1保护分析法可用于基因转录 起始位点分析及内含子剪切位点分析。 液相杂交的优点： 设备简单、操作方便。 液相杂交的缺点： 过量未杂交探针难以除去，产生高背 景；同源与异源核酸均可形成双螺旋 结构使得杂交结果难以分析。
2018/12/6 20
固相杂交：将欲分析的样品先结合在 固相支持物上，再与探针进行杂交反 应。杂交结果可用仪器或放射自显影 技术分析杂交结果。 固相支持物的选择：可用于固相支持 物的种类很多。一种良好的固相支持 物应具备以下几个特性：1、具有较强
液相杂交(solution hybridization)：是 一种比较原始的分子杂交技术。待测 分子与探针在杂交液中完成反应，利 用层析方法将杂交分子与末杂交分子 分开后用液闪仪进行计数或利用紫外 吸收特性变化分析杂交结果的分子杂 交类型。液相杂交又分为：RNA酶保 护分析法、核酸酶S1保护分析法。
2018/12/6 18
核酸酶S1保护分析法(nuclease S1 protection assay)：原理与RNA酶保护分 析法的原理类似，核酸酶S1能专一性地 降解单链DNA和RNA，而不能降解 DNA/RNA杂交双链。采用M13体系克隆 和扩增特定基因的单链DNA片段，在合 成过程中加入核素标记物，即可合成出 高放射性的单链DNA探针。将探针与待 测RNA样品在液相中进行杂交，形成 DNA/RNA杂交双链。酶解后进行分析。
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2018/12/6
影响变性的因素： 3、pH值 pH值在5～9范围内，Tm 值变化不明显。在高pH值下，可使 碱基失去形成氢键的能力。当pH大 于11.3时所有氢键均被破坏，DNA 完全变性。 4、变性剂 可以干扰碱基堆积力和 氢键的形成，因此可以降低Tm值。 常用的变性剂是甲酰胺和脲，通常 用50％的甲酰胺以使Tm值降低30 oC 。
10
复性：变性核酸分子在合适的条件下 重新形成双螺旋结构的过程称复性。 热变性的DNA溶液在低于Tm值25 oC 的温度下维持相当长的一段时间，则 可使之恢复到天然的双链结构状态。 复性的速度受以下因素影响： 1、DNA浓度 DNA浓度越大复性速 度越快；
2、DNA的分子质量 大分子质量的 DNA扩散速度慢，复性速度慢；