核酸分子杂交-七年制
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核酸分子杂交名词解释
核酸分子杂交名词解释核酸分子杂交是一种重要的分子生物学技术，用于研究核酸的结构、功能和相互作用，并在基因克隆、基因表达调控等领域具有广泛的应用。
以下是与核酸分子杂交相关的重要名词的解释：1. 核酸分子杂交（Nucleic Acid Hybridization）：指将两个不同的核酸分子（DNA或RNA）通过互补的碱基配对形成双链结构的过程。
核酸分子杂交可用于分析DNA或RNA的序列、测定基因表达水平以及检测特定的核酸序列。
2. 探针（Probe）：一条含有特定序列的标记化核酸分子，用于与目标序列进行杂交。
探针通常由放射性核素、荧光染料或酶等标记物标记，以便于在实验中检测其位置和数量。
3. 靶标（Target）：指待被杂交的目标核酸分子，它可以是DNA或RNA，含有待检测或待分析的特定序列。
靶标可以来自于生物样品，如组织、细胞或血清等。
4. 互补序列（Complementary Sequence）：两条核酸分子间相互配对的碱基序列。
在DNA分子中，腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）通过双氢键相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对；在RNA分子中，腺嘌呤（A）与尿嘧啶（U）相互配对，胸腺嘧啶（T）与胞嘧啶（C）相互配对。
5. 杂交化（Hybridization）：指探针与靶标间通过互补序列形成双链结构的过程。
杂交化通常需要一定的时间和温度条件，以保证探针和靶标的互补碱基序列能够正确配对。
6. 杂交化条件（Hybridization Conditions）：影响探针和靶标杂交的因素，包括温度、盐浓度、引物浓度、溶液pH值等。
不同的杂交化条件可选择性地控制互补序列的结合和分离，从而改变杂交的特异性和灵敏度。
7. 杂交化信号（Hybridization Signal）：当探针与靶标杂交时，由于探针上的标记物，如放射性同位素或荧光染料的发光、发射或放射活性，而产生的信号。
通过检测杂交化信号的强度和位置，可以确定探针与靶标的结合情况，以及目标序列的存在与数量。
核酸分子杂交与应用
2019年1月17日星期四 21
2019年1月17日星期四
22
3’末端标记 末端标记属于部分标记。特点是可得 到全长DNA片段，但标记活性不高。 3’末端标记法包括限制酶切和聚合酶 合成两个过程，3’标记有两种方式：
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法 T4DNA聚合酶标记法
2019年1月17日星期四 23
5’末端标记 标记原理：在T4多核苷酸激酶的催化 下，可使 ATP分子上的γ磷酸基团转 移到DNA或RNA分子的5’－OH基团 上。因此采用γ-32P-ATP为底物，即 可将DNA样品5’端标记。但核酸样品 5’端必需是去磷酸的。
2019年1月17日星期四
31
2019年1月17日星期四
32
标记反应步骤： (1)碱性磷酸酶的预处理：碱性磷酸酶 (CIP)硫酸铵悬液4oC下在Eppendorf 离心管中离心1分钟。弃上清，沉淀 重溶于少量水中。4oC下此溶液可保 存一个月以上。 (2)将DNA样品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：
2019年1月17日星期四 26
AATTC CCTAGG
EcoR I
AATTC
BamH I
CCTAGG
加入DNA聚合酶，dNTP(其中一 种为标记核苷酸) AATTC CCTAGG
2019年1月17日星期四
27
T4DNA聚合酶标记法 T4DNA聚合酶具有两种功能，5’→3’ 聚合活性 和3’→5’外切活性。当反应 体系中缺乏dNTP时，T4DNA聚合酶 主要表现为外切酶活性。利用这一特 性可产生5’凸出的DNA片段，然后加 入dNTP，其中之一为标记核苷酸， 在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成 出标记探针。
2019年1月17日星期四
22
3’末端标记 末端标记属于部分标记。特点是可得 到全长DNA片段，但标记活性不高。 3’末端标记法包括限制酶切和聚合酶 合成两个过程，3’标记有两种方式：
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法 T4DNA聚合酶标记法
2019年1月17日星期四 23
5’末端标记 标记原理：在T4多核苷酸激酶的催化 下，可使 ATP分子上的γ磷酸基团转 移到DNA或RNA分子的5’－OH基团 上。因此采用γ-32P-ATP为底物，即 可将DNA样品5’端标记。但核酸样品 5’端必需是去磷酸的。
2019年1月17日星期四
31
2019年1月17日星期四
32
标记反应步骤： (1)碱性磷酸酶的预处理：碱性磷酸酶 (CIP)硫酸铵悬液4oC下在Eppendorf 离心管中离心1分钟。弃上清，沉淀 重溶于少量水中。4oC下此溶液可保 存一个月以上。 (2)将DNA样品溶解于少量10mmol/L tris.Cl(pH8.0)溶液中，然后加入：
2019年1月17日星期四 26
AATTC CCTAGG
EcoR I
AATTC
BamH I
CCTAGG
加入DNA聚合酶，dNTP(其中一 种为标记核苷酸) AATTC CCTAGG
2019年1月17日星期四
27
T4DNA聚合酶标记法 T4DNA聚合酶具有两种功能，5’→3’ 聚合活性 和3’→5’外切活性。当反应 体系中缺乏dNTP时，T4DNA聚合酶 主要表现为外切酶活性。利用这一特 性可产生5’凸出的DNA片段，然后加 入dNTP，其中之一为标记核苷酸， 在T4DNA聚合酶活性的作用下，合成 出标记探针。
分子生物学常用技术
第四章
分子生物学常用技术
Ⅰ.核酸分子杂交（ Ⅰ.核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 DNA/RNA） 核酸分子杂交
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基 1968年由华盛顿卡内基 核酸分子杂交技术，是在1968 学院（ Washington） 学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是， Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补 及其同事发明的 的特定核苷酸序列的单链DNA RNA， DNA或 的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一 起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting） 、诺赛恩RNA印迹技术（ blotting）
1979年 J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝 RNA分子从电泳凝 等人发展而来 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA DNA印迹杂交 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上， 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后 标记的特定蛋白质之抗体进行反应， 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（ blotting）。 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
分子生物学常用技术
Ⅰ.核酸分子杂交（ Ⅰ.核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 DNA/RNA） 核酸分子杂交
核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基 1968年由华盛顿卡内基 核酸分子杂交技术，是在1968 学院（ Washington） 学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是， Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补 及其同事发明的 的特定核苷酸序列的单链DNA RNA， DNA或 的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一 起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting） 、诺赛恩RNA印迹技术（ blotting）
1979年 J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝 RNA分子从电泳凝 等人发展而来 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上， 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA DNA印迹杂交 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上， 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后 标记的特定蛋白质之抗体进行反应， 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（ blotting）。 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
核酸的分子杂交名词解释
核酸的分子杂交名词解释
咱来说说“核酸的分子杂交”是啥玩意儿哈。
有一回我去医院看个亲戚，听到医生在那说啥核酸的分子杂交。
我当时就好奇了，这是啥高深的东西呢？
核酸的分子杂交呢，简单来说就像两个拼图找到了彼此。
咱都知道核酸吧，它就像一条长长的链子。
分子杂交呢，就是让两条有一部分能配对上的核酸链子凑到一起。
比如说，有个病毒的核酸和我们要检测的样本里的核酸，如果它们有相似的地方，通过分子杂交的办法，就能让它们结合在一起。
就好像两个失散多年的兄弟，突然碰到了，然后紧紧抱在一起。
我记得有一次看科普节目，就讲了核酸的分子杂交在疾病检测中的作用。
医生们用这个方法来看看我们身体里有没有某种病毒。
如果能杂交上，那就说明可能有问题了。
所以啊，核酸的分子杂交虽然听起来很专业，但其实就是一种让核酸找到“小伙伴”的方法。
下次你再听到这个词，就可以想象一下两个拼图凑到一起的画面，就明白它是咋回事啦。
核酸分子杂交法
核酸分子杂交法这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。
基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。
探针以放射核素或非放射性核素标记，以利于杂交信号的检测。
所谓杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体（hybrid），杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。
同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。
利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。
与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。
将探针技术与分子杂交技术相结合，从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。
目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。
（一）DNA的变性DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，称为DNA变性。
加热、改变DNA溶液中的pH，或有机溶剂等理化因素的影响，均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。
（二）DNA复性变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。
复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。
核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间，由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。
第二章 核酸的结构与功能
第二章核酸的结构与功能Structure and Function of nucleic acid一、授课章节及主要内容：第二章核酸的结构与功能二、授课对象：临床医学、预防、法医（五年制）、临床医学（七年制）通过本章的学习让学生掌握两种核酸分子即DNA和RNA的化学组成、分子结构和功能及其理化性质的特点和应用。
三、授课学时本章共安排3学时（每个课时为45分钟）。
讲授安排如下：1学时：概述+第一节核酸的化学组成及一级结构和第二节DNA的空间结构与功能中的第一部分：DNA的二级结构——双螺旋结构模型；2学时：第二节DNA的空间结构与功能的第二部分：DNA的超螺旋结构及其在染色质中的组装和第三节RNA的空间结构与功能的第一点：信使RNA（mRNA）的结构与功能3学时：第三节RNA的空间结构与功能的第二点：转运RNA（tRNA）的结构与功能和第二点：转运RNA（tRNA）的结构与功能和第二点：核蛋白体RNA（rRNA）的结构与功能及第四节核酸的理化性质和第五节核酸酶四、教学目的与要求五、重点与难点重点：掌握核酸的分类、分布及生物学意义。
掌握DNA和RNA的化学组成。
掌握DNA 的一级结构、空间结构及其功能，RNA的一级结构以及三种RNA的功能。
掌握DNA的变性、复性、分子杂交的概念。
难点：核酸的结构（DNA的一级结构、空间结构，几种重要的RNA的结构）六、教学方法及授课大致安排以讲授为主，授课结束前作适当的小节，帮助学生消化当天所学的内容，另外课前穿插提问帮助学生复习，巩固已学的知识。
七、主要外文专业词汇八、思考题1、试比较两类核酸的化学组成、分子结构、分布及生物学功能。
2、简述DNA双螺旋结构的碱基组成的Chargaff规则。
3、简述真核细胞的mRNA的结构特点和功用。
4、简述tRNA的分子组成、结构特点和功能。
5、什么是TM值？他有何生物学意义？6、什么是核酶？他在医学发展中有何意义？7、什么是DNA变性、复性、分子杂交和增色效应？有何实际意义？九、教材与教具：人民卫生出版社《生物化学》第六版十、授课提纲(或基本内容)概述Introduction核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。
核酸分子杂交技术定义
核酸分子杂交技术定义核酸分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的技术手段。
它利用互补配对的原理，将两个核酸链在一定条件下结合成一个双链分子。
该技术可用于分析、检测、鉴定、筛选和修饰核酸分子等方面，具有重要的实验和临床应用价值。
一、技术原理核酸分子杂交技术的原理是基于核酸互补配对的规律。
核酸是由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成的双链分子，两条链通过氢键相互配对形成双螺旋结构。
在核酸分子杂交技术中，将两个互补的核酸链置于一定条件下（如适当的温度、pH值和离子浓度等），使它们形成双链分子。
这个过程中，两个链之间的氢键会断裂，然后重新组合成新的氢键，形成一个更稳定的双链分子。
这个过程被称为“杂交”。
二、应用领域1. 分析基因序列核酸分子杂交技术可用于分析基因序列。
通过与已知序列相比较，可确定未知序列的位置和组成。
这种技术被广泛应用于基因组学和生物技术领域，包括基因定位、基因诊断、基因克隆和基因表达研究等方面。
2. 检测病原体核酸分子杂交技术可用于检测病原体。
该技术可以检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等微生物的存在和数量。
与传统的细菌培养方法相比，核酸分子杂交技术具有更高的灵敏度和特异性，可以更快速和准确地诊断疾病。
3. 鉴定基因型核酸分子杂交技术可用于鉴定基因型。
通过检测DNA序列的变异，可以确定不同基因型之间的差异。
这种技术被广泛应用于疾病的遗传咨询、人类学研究和法医学等领域。
4. 筛选基因库核酸分子杂交技术可用于筛选基因库。
该技术可以通过与探针的杂交来筛选目标基因，从而快速地鉴定和克隆感兴趣的基因。
这种技术被广泛应用于基因工程、药物研发和生物产业等领域。
5. 修饰核酸分子核酸分子杂交技术可用于修饰核酸分子。
通过与修饰剂的杂交，可以将不同的化合物引入到核酸分子中，从而实现对分子结构和性质的调控。
这种技术被广泛应用于药物研发、生物材料和生物传感器等领域。
三、实验步骤核酸分子杂交技术的实验步骤包括样品处理、杂交反应、检测和数据分析等环节。
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。
在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。
这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。
作为检测工具用的已知RNA或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。
它常常用放射性同位素来标记。
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。
而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。
这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。
2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。
比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。
目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。
这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。
常用于在双链DNA 上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。
由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。
核酸的分子杂交
Home
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
Home
应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
202X
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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前 言
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Part
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02
前 言
Home
核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
3 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。
3.1 标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。
有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。
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应 用：
检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； 用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。
2 核酸探针的制备
2.1 探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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第五节 核酸的分子杂交 Nucleic Acid Hybridization
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核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。
2.2 探针的制备方法
01
02
03
PCR扩增
DNA重组技术
化学合成
长度一般以50~300bp为宜。制备方法：
2.3 探针的分类 据来源及性质不同可分为： 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
2.4 合成寡核苷酸探针注意原则
核酸杂交
•第一节 核酸分子杂交的基本原理 •第二节 核酸探针 •第三节 核酸分子杂交技术
第一节
核酸分子杂交的基本原理
DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间， 只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂 交。常用已知的 DNA 或 RNA 的片段作为探针，包括 特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列， 或人工合成的寡核苷酸片段。
(4)
与核酸分子的结合稳定牢固，
非特异性吸附少。
(5)
具有良好的机械性能。
下面介绍几种常用的固相支持物：
(1) 硝酸纤维素膜：特别适用于蛋白质(如抗体和酶等) 的非放射性标记探针的杂交体系。 (2) 尼龙膜(nylon membrane)：尼龙膜结合单链及双链 DNA和RNA的能力较硝酸纤维素膜更强，耐碱处理适 合于一步法的菌落原位印迹法。 尼龙膜的缺点是不宜使用非同位素探针，即使用各种 蛋白 ( 如 BSA 、牛奶等 ) 进行预杂交，产生的杂交信号 本底较高，与非特异吸附有关。 PVDF膜：比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容 易被封闭，使用同位素和非同位素探针都可产生较浅 的本底，而且结实耐用，可以多次杂交。
同源样品杂交后，阳性结果产生斑点，故称斑点杂
交。
4.反向斑点杂交(reverse dot hybridization)：直接将不 同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与 之杂交，这样一次杂交反应就可以判断待测 DNA是否 含有这些探针的同源序列。
5.菌落或噬菌斑杂交(图7-13)。
二、核酸原位杂交
⒊电转法如图7-11所示。
㈣ 印迹类型
Southern印迹杂交法(Southern blot hybridization)(图 7-12)。
核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类（可编辑）
核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的基本原理与分类分子杂交技术与应用分子杂交技术与应用? 分子杂交技术的目的是什么?分子杂交的基本方法有哪些?Southern印迹法有哪些步骤,为了达到什么目的呢为什么叫印迹法呢?一、核酸分子杂交的基本原理与分类一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理(一)核酸分子杂交的基本原理1、变性(denaturation)1、变性(denaturation)(1)定义:(1)定义: 在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。
螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。
(2).引起核酸变性的因素(2).引起核酸变性的因素变性剂变性剂酸(尿素)(尿素)碱碱有机溶剂热有机溶剂热(乙醇)(乙醇)(3)、变性后核酸的特点:(3)、变性后核酸的特点:粘度下降粘度下降密度增加密度增加紫外吸收增加紫外吸收增加 2、融解温度(Tm):2、融解温度(Tm):定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最定义:在DNA热变性时,其A 的升高达最260260 大值一半时的温度。
大值一半时的温度。
3、复性(退火)3、复性(退火) 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。
变性DNA 经过一定处理重新形成双螺旋的过程。
影响复性速度的因素: 影响复性速度的因素:DNA浓度 DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 DNA片段复杂性合适的复性温度合适的复性温度适当的离子强度适当的离子强度4、杂交4、杂交定义两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按两条来源不同,但具有互补序列的核酸,按碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即碱基配对原则复性形成一个杂交体,这个过程即分子杂交。
分子杂交。
DNA/DNA的杂交作用:DNA/DNA的杂交作用: 检测特定生物有机体之间的亲源关系检测特定生物有机体之间的亲源关系DND/DNA或RNA/DNA:DND/DNA或RNA/DNA: 揭示核酸片断中某种特定基因的位置。
核酸分子杂交
操作程序： 蛋白质样品制备→SDS-PAGE分离→蛋白质的电转移 （印迹）→靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合→显色、 分析。
59 59
marker 样品
转膜
凝胶
膜
滤纸 滤纸
marker 样品
Western
蛋白质 样品
聚丙烯酰胺凝胶电泳
缓冲液
marker
样品
marker 样品
一抗
二抗
X胶片 曝光
marker 样品
53 53
（二）Northern Blot
是指待测RNA样品经 电泳分离后转移到固相支 持物上，然后与标记的核 酸探针进行固-液相杂 交，检测RNA （mRNA）的方法。
➢ 样品是RNA。
➢ 电泳前，不酶切。
➢ 电泳前，样品变性。
➢ 电泳过程中，样品保 持变性状态。
➢ 电泳后，样品不再变 性，直接转膜。
2. 复性过程：
（1）单链分子间碰撞形成局部双链
（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
（4）形成完整的双链分子
13
复性过程中的碱基配对
14
Hybridization
15
❖ 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双 链，如：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡 核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA，该特性是体外杂 交技术的基础。
EE
E
EE H
E H
DNA片段：
（最长的DNA片段控制在大约2 kb）
38
2.待测DNA样品的电泳分离
12
2000
1000 750 500
250 100
0.8 ~ 1％ 非变性琼脂糖凝胶
59 59
marker 样品
转膜
凝胶
膜
滤纸 滤纸
marker 样品
Western
蛋白质 样品
聚丙烯酰胺凝胶电泳
缓冲液
marker
样品
marker 样品
一抗
二抗
X胶片 曝光
marker 样品
53 53
（二）Northern Blot
是指待测RNA样品经 电泳分离后转移到固相支 持物上，然后与标记的核 酸探针进行固-液相杂 交，检测RNA （mRNA）的方法。
➢ 样品是RNA。
➢ 电泳前，不酶切。
➢ 电泳前，样品变性。
➢ 电泳过程中，样品保 持变性状态。
➢ 电泳后，样品不再变 性，直接转膜。
2. 复性过程：
（1）单链分子间碰撞形成局部双链
（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列
（4）形成完整的双链分子
13
复性过程中的碱基配对
14
Hybridization
15
❖ 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双 链，如：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡 核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA，该特性是体外杂 交技术的基础。
EE
E
EE H
E H
DNA片段：
（最长的DNA片段控制在大约2 kb）
38
2.待测DNA样品的电泳分离
12
2000
1000 750 500
250 100
0.8 ~ 1％ 非变性琼脂糖凝胶
8年制生物化学与分子生物学 第23章 DNA操作的基本技术
36
目录
酵母双杂交技术的基本原理
37
目录
（一）酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测 蛋白-蛋白的相互作用 （二）酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定 / 分离新的相互作用蛋白及其编码基因 （三）哺乳动物双杂交系统是在酵母双杂交系统 基础上发展的
38
目录
二、酵母单杂交系统需要构建“报告”细胞
• 酵母单杂交技术（ yeast one-hybrid ）由 J. Li于1993年从酵母双杂交技术发展而来
12
目录
PCR技术的工作原理
5` 3` + 引物 变性、退火 + dNTPs Taq DNA聚合酶 5` + 不同长度新链DNA + 引物 变性、退火
13
目录
3` 5`
5`
3` 5`
5` 3` 5` 循环1
5`
3` 5`
3` 5`
5`
3` + + + dNTP + Taq DNA 聚合酶
3` 5` 3` 5` 3` 5` 3` 5`
18
目录
第三节
DNA序列测定
DNA Sequencing
19
目录
* DNA序列分析方法的演变和发展
• 20世纪70年代 – 双脱氧链终止法：F. Sanger – 化学裂解法：A. Maxam和W. Gilbert • 20世纪80年代 – PCR及自动测序技术
20
目录
一、DNA序列分析有双脱氧链终止法和 化学裂解法
–蛋白质检测芯片 –蛋白质功能芯片
• 组织芯片是以形态学为基础进行高通量检 测基因表达信息的芯片技术
–多组织片 –组织阵列 –组织微阵列
医学分子生物学 历年考题
2016级研究生医学分子生物学试题一、名词解释1.第二信使：指在细胞内传递信息的小分子物质，如Ca2+、甘油二酯DAG、三磷酸肌醇IP3、环腺苷酸cAMP、环鸟苷酸cGMP等。
2.顺式作用元件（cis-acting element）：DNA分子中的一些调控序列，包括启动子、上游调控元件、增强子、加尾信号和一些细胞信号反应元件等。
3.单顺反子mRNA：真核生物的一个编码基因转录只生成一个mRNA分子。
4.管家基因：对所有细胞的生存提供基本功能，因而在所有细胞中持续表达的基因。
5.miRNA：指由内源性基因编码产生的，长度为22个核苷酸的单链非编码RNA，能与mRNA特异结合，诱导mRNA降解或抑制其翻译。
6.限制性核酸内切酶（RE）：一类能识别双链DNA分子内部的特定核苷酸序列，并在该特异位点裂解磷酸二酯键的核酸内切酶。
7.TM值：加热变性使DNA50%双链结构被打开的温度称为该DNA的熔解温度，即紫外光吸收值达到最大值的一半时的温度。
8.载体：能携带目的外源DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。
9.cDNA：互补DNA，以mRNA为模板，经过逆转录生成的与RNA碱基序列互补的DNA 链。
10.内含子：位于外显子之间、可被转录在前体RNA中，但经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中的核苷酸序列，又称为间插序列。
二、简答题1.原癌基因激活机制①获得增强子与启动子②基因点突变③基因扩增④染色体易位与基因重排⑤基因甲基化水平降低2.真核细胞基因组特点①基因组庞大②结构基因是断裂基因③非编码序列远多于编码序列结构④大量的重复序列⑤基因的转录产物为单顺反子mRNA⑥染色体末端具有端粒结构⑦基因组存在大量的顺式作用元件：包括启动子、增强子、沉默子等⑧基因组中存在多种DNA多态性3.重组DNA（又称分子克隆）步骤①用限制性核酸内切酶切割外源DNA，分离带有目的基因的DNA片段。
（分）②选择或改造载体DNA分子，并用限制性核酸内切酶进行切割。
核酸分子杂交的原理和实验方法
核酸分子杂交的原理和实验方法原理所谓DNA探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。
如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。
在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成掺入地高辛的DNA链。
以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。
一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。
免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB显色。
敏感性很高。
可用于膜上杂交和原位杂交。
操作程序(1) 随机引物标记操作程序如下：①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μg DNA至总体积16μl。
②DNA热变性：把DNA瓶置于沸水中，水浴10分钟。
然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。
③加4μl DIG Random Labeling Mix(高效),混匀后再离心2000/r.p.m×5分钟。
④置37℃反应至少120分钟。
时间越长，产量越高。
延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。
应根据需要控制反应时间。
⑤加入2μ1 10mM EDTA以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。
且可反复使用。
可根据下表估计标记产量：DNA模板量标记一小时标记二十小时10ng 45ng 600ng30ng 130ng 1050ng100ng 270ng 1500ng300ng 450ng 2000ng1000ng 850ng 2300ng3000ng 1350ng 2650ng(2)核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA的一级结构。
两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA的二级结构。
核酸分子杂交的名词解释
核酸分子杂交的名词解释核酸分子杂交是一种利用生物学原理实现物种间遗传信息交互的技术，它既是一种有效的基因组学研究方法，也是认识有机体的基础研究的技术，在生物医学研究中发挥着重要作用。
核酸分子杂交是指两个不同的核酸分子发生特定的相互作用，使它们的特征与相应的基因终端段产生特定的结合关系，从而获得特定的结果。
核酸分子杂交可以使两个不同的物种间的基因特征进行精准的互相作用。
核酸分子杂交是一种特殊的基因转移方式，它可以把某一物种所携带的基因特征转移到另一物种体系中，从而获得新型的有机体特征。
例如，人类可以通过把一些先进的基因特征转移到谷子种子中，来改良谷子产量和品质等。
核酸分子杂交的实现需要各种技术方法，包括聚合酶链式反应（PCR），核酸外切酶特异剪切，蛋白结合基因疏水的酶切，抑制剪接酶的介导，DNA断片构建和连接技术，以及质粒、质粒和细胞内DNA 断片的迁移、裂解等技术。
核酸分子杂交的应用非常广泛，它可以应用于基因组分析、疾病的预防、检测和治疗、品种改良、新药研究和毒物分解等多个领域。
在基因组研究中，可以利用核酸分子杂交技术对宿主和病原体之间的基因特征进行比较，从而获得重要的研究信息。
在疾病的预防、检测和治疗方面，核酸分子杂交可以帮助医学研究人员发现疾病机理，以便找到合适的治疗方法。
当核酸分子杂交有效地检测出某种疾病时，可以及早进行处理，以防止疾病的恶化。
此外，核酸分子杂交还可以应用于品种改良、新药研究和毒物分解等领域。
在品种改良中，可以利用核酸分子杂交来选择出更加抗逆的品种；在新药研究中，可以通过核酸分子杂交来快速发现新的药物活性物质等。
此外，核酸分子杂交还可以帮助毒物分解，从而达到净化环境的目的。
总之，核酸分子杂交是一种重要的生物学原理，在生物医学研究领域具有重要作用，它可以应用于基因组研究、疾病的预防、检测和治疗、品种改良、新药研究和毒物分解等多个领域。
因此，核酸分子杂交是一项极具前瞻性的技术，它为医学研究和药物发现提供了重要的科学依据，是未来科学研究和应用发展的重要方向。
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2．印迹方法 Mechanics of transfer
Blot DNA to membrane
✓虹吸印迹法（Capillary） ✓真空转移法（Vacuum） ✓电转移法（Electrophoretic）
Capillary Blotting (upward) no special equipment required!
Migration
blocksubstrate probe
第二节 核酸探针
probe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段， 用于检测待测样品中的靶核酸序列。
➢ 核酸探针的类型 ➢ 核酸探针的标记方法 ➢ 核酸探针的检测
核酸探针的类型
按化学本质分：DNA探针 RNA探针
按标记物分：放射性标记探针 3H、32P、35S、125I等 优点：高特异性，高灵敏度 缺点：存在放射性污染，半衰期短 非放射性标记探针 生物素，地高辛、荧光素等
Southern blotting hybridization
提取DNA
检测靶分子为DNA, 检测靶分 子是否含有目的基因。
可用于 基因组基因的定性及定量分析、 克隆基因的酶切图谱分析、 基因突变分析等。
限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 碱变性
转移到NC膜，高温烘烤
预杂交
与DNA或RNA探针杂交
放射自显影
•Southern印迹杂交的应用：
➢ 检测靶分子为DNA, ➢ 检测靶分子是否
含有目的基因。 ➢DNA指纹图谱
Northern blotting hybridization
检测靶分子为RNA
RNA极易被 RNase 降解 RNA酶抑制剂
0.1%DEPC处理水 (焦碳酸二乙酯)
Northern blotting hybridization
优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）
缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；
杂交信号的本底也高。
3、PVDF膜（聚二氟乙烯）： 1. 与尼龙膜相似 2. 其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的
离子反应，而比尼龙膜结合力更强 3. 且在预杂交中很容易被封闭 4. 杂交本底低 5. 结实耐用，可多次杂交。
应用：同一种样品经不同倍数的稀释, 可以得到半定量的结果； 核酸粗提样品的检测效idization
直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测 的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判 断DNA是否含有这些探针的同源序列。
第一节 核酸分子杂交的基本原理
一、变性（denaturation） 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 四、预杂交（prehybridization）
基本原理：DNA变性、复性与分子杂交
Hybridization
Tm ：50%DNA解链的温度，又称融解温度。 （G、C含量）Tm = 69.3 + 0.41*(G +C) %
pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heart
muscle
Southern blotting hybridization
Dot and slot blotting hybridization
将变性后的DNA或RNA直接点样与膜上
优点：简单、迅速（直接点样）； 可在同一张膜上进行多个样品的检测；
磷酸基团以共价键结合。
（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。 缺口平移法、随机引物法、末端标记法等
32P或35S同位素标记 的单核苷酸
dig-dUTP的结构
（1）缺口平移法（nicktranslation）
由DNA酶Ⅰ和大肠 杆菌DNA聚合酶Ⅰ 共同完成。
固相杂交
液相杂交
膜上印迹杂交
核酸原位杂交
一、膜上印迹杂交
指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与 存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定
的固相支持物上的方法。
1．固相支持物的选择
特点： 较强的结合核酸的能力（>10μg/cm2）;
与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应; 与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等； 非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉; 具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。
常用的固相支持物
硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等
1、硝酸纤维膜：
①是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用， RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上
②在高盐浓度下，其结合能力80-100μg/cm2 ③吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上
优点 杂交信号本底较低 缺点 ①由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交
影响核酸分子杂交的因素
•探针的浓度、长度、复杂性 •离子强度 •温度与变性剂（甲酰胺） •杂交条件的严谨性
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
预杂交prehybridization
概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异 性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。 这一杂交前的处理过程称为预杂交。
Vacuum blotting 30~60分钟
–more efficient and quantitative than capillary –must apply vacuum evenly and not too strongly
3．印迹类型
• Southern印迹杂交 • Northern印迹杂交 • 斑点及狭缝印迹杂交 • 反向斑点杂交 • 菌落或噬菌斑杂交
与Southern blotting hybridization不同之处：
➢ 不需要限制性核酸内切酶酶切。 ➢ 变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、
甲醛、甲基氢氧化汞等方法。
应用：
➢ 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。 ➢ 比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。
GEF mRNA
非放射性标记探针：偶联反应+显色反应
Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联
Dig-DNA探针
+
抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP） 或辣根过氧化物酶（HRP）
+
底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色 或 DAB 红棕色； TMB 蓝色
第三节 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交的分类
核酸分子杂交 ↓
常用的固相支持物：
硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等
固相支持物的选择
良好的固相支持物应具备的条件：
➢ 具有较强的结合核酸分子的能力（>10μg/cm2） ➢ 与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应 ➢ 与核酸分子结合牢固 ➢ 非特异性吸附少 ➢ 具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作
➢检测对象: 克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。 杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞 内杂交, 即细胞原位杂交。
➢核酸分子杂交特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性
➢应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定 基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸 分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在 临床基因诊断上的应用也日趋增多。
➢DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使 用仔细纯化后的DNA。
（2）随机引物法 （random priming）
随机引物（4-6nt）：含 有各种可能排列顺序的寡 核苷酸片段的混合物。
46=4096
DNA聚合酶ⅠKlenow片段：
5’→3’DNA聚合酶活性
弱3’→5’外切核酸酶活性
常用的探针标记法：
（1）化学标记法：光敏生物素标记法
（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后
利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。 切刻平移法、随机引物法、末端标记法等
（1）化学标记法：通过分子上的活性基团直接将标
记物结合到核酸分子上.
光敏生物素标记法:强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的
Tm=4 ℃ X（G + C）+ 2℃ X（A + T）
融解温度：50％杂 化核酸分子解链温 度称为寡核苷酸探 针的Tm值。
寡核苷酸探针的长 度、碱基的含量和 核酸的序列决定了 探针的Tm值。
实际操作中，常选 择低于Tm值5-10℃ 进行杂交。
杂交温度：
– Tm=81.5℃ + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%）
甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，
– M为Na+摩尔浓降度低，核n酸为杂探交针的的T复m值杂，性50%的甲酰胺可以使Tm降低30℃
例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为 50%，杂交体系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和50% 甲酰胺，则其Tm值为：
Tm=81.5℃ + (-2.07) + 20.5 – 1 – 30.5=68.4 ℃ –50%甲酰胺溶液, 温度一般选择低于 Tm值20-25℃ –杂交温度应:68.4 ℃ - 25 ℃=43.2 ℃
及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降 ②对小分子量的DNA片段（<200bp）结合能力不强 ③靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移 ④易破碎
2、尼龙膜：