第9章 核酸分子杂交技术与应用

核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。

2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。

常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。

三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。

﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。

可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。

以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。

增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。

DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。

同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。

由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。

增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。

变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。

可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。

本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。

电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。

由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。

在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。

从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。

分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。

Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。

它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。

在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。

这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。

在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。

作为检测工具用的已知RNA 或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。

它常常用放射性同位素来标记。

虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。

而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。

这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。

2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。

比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。

目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。

这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。

常用于在双链DNA上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。

由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。

核酸分子杂交摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。

也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。

本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。

关键词:核酸分子;分类;应用;1、核酸杂交技术的原理核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。

DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。

DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。

双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。

两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。

核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。

通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。

此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。

核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。

2、固相分子杂交:将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。

固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。

2、1 Southern印迹杂交1975年建立的一种DNA转移方法。

该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。

首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。

分子杂交技术引言分子杂交技术是一种重要的实验手段，在生物学和生物化学领域被广泛应用。

它通过将两个不同源的核酸序列（DNA或RNA）进行杂交，从而得到具有特定性质和功能的新分子。

在本文中，我们将介绍分子杂交技术的原理、应用和未来发展方向。

原理分子杂交技术主要基于核酸的互补配对原理。

DNA和RNA 分子中的碱基有互补配对性质，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）互补配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）互补配对。

在杂交过程中，两个互补的核酸序列会通过碱基间的氢键相互结合，形成一个稳定的双链结构。

应用分子克隆分子杂交技术在分子克隆中起到至关重要的作用。

通过将目标基因的DNA序列与载体DNA进行杂交，可以实现基因的定向克隆。

例如，使用限制性内切酶将目标基因和载体DNA切割开后，通过杂交技术将两者粘合在一起，形成重组DNA，然后可以通过转化、转染等手段将重组DNA导入到宿主细胞中，实现基因的表达。

基因探针分子杂交技术也被广泛应用于基因探针的设计和制备。

基因探针是一种用于检测目标基因在细胞或组织中表达情况的分子工具。

通过将特异性的探针与目标基因进行杂交，可以实现对目标基因的检测和定位。

分子杂交技术可以用于制备放射性或非放射性的探针，例如荧光探针或生物素标记的探针，从而实现对目标基因的高灵敏度和高特异性的检测。

基因组分析分子杂交技术还可以用于基因组分析。

例如，通过杂交技术可以将特异性的探针与目标基因组中的特定区域进行杂交，从而实现对基因组的定位和映射。

此外，分子杂交技术还可以用于研究基因组中的DNA重复序列、非编码RNA等。

DNA鉴定分子杂交技术在DNA鉴定领域也有广泛的应用。

例如，通过杂交技术可以将可疑犯罪嫌疑人的DNA样本与现场留下的DNA样本进行比对，以确定是否属于同一人。

此外，分子杂交技术还可以用于亲子鉴定、物种鉴定等。

未来发展方向随着科技的不断发展，分子杂交技术也在不断更新和发展。

未来，我们可以预见以下几个方面的发展：1.高通量分子杂交技术的发展：随着高通量测序技术的发展，分子杂交技术可以与测序技术结合，实现对大规模样本的高效分析，从而推动基因组学、转录组学等领域的研究进展。

班级生物硕01 姓名牛浩学号 20172120470核酸分子杂交技术简介及其应用摘要：本文简要介绍了核酸分子杂交技术的基本概念及其原理，它的杂交类型，包括斑点杂交、细菌的原位杂交技术、Southern吸印杂交和Northern吸印杂交。

探讨了核酸分子杂交技术的研究应用，最后对核酸分子杂交技术做出了相应的研究展望。

关键词：核酸分子杂交技术；概念；原理；杂交类型；研究应用；展望1 基本概念及原理核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化学、分子生物学和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。

也是现阶段定性、定量和定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。

由于其特异性强，灵敏度高、定位准确等优点，目前已被广泛应用于分子生物学、生理学、遗传学、病毒学等基础学科的研究。

DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。

在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。

加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。

变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。

在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度T m。

T m值得大小取决于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其T m值越高。

因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键[1]。

变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。

根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。

杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。

核酸分子杂交特点：灵敏度高（<1pg互补序列）速度快（<24h）简单易行应用：基因克隆的筛选; 酶切图谱制作;基因组中特定基因序列的定量和定性检测;基因突变分析;疾病的诊断;微生物病原体检测利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。

与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。

核酸分子杂交:用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。

待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。

核酸分子杂交的基本原理:1变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。

加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。

变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。

可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。

以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。

A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。

Tm与核酸的G、C含量有关。

Tm=（G+C）%×0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。

2复性: 在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。

在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。