沙棘叶科罗索酸的浓缩及其降血糖机制的研究

科罗索酸的氨基酸衍生物合成及其降糖作用初步研究
糖尿病是近年来困扰人类健康的最主要的疾病之一,因此对糖尿病的治疗药物的研究与开发也是近二十年来药学界的热点之一。

天然来源的科罗索酸具有抗肿瘤、降血糖、抗炎、抗病毒和抗心血管疾病等作用,尤能起到类似于胰岛素的生理作用,所以他又被称为"植物胰岛素",具有较好的降血糖活性,受到人们广泛关注,目前在国内外已被开发成多种保健品。

但是科罗索酸由于其水溶性较差导致生物利用度低,因此迫切需要通过对其结构进行衍生化修饰来增加其亲水性,从而提高其生物利用度和药理活性。

本课题以科罗索酸为母体,在28位羧基引入了甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)这几种天然α-氨基酸,全新合成出了六种科罗索酸衍生物。

化合物的结构均用1HNMR、12CNMR及ESI-MS进行表征。

在对其进行的初步药理学研究中,我们采用葡萄糖氧化酶法测定培养液中葡萄糖含量,以各组空白孔均值为对照,计算该组各孔培养液中葡萄糖含量的变化值(GC)。

同时,用MTT法于酶标仪上测定各组培养液的0D值,最终以GC/MTT表示单位细胞的糖消耗量,并以此为指标评价各化合物的降血糖活性。

龙源期刊网 浅谈沙棘对糖尿病的最新研究进展作者：田景民博士来源：《糖尿病新世界》2010年第01期糖尿病是如今困扰人类的一种十分严重的内分泌疾病,它常以多尿、多饮、体重减轻,多食及疲劳等为表现。

如果不科学合理控制这些症状,改善机体的机能,可引起多种并发症,如胃肠功能紊乱、眼部疾病、心脑血管病、肾功能衰竭、神经末梢病变等。

糖尿病并发症是导致糖尿病患者死亡的直接原因,很多人得了糖尿病后不知情,出现并发症后才得到准确诊断,耽误了治疗的最佳时机。

糖尿病具有家族遗传性,因此对糖尿病患者来说预防与调理是十分重要的。

R,Norman在《J.Amer.Chem.Soc.》杂志中表明治疗糖尿病主要应从调节血脂、提高免疫力、保护胰岛细胞、修复神经元、调控糖代谢中的酶入手。

沙棘是生命力非常旺盛的药食两用植物,《黑龙江医药》杂志《沙棘化学成份的研究与进展》中记载,沙棘中富含100多种人体生命所需活性物质和营养物质,这些物质主要集中在沙棘种子油中,包括不饱和脂肪酸、黄酮类、天然维生素、类胡萝卜素、多酚、植物甾醇、油溶性SOD以及人体不可或缺的微量元素等。

佳木斯大学基础医学院赵伟曾做实验与临床研究均证实,沙棘可以影响糖尿病大鼠机体糖代谢水平,明显缓解症状,同时可以改善血液中血脂TC、TG、LDL—C、HDL—C的含量及比例,增强机体免疫能力,从而减少糖尿病并发症的发生。

(摘自《黑龙江中医药》杂志)宇航人集团与华东师范大学生命科学学院联合完成沙棘在防治糖尿病及其并发症的研究项目,证实沙棘可以调节糖尿病患者血糖水平,提高胰岛素敏感性、减少尿蛋白的排出或增加蛋白的净合成,保护肾脏功能。

尤其在抑制引发糖尿病并发症的罪魁祸首糖基化终产物(AGEs)产生,清除自由基对机体细胞(胰腺细胞)的损伤,防治糖尿病并发症发生具有独到之处。

沙棘叶中科罗索酸浓缩物的测定方法张璐;田晓东;王斌;张琼姝;张吉科;郭海利;张小民【摘要】对沙棘叶中科罗索酸的浓缩和提取方法进行了初步探究,提出了沙棘叶中科罗索酸含量的测定方法.结果显示,最佳提取方法是水-乙醇提取法,提取率为0.8％;提取物测定的色谱条件为:20RBAXSB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-0.1％冰醋酸水溶液(体积比为88:12)为流动相,检测波长为215 nm,流速为1 mL/min,柱温为30℃;科罗索酸在0.042 6～0.852 0 mg/mL范围内,峰面积与浓度有着良好的线性关系,平均回收率为105％,相对标准偏差(RSD)为1.75％(n=5).该提取方法简便、安全、无有机物残留,适合于工业生产;测定方法准确、重复性好,可用于沙棘叶提取物的含量测定和质量控制.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2016(044)001【总页数】4页(P30-32,35)【关键词】沙棘叶;HPLC;科罗索酸【作者】张璐;田晓东;王斌;张琼姝;张吉科;郭海利;张小民【作者单位】山西大学生命科学学院,山西太原030006;山西大学生命科学学院,山西太原030006;山西大学生命科学学院,山西太原030006;山西大学生命科学学院,山西太原030006;山西金科海生物科技有限公司,山西太原030006;山西金科海生物科技有限公司,山西太原030006;山西大学生命科学学院,山西太原030006【正文语种】中文【中图分类】R284.2沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名醋溜、酸刺、黑刺，属于胡颓子科（Eleaeagnaceae）酸刺属，是世界上公认的珍贵药食同源植物。

其含有428种营养物质，被誉为血管的清道夫、心脑血管的克星等。

目前，大多研究集中在对沙棘果实的研究利用上，用果实加工成的饮料、食品、保健品、药品也越来越多[1]。

第1篇一、实验目的本研究旨在探讨沙棘提取物对血糖水平的影响，评估其作为潜在降糖成分的潜力。

通过对比实验，观察沙棘提取物对正常血糖和糖尿病模型动物血糖水平的影响，为沙棘在糖尿病防治中的应用提供科学依据。

二、实验原理沙棘中含有丰富的生物活性成分，如维生素C、维生素E、黄酮类化合物等，这些成分具有抗氧化、抗炎、降血糖等作用。

本研究采用体外细胞实验和动物实验相结合的方法，探讨沙棘提取物对血糖水平的影响。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 沙棘提取物：购自某生物科技公司，经鉴定为优质沙棘提取物。

- 细胞：小鼠胰岛β细胞系（INS-1）。

- 小鼠：清洁级C57BL/6小鼠，雄性，体重18-22g。

2. 实验仪器：- CO2培养箱：Thermo Fisher Scientific。

- 酶标仪：BioTek Instruments。

- 血糖仪：Accu-Chek。

- 显微镜：Leica Microsystems。

四、实验方法1. 细胞实验：- 将INS-1细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

- 将沙棘提取物用DMEM培养基稀释至所需浓度，分别加入细胞培养液中，设对照组和实验组。

- 培养一定时间后，收集细胞，用血糖仪检测细胞培养液中的葡萄糖浓度，计算细胞葡萄糖利用率。

2. 动物实验：- 将小鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组和沙棘提取物组。

- 糖尿病模型组：采用高糖高脂饲料喂养，并注射链脲佐菌素（STZ）建立糖尿病模型。

- 沙棘提取物组：在糖尿病模型组的基础上，给予沙棘提取物灌胃。

- 正常对照组：给予普通饲料喂养。

- 在实验过程中，定期检测各组小鼠的血糖水平，并观察小鼠的体态、饮食、活动等状况。

五、实验结果1. 细胞实验结果：- 与对照组相比，沙棘提取物处理组细胞葡萄糖利用率显著提高（P<0.05），表明沙棘提取物具有促进胰岛素分泌和降血糖作用。

2. 动物实验结果：- 与糖尿病模型组相比，沙棘提取物组小鼠血糖水平显著降低（P<0.05），且小鼠体态、饮食、活动等状况明显改善，表明沙棘提取物具有降血糖作用。

枇杷叶中科罗索酸的分离纯化及降血糖活性研究近年来糖尿病患病率持断上升,从天然产物中提取高效又无毒副作用的降血糖功能成分,成为糖尿病研究的热门话题。

枇杷叶是我国常用传统中药,科罗索酸属于枇杷叶中主要的功能成分——三萜酸类物化合物。

本论文以枇杷叶为原料,建立高效液相色谱法测定科罗索酸含量的方法,优化科罗索酸的提取、分离纯化工艺,并研究其降血糖作用。

主要研究结果如下:1.建立了高效液相色谱法快速测定枇杷叶中科罗索酸含量的新方法。

样品通过HPLC在Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)上分离,以甲醇-1%醋酸水(体积比为92:8)作为流动相,流速为1.0 m L/min,柱温30℃,在波长210 nm处检测。

结果表明:科罗索酸标准品的线性回归方程为:y=3.78×106x-6227.14,R2=0.9991,在0.0125-0.4 mg/m L的科罗索酸浓度范围内,响应峰面积与浓度有良好的线性关系,平均加标回收率为99.67%。

2.研究比较了不同提取方法提取科罗索酸的最佳工艺:采用超声辅助提取法,按料液比1:20(g/mL)加入90%乙醇溶液,在50℃下超声提取30 min得率最高,为0.68%;采用微波辅助提取法,按料液比1:10(g/mL)加入90%乙醇溶液,在微波功率200 W条件下提取4 min得率最高,为0.52%。

最优提取条件下,超声提取得率比微波提取得率高30.77%,而微波提取能节约提取时间87%,节约50%提取溶剂。

3.联合采取大孔吸附树脂富集纯化、硅胶柱层析和重结晶的方法对粗提物进一步分离纯化。

大孔树脂分离纯化工艺条件为:最佳大孔吸附树脂为HZ802,粗提物上样质量浓度8 mg/mL,上样流速2 BV/h,上样体积3 BV;洗脱剂为90%乙醇,洗脱流速2 BV/h,洗脱剂用量2.5 BV,由此得到的科罗索酸纯度为34.12%;硅胶柱层析工艺条件为:干法上样量为:样品:硅胶(1:50),洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯(2:1,v/v),最终得到的科罗索酸纯度为53.28%;分离样品用90%乙醇重结晶精制,得到科罗索酸纯度为96.43%。

沙棘叶三萜酸粗提物降血糖活性实验研究本研究以沙棘叶为原料,对其三萜酸成分进行浓缩提取,探讨沙棘叶三萜酸粗提物的抗糖尿病作用。

采用高糖高脂饲料配合四氧嘧啶腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型,预防性的给予沙棘叶三萜酸粗提物进行干预,观察沙棘叶三萜酸粗提物对2型糖尿病大鼠模型的防治作用,为糖尿病的治疗提供实验依据以及沙棘降糖保健品的开发与工业化生产奠定理论基础。

试验中,采用水煮-低醇除杂-乙醇浸提一系列步骤得到沙棘叶三萜酸粗提物,以科罗索酸含量为检测指标,通过高效液相色谱法(HPLC)测定其含量。

之后建立2型糖尿病大鼠模型,同时给予低、中、高三个剂量的沙棘叶三萜酸粗提物,连续喂养33天。

试验结束后,观察饲养过程中大鼠体重变化,最终的空腹血糖和糖耐量、血脂情况及血清胰岛素、C肽的变化。

试验第7、14、28、32天,大鼠尾部取血涂片,W-G 混染拍照,统计大鼠各种白细胞的比例及观察血细胞的形态变化。

结果显示:沙棘叶三萜酸粗提物科罗索酸含量为2.14%。

沙棘叶三萜酸粗提物高剂量组可以缓解大鼠体重下降。

粗提物中、高剂量组均可降低大鼠空腹血糖、改善糖耐量及胰岛素抵抗。

调节血脂方面,粗提物中、高剂量组对大鼠甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HPL-C)含量的改善均有统计学意义。

中剂量组还明显改善了大鼠胆固醇(TC)含量。

中、高剂量组对低密度脂蛋白(LDL-C)含量也有所改善,但改善效果不明显。

在血细胞观察与统计中,粗提物中、高剂量组明显改善了中性粒细胞、淋巴细胞所占百分比,降低了中性粒细胞/淋巴细胞的比值。

中、高剂量组均能改善中性粒细胞轮廓模糊,分叶增多及淋巴细胞和单核细胞结构变形、受损、物质异常。

功能模型试验认为沙棘叶三萜酸粗提物可以调控糖尿病大鼠糖、脂代谢,有效改善胰岛素抵抗及高糖环境下的慢性炎症状态。

推测沙棘叶三萜酸粗提物对2型糖尿病的改善可能与胰岛细胞的保护及免疫力的提高有一定的关系。

此外建立HPLC测定沙棘叶粗提物科罗索酸含量,准确度高、一致性好,适用于沙棘叶粗提物的含量测定和质量控制。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101274953A [43]公开日2008年10月1日[21]申请号200810071064.5[22]申请日2008.05.19[21]申请号200810071064.5[71]申请人福州大学地址350002福建省福州市工业路523号[72]发明人陈剑锋 [74]专利代理机构福州元创专利代理有限公司代理人蔡学俊[51]Int.CI.C07J 63/00 (2006.01)A61K 31/56 (2006.01)A61P 31/12 (2006.01)A61P 11/00 (2006.01)A61P 29/00 (2006.01)A61P 3/10 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 6 页[54]发明名称从植物中提制科罗索酸的方法[57]摘要本发明提供一种从植物中提制科罗索酸(corosolic acid)的方法，包括水溶性物质的水煮除杂、总三萜酸的碱性有机溶剂提取和科罗索酸的大孔吸附树脂富集纯化步骤。

以含有科罗索酸的植物为原料，纯水煮沸去除水溶性物质；滤渣采用碱性的30～60％乙醇或甲醇水溶液提取总三萜酸、在pH 4.5～7.5条件下沉淀分离制得总三萜酸粗品；总三萜酸粗品经85～100％乙醇或甲醇充分溶解并去除不溶物，滤液经大孔吸附树脂的吸附与洗脱，调整科罗索酸洗脱液中乙醇或甲醇终浓度≤50％和pH值≤7.0，在此条件下沉淀分离制得科罗索酸。

本发明制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产、生产成本低，具有较大推广性。

200810071064.5权 利 要 求 书第1/1页1.一种从植物中提制科罗索酸的方法，其特征在于：以含有科罗索酸的植物为原料，采用5～10倍植物干重的纯水或自来水煮沸2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经真空浓缩成浸膏；滤渣加入5～10倍植物干重的30～60％乙醇或甲醇水溶液，加入溶液重量的0.5～1.0％的NaOH或KOH调节溶液pH值，于30～48℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液调节pH值至4.5～7.5静置陈化，固液分离，沉淀物即为总三萜酸粗品；于50～75℃条件下，用不低于3倍重量的85～100％乙醇或甲醇水溶液充分溶解总三萜酸粗品，固液分离去除不溶物，调整滤液体系中科罗索酸终浓度达到0.5～2.5g/L、乙醇或甲醇终浓度为30～40％、NaOH或KOH终浓度为0.2～0.5％后，滤液经大孔吸附树脂吸附科罗索酸至饱和，先用不少于3倍树脂重量的纯水或自来水洗去未被吸附的总三萜酸残留料液和不少于2倍树脂重量的40～50％乙醇或甲醇水溶液洗去吸附力较科罗索酸弱的杂质，再用不少于3倍树脂重量的60～70％乙醇或甲醇水溶液，在中性条件下以0.5～1.5倍树脂重量/小时的流速洗脱科罗索酸，调整洗脱液体系中乙醇或甲醇终浓度≤50％和pH值≤7.0，缓慢冷却至开始析出科罗索酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、固液分离沉淀物即为科罗索酸。

神奇的沙棘叶茶降血压、降血脂、降血糖等功效“不喝【沙棘茶】你永远不知道便秘可以不用做灌肠……不喝【沙棘茶】你永远不知道子宫肌瘤可以不用割……不喝【沙棘茶】你永远不知道宫颈糜烂可以不用烧……不喝【沙棘茶】你永远不知道尿频尿急可以不吃药……不喝【沙棘茶】你永远不知道肾结石可以不动手术……不喝【沙棘茶】你永远不知道痛经可以不用吃药……关爱每一位有缘人，沙棘茶，你一辈子都可以喝的美容养生茶。

”最近这个段子火了！沙棘茶，一般指的是用沙棘嫩叶精制而成的保健代茶。

要想全面了解沙棘茶，我们得追本溯源先去探究沙棘叶的秘密。

丰富的黄酮类化合物沙棘叶主要含有黄酮类、粗纤维、多糖类、氨基酸、维生素、微量元素、胡萝卜素、蛋白质、有机酸、叶绿素等营养及活性成分。

其中平均每100克沙棘叶中，总黄酮含量可达1120毫克！药理研究证明，沙棘叶中的黄酮类化合物可以双向调节血压、血脂；改善血液循环；增强血管弹性，对心血管疾病有特别显著的保健作用！多种对人体有益的氨基酸沙棘叶中氨基酸有20多种，包括人体不能自身合成的8种必需氨基酸，其中用于肝昏迷抢救药物的精氨酸、用于治疗十二指肠溃疡的组氨酸，在沙棘叶中都含量丰富。

有益的维生素和微量元素沙棘叶与日常食用果蔬中维生素C作对比，发现沙棘叶中维生素C含量高于白菜4倍，是芹菜5倍，番茄7倍，西瓜28倍。

另外通过分析发现沙棘叶中的维生素E、胡萝卜素及类胡萝卜素、微量元素、钙、铁、锌、酮、硒等含量也相当高。

用沙棘嫩叶经科学加工制成的沙棘叶茶具有三清三降三抗的功效。

三清：清肠道、清血液、清泌尿。

三降：降血压、降血脂、降血糖。

三抗：抗肿瘤、抗衰老、抗氧化。

究竟有多神奇？我们以沙棘茶排毒的功效做个实验：1.碘伏强氧化物加入大米，大米变成黑色，模仿排便不畅毒素累积的身体，吃进去正常食物变成毒物参与消化吸收，毒素反复吸收，对人体造成严重损伤。

2.把碘伏倒掉，往黑色大米里倒入沙棘茶水。

3.大米变回白色。

因沙棘茶所含营养活性物质丰富，所以市场上的沙棘叶茶产品也非常的丰富。

沙棘叶科罗索酸浓缩物的毒理学和人群试验随着人民生活水平的提高以及生活方式的改变,越来越多的人饮食无规律以及缺乏运动,导致每天摄入到体内的能量无法及时排出体外,长时间就会引起机体血脂和血糖升高。

近年来,每年我国糖尿病患病率逐渐升高,被列为三大疾病之一。

沙棘里含有大量的生物活性物质且具有较强的保健功效,因此也被称为“神果”。

科罗索酸,一种三萜类化合物,已经被证明具有降血糖降血脂作用,而实验室先前已从沙棘叶中提取到科罗索酸物质,为了证明沙棘叶中科罗索酸有无毒性以及对人是否有降血糖作用,本研究按照食品安全性毒理学评价程序和方法对沙棘叶科罗索酸浓缩物进行了小鼠急性经口毒性试验,小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验;同时以实验室现有的沙棘叶科罗索酸浓缩物为主要成分制作缓释胶囊,供于Ⅱ型糖尿病患者,使其按照一日三次一次四粒方法食用,分别检测试食前、试食一个月以及试食两个月后的空腹血糖含量、糖化血红蛋白、血清胆固醇、血清甘油三酯、空腹C肽释放量和空腹胰岛素释放量六项指标以及观察血细胞形态和结构的变化。

主要实验结果如下:1、小鼠急性经口毒性试验结果表明,沙棘叶浓缩物对雌雄小鼠经口最大耐受剂量(MTD)均大于15g/kg·bw,为无毒级物质;Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验表明该检品对机体未造成突变;小鼠30 d喂养试验表明该小鼠的体重、进食和食物利用率不会受到该受试物明显的影响。

2、沙棘叶科罗索酸浓缩物受试物人体试食实验结果显示,与试食前相比,受试人体空腹血糖含量、糖化血红蛋白、胆固醇与血清甘油三酯四项指标均表现不同程度的下降,而空腹C肽释放量和空腹胰岛素释放量出现了小幅度的升高。

3、通过血细胞形态的观察发现,与试食前相比,试食后红细胞由彼此粘附状态恢复至正常红细胞状态,中性粒细胞轮廓模糊,分叶增多及淋巴细胞和单核细胞结构变形、受损等现象也有所改变。

综上,实验结果表明沙棘叶科罗索酸浓缩物无毒性且初步证明该受试物对人体有降血糖作用。