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流式细胞术检测单增李斯特菌与酿酒酵母黄生权1，付萌1，唐青涛1，黄韵2，胡双芳2，余以刚2，肖性龙2（1.无限极（中国）有限公司，广东江门 529156）（2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）摘要：为探讨流式细胞术对单增李斯特菌和酿酒酵母的活菌与热灭活菌的检出效果，本文采用荧光染色试剂SYTO-9和碘化乙锭（PI）对单增李斯特菌和酿酒酵母的活菌与热灭活菌的细胞悬液进行染色，采用流式细胞仪同时测量红色荧光与绿色荧光从而得出细胞悬液中的细菌和酵母的含量。
结果表明经核酸荧光染料染色后，再结合流式细胞术对细菌与酵母菌进行检测，步骤简单、耗时短。
该法不仅简化了测量步骤且分辨率高，对单增李斯特菌和酿酒酵母均具有良好的检出结果，能分辨同一体系中同一菌种的活细胞与热灭活细胞和同一体系中的细菌与酵母活细胞；该法检出限低，将单增李斯特菌稀释后，最低检出限可达1.2×104 cells/mL，将酿酒酵母稀释后，最低检出限可达6×103 cells/mL，因此能大大缩短增菌时间或者避免繁复的增菌步骤。
关键词：流式细胞术；荧光；李斯特菌；酿酒酵母文章篇号：1673-9078(2014)3-195-200Detection of Saccharomyces cerevisiae and Listeria monoeytogenes byFlow CytometryHUANG Sheng-quan1, FU Meng1, TANG Qing-tao1, HUANG Yun2, HU Shuang-fang2, YU Yi-gang2,XIAO Xing-long 2(1.Infinitus (China) Co. Ltd., Jiangmen 529156, China)(2.College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)Abstract: The viable and heat-treated microorganisms such as Listeria monocytogenes and Saccharomyces cerevisiae were investigated in this study. They were stained by fluorescent staining reagents SYTO-9 and Propidium Iodide (PI) and then the red and green fluorescence signals were detected using flow cytometry to get the concentration of cells in samples. The results showed that flow cytometry was able to detect bacteria and yeast after the nucleic acid fluorescent staining. This method simplified the procedure for L. monocytogenes and S. cerevisiae detection, shortened the time of detection procedures, and also distinguished viable with heat-treated micrograms and viable bacteria with yeast in the same system. This method was capable of detecting as few as 1.2×104 cells/mL L. monocytogenes and 6 × 103 cells/mL S. cerevisiae. This improvement might shorten the time consuming of culture enrichment or simplify the process.Key words:flow cytometry; fluorescent; Listeria; Saccharomyces cerevisiae由于保健品原料中污染的微生物往往含量很低，或在加工过程中受到损伤活性低，给快速检测带来许多困难，由此造成的漏检给保健品生产企业带来重大的经济损失与资源浪费[1]。
单增李斯特菌的快速检测方法研究进展
栾晓宁
【期刊名称】《山东畜牧兽医》
【年(卷),期】2024(45)4
【摘要】单核细胞增生性李斯特菌(简称单增李斯特菌),是一种常见的人畜共患食
源性致病菌。
该菌广泛存在于自然界中,污染的食品严重威胁人类的健康,对其快速
有效地检测是预防该病的重要手段。
本文综述近几年单增李斯特菌的研究现状,并
对其快速检测技术的研究予以分析,以期为该菌快速检测技术研究提供参考与借鉴。
【总页数】3页(P81-83)
【作者】栾晓宁
【作者单位】山东畜牧兽医职业学院
【正文语种】中文
【中图分类】S852.61
【相关文献】
1.单增李斯特菌的快速检测方法研究进展
2.建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌
3.食品中单增李斯特菌快速检测技术研究进展
4.肽核酸荧光原位杂交技
术快速检测食品中的李斯特菌属及单增李斯特菌5.基于荧光探针重组酶介导等温
扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立
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单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定
李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，是一种常见的细菌性食物中毒病原体。
单核细胞增生组织均为生化鉴定的一种常见方法。
以下是李斯特氏菌生化鉴定的一些特征：
1. 嗜冷性：李斯特氏菌生长适宜温度为2-45℃，菌株能够在4℃下生长，并在冷藏食品中繁殖。
2. β-溶血素产生：李斯特氏菌能够产生β-溶血素，可以通过血琼脂（Blood agar）培养基上的溶血环进行观察。
3. 乳酸发酵：李斯特氏菌是一种革兰氏阳性乳酸菌，能够进行乳酸发酵。
可以使用乳糖发酵基质（Lactose fermentation medium）进行鉴定，如果产生乳酸则为阳性。
4. 半胱氨酸脱羧：李斯特氏菌具有半胱氨酸脱羧酶活性，可以将半胱氨酸转化为硫代氨基酸。
可使用兰氏差异培养基（LDC medium）进行鉴定。
5. 半乳糖酶活性：李斯特氏菌具有半乳糖酶活性，可以将乳糖转化为半乳糖。
可使用半乳糖发酵基质（Rhamnose fermentation medium）进行鉴定。
此外，李斯特氏菌还可以进行PCR扩增目标基因进行鉴定，
如16S rRNA基因、Internal Transcribed Spacer（ITS）区域等。
需要指出的是，单纯进行生化鉴定可能存在一定的误判率，结合其他检测方法可以提高鉴定的准确性。
此外，由于李斯特氏菌在环境中广泛存在，饮食中也常常带菌，所以对于临床病例的确诊还需要结合患者的临床表现、流行病学调查等综合分析。
单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。
该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。
李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。
检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。
1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。
培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。
在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。
培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。
2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。
这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。
通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。
3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。
这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。
这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。
需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。
常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。
对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。
流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展一、流式细胞术在食品微生物检测中的优势流式细胞术是一种基于流式细胞仪的光学技术，能够快速获取微生物样品中细胞数量、大小、形状和生理状态等信息，具有毫秒级的分辨率、高通量和多参数检测能力。
相比传统的微生物检测方法，如平板计数法、PCR法和传统细菌培养等，流式细胞术具有以下几点优势：高通量和高度自动化的特点使其能够快速分析大量样品，提高检测效率；流式细胞术能够实现对微生物数量和生理状态的快速、准确检测，能够快速识别食品中的致病菌和污染微生物；流式细胞术还具有高灵敏度和低检测限，能够检测到极低浓度的微生物，有助于实现对微生物的早期预警和控制。
流式细胞术在食品微生物检测中具有明显的优势，受到了广泛的关注和应用。
近年来，国内外学术界和食品工业界开展了大量针对流式细胞术在食品微生物检测中的应用研究，取得了一系列重要成果。
一是在快速检测致病菌方面，研究人员利用流式细胞术结合荧光标记技术，能够在几小时内，通过快速筛选和鉴定对食品安全具有威胁的致病菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等，为食品安全提供了有力的技术支持。
在食品卫生监测领域，流式细胞术也被广泛应用于饮用水、食品表面和生产设施等方面的微生物监测，为及时发现和控制微生物污染提供了科学依据。
流式细胞术还可以实现对食品中益生菌和发酵菌等有益微生物的快速检测和分析，有助于提高食品品质和营养价值。
流式细胞术在食品微生物检测中的应用也不断向多参数、高通量和在线监测等方向发展，进一步扩展了其应用范围和检测能力，为食品安全和质量控制提供了更多的技术手段和支持。
尽管流式细胞术在食品微生物检测领域取得了一系列的进展，但仍然面临着一些挑战。
流式细胞术在食品样品的前处理、细胞膜透过性和荧光标记等方面还存在一定的技术难题，需要进一步深入研究和解决。
流式细胞术在食品微生物检测中需要获得更高的灵敏度和准确性，以满足对微生物快速、准确检测的需求。
流式细胞术在食品微生物检测中的应用还需要建立一套全面的标准化和规范化体系，以确保检测结果的真实可靠性，并为商业化应用提供技术支持。
流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展流式细胞术是一种用于快速检测微生物数量和活性的方法，在食品微生物检测领域具有重要的应用价值。
本文将介绍流式细胞术在食品微生物检测领域的研究进展。
流式细胞术是一种基于细胞荧光标记和流式细胞仪分析原理的技术，可以实现对微生物数量和活性的准确测定。
在食品微生物检测领域，流式细胞术可以应用于食品中各类微生物的检测和鉴定，如细菌、真菌和酵母等。
与传统的培养方法相比，流式细胞术具有快速、准确和高通量的特点，不受细菌繁殖速度的限制，并可以对细胞数量和活性进行准确测定，从而提高食品微生物检测的效率和精确性。
近年来，研究人员对流式细胞术在食品微生物检测领域的应用进行了广泛的研究。
一方面，他们开发了各类特异性荧光标记物，用于对不同种类的微生物进行检测。
利用特异性的荧光标记物可以对不同种类的细菌进行快速检测和鉴定，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等。
研究人员还研究了流式细胞仪的适应性，以提高对食品样品中微生物数量和活性的测定能力。
他们对食品样品进行前处理，如纯化和浓缩，以提高微生物的检测灵敏度和准确性。
研究人员还开发了多通道的流式细胞仪，可以同时检测多种微生物，从而提高食品微生物检测的高通量能力。
除了应用于微生物的数量和活性测定外，流式细胞术还可以用于微生物的生物学特性研究。
研究人员可以利用流式细胞术对微生物的耐受性、适应性和遗传性进行研究。
通过对微生物在不同环境下的表型变化进行监测，可以揭示微生物的生物学特性及其对食品质量和安全的影响，为食品微生物防控提供理论支持和实践指导。
流式细胞术在食品微生物检测领域还存在一些挑战和问题。
食品样品复杂多样，其中可能含有大量的背景噪声和干扰物质，如食品成分和色素等。
如何降低这些干扰物质对流式细胞术的影响是一个亟待解决的问题。
流式细胞仪需要高精度的参数调节和校准，以保证测量结果的准确性和可靠性。
如何提高流式细胞仪的操作简便性和稳定性也是一个需要解决的问题。
食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的探讨张慧珍（谱尼测试集团股份有限公司，北京 100194）摘 要：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病的病原菌，是一种常见的土壤细菌，能引起严重食物中毒，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。
单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全具有一定的威胁，该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。
本文通过采用国家标准检测方法《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）对大量肉、奶、蛋和水产品等产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测，总结了一些食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测经验，主要从试剂准备、增菌、划线分离及生化鉴定等方面阐述了对单核细胞增生李斯特检测的一些理解，以期为食品检测工作中单核细胞增生李斯特氏菌的检测提供部分参考。
关键词：食品；单核细胞增生李斯特氏菌；国标检测方法Discussion on Detection Method of Listeria monocytogenes in FoodZHANG Huizhen(Pony Testing Group International Co., Ltd., Beijing 100194, China) Abstract:Listeria monocytogenes is a zoonotic pathogen. It is a common soil bacterium that can cause serious food poisoning. After infection, it is mainly manifested in sepsis, meningitis and mononucleosis. It exists widely exists in nature. Listeria monocytogenes in food is dangerous to human safety. The bacteria can still grow and reproduce in the environment of 4 ℃, and it is one of the main pathogenic bacteria that threaten human health in refrigerated food. By using the national standard detection method GB 4789.30—2016 to detect Listeria monocytogenes in a large number of meat, milk, eggs and aquatic products, this paper summarizes the detection experience of Listeria monocytogenes in some foods, and expounds some understandings of Listeria monocytogenes detection mainly from the aspects of reagent preparation, enrichment, lineation separation and biochemical identification, in order to provide some reference for the detection of Listeria monocytogenes in food testing.Keywords: food; Listeria monocytogenes; national standard detection method李斯特氏菌属隶属革兰氏阳性细菌中厚壁菌门，李斯特氏菌属可划分为6个菌种，即单核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威尔斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。
流式细胞术检测单增李斯特菌与酿酒酵母黄生权1，付萌1，唐青涛1，黄韵2，胡双芳2，余以刚2，肖性龙2（1.无限极（中国）有限公司，广东江门 529156）（2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）摘要：为探讨流式细胞术对单增李斯特菌和酿酒酵母的活菌与热灭活菌的检出效果，本文采用荧光染色试剂SYTO-9和碘化乙锭（PI ）对单增李斯特菌和酿酒酵母的活菌与热灭活菌的细胞悬液进行染色，采用流式细胞仪同时测量红色荧光与绿色荧光从而得出细胞悬液中的细菌和酵母的含量。
结果表明经核酸荧光染料染色后，再结合流式细胞术对细菌与酵母菌进行检测，步骤简单、耗时短。
该法不仅简化了测量步骤且分辨率高，对单增李斯特菌和酿酒酵母均具有良好的检出结果，能分辨同一体系中同一菌种的活细胞与热灭活细胞和同一体系中的细菌与酵母活细胞；该法检出限低，将单增李斯特菌稀释后，最低检出限可达1.2×104 cells/mL ，将酿酒酵母稀释后，最低检出限可达6×103 Cells/mL ，因此能大大缩短增菌时间或者避免繁复的增菌步骤。
关键词：流式细胞术；荧光；李斯特菌；酿酒酵母 文章篇号：1673-9078(2014)3-195-200Detection of Saccharomyces cerevisiae and Listeria monoeytogenes byFlow CytometryHUANG Sheng-quan 1, FU Meng 1, TANG Qing-tao 1, HUANG Yun 2, HU Shuang-fang 2, YU Yi-gang 2,XIAO Xing-long 2(1.Infinitus (China) Co. Ltd., Jiangmen 529156, China)(2.College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)Abstract: The viable and heat-treated microorganisms such as Listeria monocytogenes and Saccharomyces cerevisiae were investigated in this study. They were stained by fluorescent staining reagents SYTO-9 and Propidium Iodide (PI) and then the red and green fluorescence signals were detected using flow cytometry to get the concentration of cells in samples. The results showed that flow cytometry was able to detect bacteria and yeast after the nucleic acid fluorescent staining. This method simplified the procedure for L. monocytogenes and S. cerevisiae detection, shortened the time of detection procedures, and also distinguished viable with heat-treated micrograms and viable bacteria with yeast in the same system. This method was capable of detecting as few as 1.2×104 cells/mL L. monocytogenes and 6 × 103 cells/mL S. cerevisiae. This improvement might shorten the time consuming of culture enrichment or simplify the process.Key words: flow cytometry; fluorescent; Listeria ; Saccharomyces cerevisiae由于保健品原料中污染的微生物往往含量很低，或在加工过程中受到损伤活性低，给快速检测带来许多困难，由此造成的漏检给保健品生产企业带来重大的经济损失与资源浪费[1]。
如何快速准确的检出保健品原料中的腐败菌与致病菌是目前研究的热点之一。
传统方法存在灵敏度不高、检测周期长、步骤繁琐等195收稿日期：2013-11-14基金项目：国家自然科学基金青年科学基金资助项目(31101279); 教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题（20110172120034）; 华南理工大学中央高校基本科研业务费重点项目(2013ZZ068)作者简介：黄生权（1977-），男，博士，高级工程师，主要研究方向：食品工程、食品营养与安全通讯作者：肖性龙（1977-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：食品安全与检测缺点[2]已经不适应现代检测的快速灵敏、准确高效等需求。
然而新型检测方法如基于免疫技术的检测方法和以DNA 杂交为基础的探针、芯片等检测方法，虽特异性高但一般需要进行繁复的增菌培养[3]；以DNA 扩增技术为基础的PCR 、多重PCR 和RT-PCR 等检测方法，在核酸抽提与PCR 扩增过程中容易偏差，降低了精确度[4]。
流式细胞术（Flow Cytometry ，FCM ）检出限低能避免繁复的增菌步骤和繁琐的核酸提取过程，目前在血液学、病理学、临床检验等领域得到广泛应用[5]，但将其应用于食品中食源性致病菌快速检测的研究还比较少。
Herve Alexandre 等采用已知荧光标记的单链核酸特异性探针结合FCM 技术对酒香酵母（Brettanomyces ）浓度进行实时监控，能在葡萄酒腐败变质前有效控制腐败酵母菌数[6]。
王宁等对生乳进行热处理，经荧光染料碘化丙锭染色后用FCM能快速检测生乳中热损伤的 E.coli和S.aureus [7]。
Malacrino等用FCM结合荧光染色的方法对葡萄酒中酵母菌进行检测，计数结果与平板计数法相关性高，对酵母最低检出限达103[8]。
上述研究表明FCM对复杂的食品样品中的目标菌和热损伤菌具有良好的检出效果，且具有检出限低的优势，适应于保健品原料中微生物污染的检测要求。
保健品原料中常见的腐败菌和致病菌包括酵母菌与细菌，但FCM能否同时对酵母与细菌进行检测，对其热损伤菌能否检出尚未见报道。
本实验中采用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）广泛存在于食品中的腐败酵母菌[9]；单增李斯特菌（Listeria monoeytogenes）是食源性致病菌，被WHO列为食品四大致病菌之一[10]。
本文采用FCM技术鉴别同一体系中的酿酒酵母与单增李斯特菌，活菌与热损伤菌，同时测得其含量。
探讨利用流式细胞仪快速检测保健品原料中可能出现的食源性致病菌和腐败菌的可行性，克服其他快速检测方法的不足。
1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 菌株与培养基实验中所用菌种分别为Listeria monoeytogenes (CMCC34761)、Saccharomyces cerevisiae (A TCC9763)，均为华南理工大学食品安全与检测中心保藏菌种。
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，调pH至7.0，固体培养基加入15 g/L琼脂粉，121 ℃，20 min高压灭菌后使用。
YPD（Y east Extract Peptone Dextrose）液体培养基：蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L、葡萄糖20 g/L，固体培养基加入15 g/L琼脂粉，121 ℃，20 min高压灭菌后使用。
1.1.2 主要试剂SYTO-9和PI，购自美国Invitrogen公司。
1.2 主要仪器FA2004B电子天平，雷磁PHS-3Cx型pH计，购自上海精密仪器科学有限公司；YXQ-LS-18S1高压灭菌锅、SPX-250B生化培养箱，购自上海博讯实业有限公司；QL-866旋涡振荡仪，购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；Guava EasyCyte 6-2L流式细胞仪，购自美国默克生物技术有限公司。
1.3 实验方法1.3.1 菌株活化用接种环沾取甘油管保存的L. monoeytogenes菌液，在LB固体培养基上划线，于37 ℃培养24 h。
挑取单菌落接种于LB液体培养基，37 ℃培养至对数生长期(OD600≈1.0)制成活化的种子液[11]。
用接种环沾取甘油管保存的S. cerevisiae菌液，在YPD固体培养基上划线，于30 ℃培养48 h。
挑取单菌落接种于YPD 液体培养基，30 ℃培养至对数生长期(OD600≈2.0)制成活化的种子液[12]。
1.3.2 细胞悬液制备将制好的种子液，摇匀后取1 mL于1.5 mL离心管中，此为活菌培养液。
热灭活菌的制备参考Soejima等[13]的研究方法。
吸取1 mL处于对数期的细菌培养液于1.5 mL离心管中，在沸水浴中处理50 s后立即置于冰上冷却，吸取100 μL涂布于LB固体培养基，37 ℃培养72 h后未有菌落长出。
通过该处理，使细胞壁与细胞膜有不同程度损伤，达到病菌受损的目的。
通过上述操作，则制成热灭活菌培养液。
混合菌培养液为活菌培养液与热灭活菌培养液的等体积混合液。
取待测菌液 1 mL(待测菌液中细胞量约为1×106~1×107 cells/mL)，8000 r/min离心2 min，弃上清液，用灭菌去离子水洗涤。
重复上述操作，离心弃上清后将细胞重悬至0.5 mL灭菌去离子水中，用旋涡振荡仪混匀2 min，则制成待测活细胞悬液、热灭活细胞悬液和混合细胞悬液。
1.3.3 平板计数吸取100 μL三个浓度梯度的 L. monoeytogenes 培养液涂布于LB固体培养基，每个梯度做三个平行，37 ℃培养24 h计数；吸取100 μL三个浓度梯度的S. cerevisiae培养液涂布于YPD固体培养基，每个梯度做三个平行30 ℃培养48 h计数。
1.3.4 染色方法实验中使用的染色剂为SYTO-9和PI两种核酸荧光染料。
