单增李斯特菌检测技术2012

单增李斯特氏菌及其检测方法一、单增李斯特氏菌单增李斯特氏菌，学名Listeria monocytogenes，一种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。

李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)、塞氏李斯特菌(L seeligeri)，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi)和莫氏李斯特菌(L mulTayi)。

其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的病原菌。

它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

二、单增李斯特氏菌检测方法1.细菌培养法该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围-1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。

LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。

在血琼脂平板上有β溶血环。

在显色培养基上呈蓝绿色。

2.生化鉴定法该菌主要生化特性如下：①触酶阳性；②氧化酶阴性；③发酵多种糖类；④产酸不产气；⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二塘；⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解；⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性；⑨对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、2.5%石碳酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌。

⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

3.血清凝集法根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1／2a、1／2b、1／2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。

DBS22 DBS22/019—2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施吉林省卫生厅发布前言本标准根据GB/T1。

1—2000《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则》的要求编写.本标准分为两种检测方法：第一法:单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN计数法。

其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。

本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心.本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的定量检验方法.本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。

2 设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2。

1 冰箱：2℃～5℃和—18℃.2.2 恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃.2.3 均质器。

2.4 显微镜:10×～100×.2。

5 电子天平:感量0。

1 g。

2.6 锥形瓶:100 mL、500 mL。

2。

7 无菌吸管:1 mL（具0。

01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.8 无菌平皿:直径90 mm。

2。

9 无菌试管：16 mm×160 mm.。

2。

10 离心管:30 mm×100 mm.2。

11 无菌注射器:1 mL。

2。

12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。

2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。

2。

14 全自动微生物生化鉴定系统。

3 培养基和试剂3。

1 含0。

6％酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE)：见附录A中A。

1.3。

2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。

食品中单核细胞增生李斯特菌检测技术方法进展【中图分类号】R155 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）15-0112-01 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称LM，以下简称单增李斯特菌），广泛存在于自然界，如土壤、污水、青饲料、食品生产加工器具、多种食品。

动物和人体也带有此菌[1]，是一种重要的食源性致病菌。

该菌具有很强的环境适应性，存活温度范围在-1℃～45℃，PH范围为4.0～9.5，耐盐性相当强，Nacl浓度范围为0.5%～10%，所以在食品加工、生产过程中单增李斯特菌很难被杀灭，而且单增李斯特菌在4℃仍能生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一[2][3]。

单核细胞增生李斯特菌中毒严重时可引起人类的败血症、脑膜炎及单核细胞增生等多种疾病，死亡率高达35%～70%[4]，所以对实验室检验人员来说，提高单增李斯特菌的检出率具有重要的现实意义。

食品中单增李斯特菌的检测方法大致分为三类，即分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法。

1 分离培养法是最传统的检测方法，应用国标法，即GB/4789.30—2010作为检测方法，先两次增菌，即LB1增菌液36℃±1℃培养24小时，然后再移取到LB2增菌液36℃±1℃培养18～24小时，对被检样品进行增菌，然后取LB2增菌液划线接种在科玛嘉李斯特菌显色培养基和PALCAM琼脂平板，36℃±1℃培养24～,48小时，然后经初筛鉴定等试验步骤，结果符合生化试验和溶血试验结果进行报告，但该菌革兰氏染色和镜检时要特别加以注意，因为单增李斯特菌在新鲜培养液为G+小杆菌，但在陈旧的培养液中菌体多转为G－,特别是该菌在22℃～25℃环境中能形成4根鞭毛，运动活泼，在32℃环境中仅能形成1根鞭毛，运动缓慢，在36℃培养则无动力，所以容易误判。

虽然该方法实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6～7d，这种传统的检测方法已无法满足食品生产过程中的在线检测、食品上市和消费前的快速检验要求 [5]。

单增李斯特氏菌说明书安全操作及保养规程一、引言单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食品中毒病原菌，可引起人类严重的感染。

为了确保操作过程的安全性和实验结果的准确性，本文档将介绍单增李斯特氏菌的安全操作和保养规程。

二、实验前准备1.工作区域：选择干净整洁、通风良好的实验室，并确保无人员流动和非实验人员进入实验区域。

2.实验器材：准备好需要使用的培养皿、试管、移液器、离心机等实验器具，并进行消毒处理。

3.个人防护措施：穿戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。

三、操作步骤1.培养基准备：根据实验需求，制备适当培养基，并严格按照配方进行配置、混合和消毒。

2.菌株接种：取一支保存有单增李斯特氏菌的细菌种子液，并使用无菌的移液器将其接种到培养基中。

3.培养条件：将接种好的培养基置于恒温培养箱中，以适当的温度和湿度进行培养。

根据具体需要，可以选择不同的培养条件。

4.培养时间：根据菌株的生长特性和实验目的，设定适当的培养时间。

在培养过程中，定期观察培养基的变化情况。

四、实验后处理1.菌株保存：实验结束后，将培养好的菌株进行分装并保存。

使用无菌的容器和保护液，防止菌株失活或变异。

2.器材清洗：实验器材需要彻底清洗，以防止交叉污染。

使用适当的消毒剂和清洁剂，对实验教具进行彻底清洁和消毒处理。

3.工作区清理：清理工作区域，包括实验台面、废弃物和其他杂物的清理。

确保实验室的环境整洁，以减少潜在的污染风险。

五、安全注意事项1.个人防护：在实验操作过程中，要正确佩戴实验服、手套、护目镜等个人防护装备，避免直接接触菌株。

2.实验环境：选择合适的实验环境，保持实验室的通风良好，并避免非实验人员进入实验区域。

3.消毒处理：在实验前后对实验器材、工作区域进行彻底的消毒处理，以减少交叉污染的风险。

4.废弃物处理：将实验中产生的废弃物，如培养基、菌株等，正确处理和清理，并根据实验室的要求进行垃圾分类处理。

单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术研究引言：单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种潜伏在食品中常见的致病菌，能引起严重的食物中毒，威胁着人类的健康与生命安全。

因此，研究和发展一种快速、高效的检测技术对于食品安全至关重要。

本文旨在探讨目前关于单核细胞增生性李斯特菌快速检测技术的研究进展，并为进一步的研究和应用提供参考。

一、单核细胞增生性李斯特菌简介单核细胞增生性李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，能在广泛的温度（0-45℃）和pH（4.4-9.6）范围内生长，且具有金属抗药性。

在食品中，该菌可以通过肉类、蔬菜和奶制品等途径传播，使其成为食品安全的重要隐患之一。

由于该菌对常规的煮沸和加热处理具有一定的抵抗能力，因此需借助有效的检测技术对其进行快速、准确的检测。

二、传统检测方法的局限性目前常用的单核细胞增生性李斯特菌检测方法主要包括传统培养方法、蛋白酶结合效应（ELISA）和分子生物学方法等。

然而，这些方法存在着以下局限性：1. 传统培养方法耗时长，需要较长的培养时间才能获得结果，无法快速检测；2. ELISA方法虽然具有较高的灵敏度和特异性，但其需要复杂的样品处理和实验步骤，使得检测过程繁琐；3. 分子生物学方法虽然能够提供较快的检测结果，但其仪器成本高，技术要求较高，限制了其在实际应用中的推广。

三、快速检测技术的研究进展随着科学技术的发展，研究人员不断探索和开发更为快速、准确的单核细胞增生性李斯特菌检测技术。

以下是几种常见的快速检测技术：1. 荧光定量聚合酶链反应（qPCR）技术：该技术以其高效、精确和快速的特点，被广泛应用于单核细胞增生性李斯特菌的检测。

qPCR技术可以快速扩增和定量样品中的特定基因片段，结合荧光定量技术实现李斯特菌的快速检测和定量。

2. 微生物芯片技术：微生物芯片是基于生物芯片技术的一种新型检测平台，可实现对多种菌种的快速识别和检测。

研究人员通过设计特定的探针，可以在芯片上同时检测多种致病菌，包括单核细胞增生性李斯特菌，提高了检测效率和准确性。

单增李斯特菌的检验方法
一.增菌：
1.EB肉汤
2.LB肉汤（根据我的实验结果和请教其他老师的说法，LB增菌
效果优于EB）
LB分为LB1和LB2，两者基础培养基相同，区别在于添加辅助试剂丫啶黄、萘啶酮酸的量（基础培养基--杭州天河生物试剂公司；丫、萘—上海疾控中心。

上海的辅助试剂已按一定浓度配置成溶液，使用起来比较方便）
25g样品加入到225mlLB1增菌液中，30℃培养24h，吸0.1mlLB1增菌液到LB2增菌液中，30℃培养24h。

二.选择分离
挑一环LB2增菌液划线接种到科玛嘉选择性培养基上，37℃培养24h，观察现象，可疑菌落在此培养基上为兰色，周围有白晕的菌落。

（国标上使用的选择性培养基是MMA，但是其选择性不强，科玛嘉选择性培养基是法国制造，选择性比MMA强的多，而且现象明显，许多发达国家使用。

此培养基是国标编委白萍女士向我推荐的）三.生化实验
挑可疑菌落穿刺接种到SIM，25℃培养3---5d，观察伞状生长情况、TSI（三糖铁）斜面30℃培养24h—48h，观察，单增李斯特菌在TSI上应该是底面、斜面均产酸，不产H2S，不产气的培养物.
这是单增李斯特菌落在SIM动力培养基上的伞状情形再挑取TSI上培养物接种其他生化管。

七叶苷鼠李糖木糖甘露醇尿
素
硝
酸
盐
还
原
VP MR H2O2
++----+++。

单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。

该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。

李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。

检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。

1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。

培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。

在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。

培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。

2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。

这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。

通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。

3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。

这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。

这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。

需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。

常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。

对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。