食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析

乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果与分析樊惠华，侯磊磊，方 莹，柴梅梅（榆林市食品检验检测中心，陕西榆林 719000）摘 要：为了提升食品检验检测机构对食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力，提高微生物实验室外部质量控制水平。

本实验室参加中国检验检疫科学研究院测试评估中心组织的ACAS-PT1108（2021）乳粉中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证，参考参试指导书、《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）、海博单增李斯特氏菌成套生化鉴定管和MicroScan WalkAway 40 Plus全自动微生物生化鉴定仪。

结果表明，参试样品编号21-T031为单核细胞增生李斯特氏菌，样品编号21-U887未检出单核细胞增生李斯特氏菌，经鉴定为伊氏李斯特氏菌，最终能力验证结果评价为满意，可见本实验室具有成熟的单核细胞增生李斯特氏菌检验能力。

关键词：乳粉；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Results and Analysis of the Proficiency Testing of ListeriaMonocytogenes in Milk PowderFAN Huihua, HOU Leilei, FANG Ying, CHAI Meimei(Yulin Food Inspection and Testing Center, Yulin 719000, China)Abstract: In order to improve the ability of food inspection and testing institutions to detect Listeria monocytogenes in food and to improve the external quality control level of microbiology laboratory. The laboratory participated in the proficiency testing of Listeria monocytogenes in ACAS-PT1108 (2021) milk powder organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences. Reference was made to the test guidelines, the GB 4789.30—2016, the complete biochemical identification tubes of Listeria monocytogenes in Haibo and the MicroScan WalkAway 40 Plus automatic microbial biochemical identification instrument. The results showed that the sample number 21-T031 was detected as Listeria monocytogenes, and the sample number 21-U887 was not detected as Listeria monocytogenes, which was identified as Listeria.ivanovii. The final proficiency test results were satisfactory. It can be seen that the laboratory has a mature ability to test Listeria monocytogenes.Keywords: milk powder; Listeria monocytogenes; proficiency test李斯特菌属目前包括17种公认的短杆状革兰氏阳性菌，其中单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌被认为是病原体[1]。

I FOOD INDUSTRY I 75单增李斯特氏菌能力验证结果与分析得出现“假阳性”的结果。

一旦实验室出现“假阳性”“假阴性”“与参考值范围不符”等情况时，实验室的负责人员应该针对整个实验室进行溯源。

从人员、环境、设备、培养基和试剂等各个方面进行详细地追溯和分析，从而纠正不利因素，确保检验结果的科学性和准确性。

我院于2020年5月底参加了由中国食品药品检定研究院组织的“NIFDC-PT-248 食品中单增李斯特氏菌检出能力验证”试验，按照后期返回的结果来看，检验结果为“满意”，现将具体试验情况汇报如下。

1.材料与方法1.1样品实验室共收到2份单增李斯特氏菌样品，样品为白色球状、真空包装于西林瓶，样品编号分别为FC02220011、FC02220030；2袋奶粉样品，每袋重量为25g ，编码与菌球编码对应。

1.2仪器与材料A C 2-6S 1型E S C O 生物安全柜（新加坡艺思高公司）；GR-85致微高压灭菌器（厦门致微公司）；MJ-250-Ⅲ型霉菌培养箱（上海跃进）；HH.B11.600BY 型恒温培养箱（上海跃进）；VITEK2 Compact 30型全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国梅里引言单核细胞增生李斯特氏菌是普遍存在于自然环境中的革兰氏阳性、嗜冷、兼性厌氧细菌。

同时，也是一种食源性的人畜共患病的病原菌，欧美国家曾多次暴发由于食用了受单增李斯特氏菌污染的肉制品、奶制品、蔬菜及水果等而引发的严重的食物中毒事件。

在《GB 29921-2021 食品安全国家标准 食品中致病菌限量》中，对乳制品、肉制品（包括熟肉制品和即食生肉制品）、水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品均有五份样品中均不得检出单增李斯特氏菌（n=5，c=0，m=0）的规定；同样，在2022年3月7日实施的《GB 31607-2021 食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》中“部分或未经热处理散装即食食品”：单核细胞增生李斯特氏菌限量为0/25g （mL ）。

现代食品XIANDAISHIPIN 219/分析检测Analysis and Testing doi:10.16736/41-1434/ts.2021.06.062食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果及分析Validation Results and Analysis of Listeria monocytogenes in food◎ 杨丰旭，曹欢欢，李　爽，孟凡信（朝阳市检验检测认证中心，辽宁　朝阳　122000）YANG Fengxu, CAO Huanhuan, LI Shuang, MENG Fanxin (Chaoyang Inspection, Testing and Certification Center, Chaoyang 122000, China)摘　要：为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，增强实验室竞争力，本实验室参加了大连海关技术中心组织的能力验证，结果表明编号为075和102的样品均检出单核细胞增生李斯特氏菌。

本次能力验证结果评价为满意。

关键词：食品；单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证Abstract：In order to improve the detection ability of Listeria monocytogenes in food and enhance the competitiveness of the laboratory, our laboratory participated in the proficiency test organized by the Dalian Customs Technology Center. The results showed that Listeria monocytogenes were detected both in samples numbered 075 and 102.The results of theproficiency test were evaluated as satisfactory.Keywords：food; Listeria monocytogenes ; proficiency testing中图分类号：R155.5单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ）在自然界分布广泛，是一种细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌，可通过污染食品而引起人、畜单核细胞增多，从而导致脑膜炎、败血症、流产等疾病[1]。

分析检测FAPAS乳粉中单核细胞增生李斯特菌能力验证结果分析与讨论刘　霓（辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳 110000）摘　要：为了提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力，本实验室参加了FAPAS分析实验室能力验证机构组织的实验室能力验证，分别运用国标方法、分子生物学方法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对样品进行检测鉴定。

结果表明，M224d02-A样品检出单核细胞增生李斯特氏菌，M224d02-B样品检出英诺克李斯特菌，属于李斯特氏菌属。

2个样品检验结果均取得满意结果。

关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；FAPAS考核；李斯特菌Analysis and Discussion About the Verification Resultsof Listeria monocytogenes in Milk Powder from FAPASLaboratoryLIU Ni(Liaoning Inspection Examination and Certification Center, Shenyang 110000, China) Abstract: To strengthen the detection power of Listeria monocytogenes in food, our laboratory participated in proficiency testing on Listeria monocytogenes detection in foods which was organized by Food Analysis Performance Assessment Scheme (FAPAS). We used 3 methods for the test, respectively national standard method, molecular biology method and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) method. Listeria monocytogenes were detected in M228d02-A. Listeria innocua belonged to Listeria sp. were detected in M228d02-B. The test results of 2 samples were outstanding grade.Keywords:Listeria monocytogenes; FAPAS proficiency testing; Listeria sp.李斯特菌属（Listeria sp.）是一种革兰氏阳性菌，在自然环境中广泛存在，一般认为它包括单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes，以下简称单增李斯特菌）、英诺克李斯特菌（L.innocua）等多种。

单核增生李斯特氏菌检测概述单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性的致病菌，能够在低温下生存繁殖，并在恶劣环境中形成生物被膜，使其对抗不良条件。

该菌可引起人类的李斯特菌病（Listeriosis），也是一种可以通过食品传播的重要病原体。

李斯特菌病在免疫功能低下的人群中很容易引起严重感染，包括孕妇、老年人、免疫抑制患者和新生儿。

检测单核增生李斯特氏菌的方法主要包括传统的培养方法和现代的分子生物学方法。

1.传统培养方法传统的培养方法是检测单核增生李斯特氏菌的主要方法之一、常用的培养基包括PALCAM（Polymyxin, Acriflavine, Lithium chloride and Cycloheximide）和OXOID Listeria Selective Agar等。

培养温度通常在30-37℃之间，因为单核增生李斯特氏菌可以在低温下生长。

在培养过程中，从食品样品或其他可能受污染的样品中提取菌落，并在培养基上进行培养。

培养时间通常为1-2天，培养过程中需要注意去除其他菌落的干扰。

2.分子生物学方法分子生物学方法是现代检测单核增生李斯特氏菌的常用方法，主要包括聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR等。

这些方法的优势在于其高度敏感性和特异性。

通过检测单核增生李斯特氏菌特有的基因或序列，可以快速准确地鉴定与检测其存在。

3.培养与分子生物学相结合的方法为了更好地检测单核增生李斯特氏菌，有些方法将传统培养与分子生物学相结合。

这种方法通常先进行培养，然后使用PCR或实时荧光定量PCR等技术进行进一步检测和鉴定。

这种方法较为耗时，但能够进一步提高检测的准确性。

需要注意的是，由于单核增生李斯特氏菌能够在低温下生存，因此在食品或样品中的检测非常重要。

常见的食品样品包括生肉、海鲜、冷冻食品、奶制品等。

对于食品企业来说，建立完善的食品安全管理体系和进行规范的监测是防止单核增生李斯特氏菌传播的重要措施。

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法摘要：通过扩增hly 基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR 方法。

该方法具有较强的特异性，35株经传统方法鉴定的菌株PCR 结果均为阳性，而其他三种同属异种菌，包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段。

PCR 方法对Lm 纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl，对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g，牛奶为4CFU/ml。

应用该方法对285 份食品样品检测，17 份样品Lm 呈阳性，结果与常规的分离培养方法完全一致。

该种方法具有敏感、特异、快速及准的优点，可用于食品中L m 的快速检测。

关键词：食品；单核细胞增生性李斯特氏菌；聚合酶链式反应Abstract ：A polymerase chain reaction (PCR) assay targeting the hly gene was developed to detect Listeria monocytogenes.The PCR product was detected in 35 L monocytogenes strains and not in other Listeria spp, including innocua, ivanovii andwelshimer and also not in non-Listeria species, indicating that this method was highly specific for L. monocytogenes. The detectionlimit of the PCR assay was 7.3 CFU/μl o f pure cell culture. The PCR assay could detect4 CFU of L. monocytogenes in thecontaminated pork and vegetable (1g) and milk (1ml). From 285 samples, 17 samples were proved positivefor L. monocytogenesby the PCR method, and the results were quite consisted with those detected by conventional biochemical testing. The PCRassay is highly sensitive, specific, rapid and accurate and can be used for rapid detection of L. monocytogenes in food.Key words：food；Listeria monocytogenes；PCR；detection1引言1.1李斯特氏菌-概况李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测分析石红霞（内蒙古乌兰察布市疾病预防控制中心，内蒙古乌兰察布 012000）摘　要：目的：分析食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测结果，以及时发现食品安全隐患，为食品安全监管提供参考依据。

方法：严格按照《全国食源性致病菌监测工作手册》中的单核细胞增生李斯特氏菌检验标准，对某市2021年1—12月定期采样的10类常用食品进行单核细胞增生李斯特氏菌检测，分析其阳性检出率。

结果：897份10类常用食品中，检出单核细胞增生李斯特氏菌36份，阳性检出率为4.01%，结论：食品中存在单核细胞增生李斯特氏菌污染的风险，其中以凉拌菜及冷藏食品的污染风险最高，应加强该方面的防控，确保食品安全。

关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；食品安全；检测Detection and Analysis of Listeria Monocytogenes in FoodSHI Hongxia(Ulanqab Center for Disease Control and Prevention Inner Mongolia, Ulanqab 012000, China)Abstract: Objective: To analyze the detection results of Listeria monocytogenes in food, find the hidden dangers of food safety in time, and provide reference basis for food safety supervision. Methods: The detection of Listeria monocytogenes in the national manual for the monitoring of foodborne pathogens shall be strictly followed. According to the test standard, 10 kinds of common foods regularly sampled in a city from January to December 2021 were tested for Listeria monocytogenes, and the positive detection rate was analyzed. Conclusion: There is a risk of Listeria monocytogenes contamination in foods, among which cold dishes and refrigerated foods have the highest risk of contamination. Prevention and control in this regard should be strengthened to ensure food safety.Keywords:listeria monocytogenes; food safety; testing单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于土壤、蔬菜、粪便及多数食品中，该病菌对低温环境具有较好的耐受性，在5℃时可大量繁殖，当该病菌进入生物表层后会形成生物膜，并能提高对理化因素的抵抗力，是食源性疾病的主要致病菌之一，可通过粪便或食物进行传播。

食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测食品源单增李斯特菌的分离鉴定及耐药性检测引言：李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种革兰氏阳性杆菌，可以通过食物传播给人类，并引发李斯特菌感染。

李斯特菌感染是一种严重的食物中毒疾病，可能导致严重的并发症甚至死亡。

因此，对食品中的李斯特菌进行分离鉴定及耐药性检测非常重要，以确保食品的安全性。

分离鉴定方法：1. 样本采集：从怀疑被污染的食品中，选择不同部位的样本进行采集，如肉类、奶制品、蔬菜等。

2. 李斯特菌分离：将样本加入到富营养培养基中，在适宜的温度下（37℃），培养16-24小时。

然后将培养液进行测定，寻找典型的李斯特菌菌落。

3. 形态特点观察：通过显微镜观察菌落的形态特征，如形状、颜色等。

4. 生化性质检测：经过形态观察后，选取具有典型形态特征的菌落用于进一步的生化测试，如靶心李斯特菌鉴定板、鲁埃斯鸟氏培养基等。

5. PCR检测：利用李斯特菌特异性基因进行PCR鉴定，以确认是否为李斯特菌。

耐药性检测方法：1. 选择抗生素：选择常见的抗生素，包括头孢呋辛、青霉素、氨基糖苷类药物等，同时也选择一些非常见的抗生素，以探索其耐药性情况。

2. 可兰霉素敏感测试：可通过培养基中加入不同浓度的可兰霉素，观察菌落的生长情况，确定最低抑菌浓度（MIC）。

3. 扩散法：将李斯特菌涂布在富营养培养基上，然后将不同抗生素药片放置在不同区域，观察菌落生长与否。

4. PCR检测：利用PCR方法检测耐药基因的存在情况，进一步确定李斯特菌的耐药性。

讨论：通过以上的分离鉴定及耐药性检测方法，可以有效地检测食品样本中的李斯特菌，并了解其耐药性情况。

应用这些方法，可以及早发现李斯特菌的污染源，并采取相应的措施来控制和预防李斯特菌感染的发生。

此外，这些方法也可为食品监测部门提供参考，加强对食品安全的监管。

结论：李斯特菌是一种严重的食源性病原菌，对人类健康构成潜在威胁。

FDA食品中单增李斯特氏菌的检测与计数方法食品中单增李斯特氏菌的检测与计数李斯特有6种菌种：L.innocua , L.seeligcri , L.welshimeri , L.ivanovii , L.grayi、L.grayi和L.ivanovii含有2个亚种，这里不作明确分析。

Rocourt最新的细菌分类法代替了以前的分类法。

L.ivanovii与单增李斯特氏菌是老鼠和其他动物的致病菌，然而，只有单增李斯特氏菌是人类致病菌，L.ivanoviij与L.seeligeri在人类中很少见。

近来，我们充分讨论了食品中单增李斯特氏菌的存在性，及其传染性详细资料。

因而本篇重点介绍单增李斯特氏菌的鉴定与计数。

食品加工过程中，例如食品接触表面及加工工具的致病原检测就不作介绍了。

分离与检测单增李斯特氏菌快速有效的方法如下：以污染的食品为样品，通常据FDA实验规则，样品是混合物。

待分析的部分样品放入BLEB（奶制品放入AOAC或IDF）中，30℃培养4h，进行李斯特菌选择性增菌。

在第四个小时加入选择剂：acriflavin（10mg/L），sodium nalidixate（40mg/L），optional antifungal，cycloheximide（50mg/L）。

然后继续培养48h，在24h和48h时，将培养物划线接种于不同的选择性培养基来分离李斯特菌。

有些快速检测到李斯特菌的存在。

先在标准增菌液或呈现阳性的增菌液中进行李斯特菌增菌，之后划线到选择培养基上进行纯化，然后在非选择培养基上纯化，最后通过常规检测实验或一系列生化实验来确定是否为单增李斯特氏菌。

利用具体实验，分离物会快速地被鉴定是否为单增李斯特氏菌。

FDA规则中，必须依照血清类型`PFGE及核糖类型分类。

利用选择性培养基的菌落计数及MPN计数法可以对单李进行计数。

（MPN计数法是先用BLEB选择性增菌，再涂布于ALOA或BCM选择性培养基上）主要内容如下：1．增菌液及快速检测实验是可以选择的2．可用任一种选择分离培养基（OXA 、PALLCAM 、添加七叶苷和三价铁的LPM 、MOX）来代替两种选择性培养基。

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法的探讨张慧珍（谱尼测试集团股份有限公司，北京 100194）摘 要：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一种人畜共患病的病原菌，是一种常见的土壤细菌，能引起严重食物中毒，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。

单核细胞增生李斯特氏菌广泛存在于自然界中，食品中存在的单核细胞增生李斯特氏菌对人类的安全具有一定的威胁，该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。

本文通过采用国家标准检测方法《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30—2016）对大量肉、奶、蛋和水产品等产品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测，总结了一些食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测经验，主要从试剂准备、增菌、划线分离及生化鉴定等方面阐述了对单核细胞增生李斯特检测的一些理解，以期为食品检测工作中单核细胞增生李斯特氏菌的检测提供部分参考。

关键词：食品；单核细胞增生李斯特氏菌；国标检测方法Discussion on Detection Method of Listeria monocytogenes in FoodZHANG Huizhen(Pony Testing Group International Co., Ltd., Beijing 100194, China) Abstract:Listeria monocytogenes is a zoonotic pathogen. It is a common soil bacterium that can cause serious food poisoning. After infection, it is mainly manifested in sepsis, meningitis and mononucleosis. It exists widely exists in nature. Listeria monocytogenes in food is dangerous to human safety. The bacteria can still grow and reproduce in the environment of 4 ℃, and it is one of the main pathogenic bacteria that threaten human health in refrigerated food. By using the national standard detection method GB 4789.30—2016 to detect Listeria monocytogenes in a large number of meat, milk, eggs and aquatic products, this paper summarizes the detection experience of Listeria monocytogenes in some foods, and expounds some understandings of Listeria monocytogenes detection mainly from the aspects of reagent preparation, enrichment, lineation separation and biochemical identification, in order to provide some reference for the detection of Listeria monocytogenes in food testing.Keywords: food; Listeria monocytogenes; national standard detection method李斯特氏菌属隶属革兰氏阳性细菌中厚壁菌门，李斯特氏菌属可划分为6个菌种，即单核增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特氏菌（L. seeligeri）、威尔斯特氏菌（L. welshimeri）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）和格氏李斯特菌（L. grayi）[1]。

食品中单核细胞增生李斯特氏菌测定能力验证分析
杨滴
【期刊名称】《食品安全导刊》
【年(卷),期】2022()26
【摘要】目的:为掌握本实验室食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测能力情况,自愿参加中国食品药品检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证。

方法:采用常规培养法、全自动酶联免疫荧光分析仪法和实时荧光PCR法3种检测方法进行食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测分析。

结果:CODE034样品检出单核细胞增生李斯特氏菌,CODE164样品未检出。

结论:3种方法均取得了较好的实验结果。

以常规培养法为基础,以其他检测方法为辅助,能够准确、快速地取得实验结果,并应用于其他能力样品的检测。

【总页数】4页(P85-88)
【作者】杨滴
【作者单位】大连市检验检测认证技术服务中心
【正文语种】中文
【中图分类】J62
【相关文献】
1.食品中单核细胞增生李斯特氏菌检出能力验证结果与分析
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3.食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证
结果及分析4.食品中单核细胞增生李斯特氏菌能力验证结果及分析5.食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证结果与分析
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分析检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的能力验证结果分析于 潇（上海中维检测技术有限公司，上海 201600）摘 要：为了提升实验室综合检测能力，保证日常出具的抽检结果准确可靠，本实验室参加了2022年南京市食品药品监督检验院组织的能力验证，能力验证结果评价为满意，表明实验室具备单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力。

关键词：单核细胞增生李斯特氏菌；能力验证；质量控制Profificiency Testing Analysis of Listeria monocytogenesin FoodYU Xiao(Shanghai Zhongwei Testing Technology Company, Shanghai 201600, China) Abstract: In order to improve the comprehensive testing ability of the laboratory and ensure the accuracy and reliability of the daily sample test results, the laboratory participated in the ability verification organized by Nanjing Food and Drug Supervision and Inspection Institute in 2022, and the ability verification results were evaluated as satisfactory, indicating that the laboratory has the ability to test Listeria monocytogenes.Keywords:Listeria monocytogenes; profificiency testing; quality control李斯特氏菌属革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中，具有耐低温、耐酸、耐高盐等特点。

食品中单增李斯特菌检验方法的应用分析摘要：目的：单增李斯特菌定性检测结合实时荧光PCR和MPN计数法，在食品源性致病菌检测中快速进行定性和定量检测。

方法：将单增李斯特菌的菌悬液样品依据不同浓度用细菌培养法和实时荧光PCR法进行比较；分别对当日、冷冻2小时和6小时的增菌液进行MPN计数法定量检测，对三种情况下MPN计数结果进行比较。

结果：细菌培养法和实时荧光PCR法检测两者结果一致；MPN计数法定量检测，（1）和（2）结果吻合，与（3）结果有差异。

结论：实时荧光PCR检测和MPN计数法相结合，避免样品细菌培养法检测出阳性结果，定量检测时重新取样而导致的结果差异，减短检验周期和工作量，使工作效率得到提升。

关键词：食品；单增李斯特菌；检验方法连年来，因食品污染单增李斯特菌导致食品中毒的事件逐渐增多，引起社会各界的广泛关注。

单增李斯特菌是一种人畜共患病的病原菌[1]，多存在于土壤、水产品和动物中，食物中涉及较多的是急冻食品、生菜食物和熟食店食物等。

易感人群为新生儿、孕妇和40岁以上的成年人，临床症状表现为发热、化脓性结膜炎和败血症等，死亡率高达30%以上。

本文将从实时荧光定量PCR法和MPN计数法相结合，对单增李斯特菌定量检测进行研究，有关情况如下。

1.材料与方法1.1仪器和试剂标准菌株采用我市提供的50000株单增李斯特菌，使用实时荧光定量PCR仪和离心机，选取实时荧光定量PCR试剂、全自动微生物鉴定仪和革兰氏阳性细菌鉴定卡，培养基选自李氏增菌肉汤等，均在有效期内使用培养基和试剂。

用脑心浸液培养基将80℃标准菌株过夜培养温度控制在30℃，科玛嘉单李斯特显色琼脂平板培养24小时，温度设置为36℃至37℃。

菌落的挑选规格为天蓝色、大小适中和周围有白色晕环，将菌落接种于脑心浸液琼脂平板分纯24小时30℃，菌液的浓度利用生理盐水控制在0.5至0.6麦氏单位，将调整好的菌液作为原液，1ml菌液和9ml无菌生理盐水放在试管中，把试管的液体进行均匀搅拌，制作成10-1菌液，重复上面的步骤，菌液制作成10位系列菌液。

食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验1范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i am o n o c y t o g e n e s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验;第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数;第三法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低(<100C F U/g)而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数,特别是牛奶㊁水以及含干扰菌落计数的颗粒物质的食品㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1冰箱:2ħ~5ħ㊂2.2恒温培养箱:30ħʃ1ħ㊁36ħʃ1ħ㊂2.3均质器㊂2.4显微镜:10x~100x㊂2.5电子天平:感量0.1g㊂2.6锥形瓶:100m L㊁500m L㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌平皿:直径90mm㊂2.9无菌试管:16mmˑ160mm㊂2.10离心管:30mmˑ100mm㊂2.11无菌注射器:1m L㊂2.12单核细胞增生李斯特氏菌(L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s)A T C C19111或C M C C54004,或其他等效标准菌株㊂2.13英诺克李斯特氏菌(L i s t e r i a i n n o c u a)A T C C33090,或其他等效标准菌株㊂2.14伊氏李斯特氏菌(L i s t e r i a i v a n o v i i)A T C C19119,或其他等效标准菌株㊂2.15斯氏李斯特氏菌(L i s t e r i a s e e l i g e r i)A T C C35967,或其他等效标准菌株㊂2.16金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)A T C C25923或其他产β-溶血环金葡菌,或其他等效标准菌株㊂2.17马红球菌(R h o d o c o c c u s e q u i)A T C C6939或N C T C1621,或其他等效标准菌株㊂2.18小白鼠:I C R体重18g~22g㊂2.19全自动微生物生化鉴定系统㊂3培养基和试剂3.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E):见A.1㊂3.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E):见A.2㊂3.3李氏增菌肉汤L B(L B1,L B2):见A.3㊂3.41%盐酸吖啶黄(a c r i f l a v i n eH C l)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.51%萘啶酮酸钠盐(n a l a d i x i c a c i d)溶液:见A.3.2.1㊁A.3.2.2㊂3.6 P A L C AM琼脂:见A.4㊂3.7革兰氏染液:见A.5㊂3.8S I M动力培养基:见A.6㊂3.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(M R)和V-P试验用]:见A.7㊂3.105%~8%羊血琼脂:见A.8㊂3.11糖发酵管:见A.9㊂3.12过氧化氢试剂:见A.10㊂3.13李斯特氏菌显色培养基㊂3.14生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统㊂3.15缓冲蛋白胨水:见A.11㊂第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验4检验程序单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1㊂图1单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取样品25g(m L)加入到含有225m LL B1增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n;或放入盛有225m LL B1增菌液的均质杯中,以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h,移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂5.2分离取L B2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和P A L C AM琼脂平板,于36ħʃ1ħ培养24h~48h,观察各个平板上生长的菌落㊂典型菌落在P A L C AM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落,周围有棕黑色水解圈,有些菌落有黑色凹陷;在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征,参照产品说明进行判定㊂5.3初筛自选择性琼脂平板上分别挑取3个~5个典型或可疑菌落,分别接种木糖㊁鼠李糖发酵管,于36ħʃ1ħ培养24hʃ2h,同时在T S A-Y E平板上划线,于36ħʃ1ħ培养18h~24h,然后选择木糖阴性㊁鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定㊂5.4鉴定(或选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等)5.4.1染色镜检:李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌,大小为(0.4μm~0.5μm)ˑ(0.5μm~2.0μm);用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动㊂5.4.2动力试验:挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或S I M动力培养基,于25ħ~30ħ培养48h,李斯特氏菌有动力,在半固体或S I M培养基上方呈伞状生长,如伞状生长不明显,可继续培养5d,再观察结果㊂5.4.3生化鉴定:挑取纯培养的单个可疑菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和M R-V P试验㊂单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1㊂5.4.4溶血试验:将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个~25个小格,挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上,每格刺种一个菌落,并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂, 36ħʃ1ħ培养24h~48h,于明亮处观察,单增李斯特氏菌呈现狭窄㊁清晰㊁明亮的溶血圈,斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈,英诺克李斯特氏菌无溶血圈,伊氏李斯特氏菌产生宽的㊁轮廓清晰的β-溶血区域,若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:也可用划线接种法㊂5.4.5协同溶血试验c AM P(可选项目):在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌,挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,距离1mm~ 2mm,同时接种单核细胞增生李斯特氏菌㊁英诺克李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌,于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域,斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域,伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm~10mm的 箭头状 β-溶血增强区域,英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象㊂若结果不明显,可置4ħ冰箱24h~48h再观察㊂注:5%~8%的单核细胞增生李斯特氏菌在马红球菌一端有溶血增强现象㊂表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖M R-V P甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌(L.m o n o c y t o g e n e s)++++/+-+-+格氏李斯特氏菌(L.g r a y i)-+++/++--+斯氏李斯特氏菌(L.s e e l i g e r i)++++/+--++威氏李斯特氏菌(L.w e l s h i m e r i)-+++/+-V++伊氏李斯特氏菌(L.i v a n o v i i)++++/+--++英诺克李斯特氏菌(L.i n n o c u a)-+++/+-V-+注:+阳性;-阴性;V反应不定㊂5.5小鼠毒力试验(可选项目)将符合上述特性的纯培养物接种于T S B-Y E中,于36ħʃ1ħ培养24h,4000r/m i n离心5m i n,弃上清液,用无菌生理盐水制备成浓度为1010C F U/m L的菌悬液,取此菌悬液对3只~5只小鼠进行腹腔注射,每只0.5m L,同时观察小鼠死亡情况㊂接种致病株的小鼠于2d~5d内死亡㊂试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照组㊂单核细胞增生李斯特氏菌㊁伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性㊂5.6结果与报告综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25g(m L)样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌㊂第二法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法6检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序见图2㊂图2单核细胞增生李斯特氏菌平板计数程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1以无菌操作称取样品25g(m L),放入盛有225m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌均质袋内(或均质杯)内,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n或以8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂液体样品,振荡混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂7.1.2用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L缓冲蛋白胨水或无添加剂的L B肉汤的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂7.1.3按7.1.2操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释1次,换用1支1m L无菌吸管或吸头㊂7.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每个稀释度的样品匀液分别吸取1m L以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L的接种量分别加入3块李斯特氏菌显色平板,用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如琼脂平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂7.3培养7.3.1在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂7.4典型菌落计数和确认7.4.1单核细胞增生李斯特氏菌在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征以产品说明为准㊂7.4.2选择有典型单核细胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在15C F U~150C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂如果:a)只有一个稀释度的平板菌落数在15C F U~150C F U之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;b)所有稀释度的平板菌落数均小于15C F U且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型菌落;c ) 某一稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;d ) 所有稀释度的平板菌落数大于150C F U 且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;e ) 所有稀释度的平板菌落数均不在15C F U~150C F U 之间且有典型菌落,其中一部分小于15C F U 或大于150C F U 时,应计数最接近15C F U 或150C F U 的稀释度平板上的典型菌落㊂以上按式(1)计算㊂f ) 2个连续稀释度的平板菌落数均在15C F U~150C F U 之间,按式(2)计算㊂7.4.3 从典型菌落中任选5个菌落(小于5个全选),分别按5.3㊁5.4进行鉴定㊂8 结果计数T =A BC d(1)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C某一稀释度用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;d稀释因子㊂T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1 第一稀释度(低稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 1 第一稀释度(低稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;A 2 第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2 第二稀释度(高稀释倍数)确证为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于单核细胞增生李斯特氏菌确证试验的菌落数;1.1 计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂9 结果报告报告每g (m L )样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法 单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法10 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌M P N 计数法检验程序见图3㊂图3单核细胞增生李斯特氏菌M P N计数程序11操作步骤11.1样品的稀释按7.1进行㊂11.2接种和培养11.2.1根据对样品污染状况的估计,选取3个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于10m LL B1肉汤,每一稀释度接种3管,每管接种1m L(如果接种量需要超过1m L,则用双料L B1增菌液)于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂每管各移取0.1m L,转种于10m LL B2增菌液内,于30ħʃ1ħ培养24hʃ2h㊂11.2.2用接种环从各管中移取1环,接种李斯特氏菌显色平板,36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂11.3确证试验自每块平板上挑取5个典型菌落(5个以下全选),按照5.3㊁5.4进行鉴定㊂12结果与报告根据证实为单核细胞增生李斯特氏菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录B),报告每g(m L)样品中单核细胞增生李斯特氏菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(T S B-Y E)A.1.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.2含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(T S A-Y E)A.2.1成分胰胨17.0g多价胨3.0g酵母膏6.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖2.5g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.2.2制法将上述各成分加热搅拌溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3李氏增菌肉汤(L B1,L B2)A.3.1成分胰胨5.0g多价胨5.0g酵母膏5.0g氯化钠20.0g磷酸二氢钾1.4g磷酸氢二钠12.0g七叶苷1.0g蒸馏水1000m LA.3.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.3.2.1李氏Ⅰ液(L B1)225m L中加入:1%萘啶酮酸(用0.05m o l/L氢氧化钠溶液配制)0.5m L1%吖啶黄(用无菌蒸馏水配制)0.3m LA.3.2.2李氏Ⅱ液(L B2)200m L中加入:1%萘啶酮酸0.4m L1%吖啶黄0.5m LA.4P A L C A M琼脂A.4.1成分酵母膏8.0g葡萄糖0.5g七叶甙0.8g柠檬酸铁铵0.5g甘露醇10.0g酚红0.1g氯化锂15.0g酪蛋白胰酶消化物10.0g心胰酶消化物3.0g玉米淀粉1.0g肉胃酶消化物5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.4.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.2ʃ0.2,分装,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A.4.2.1P A L C A M选择性添加剂多粘菌素B5.0m g盐酸吖啶黄2.5m g头孢他啶10.0m g无菌蒸馏水500m LA.4.2.2制法将P A L C AM基础培养基溶化后冷却到50ħ,加入2m LP A L C AM选择性添加剂,混匀后倾倒在无菌的平皿中,备用㊂A.5革兰氏染色液A.5.1结晶紫染色液A.5.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.5.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.5.2革兰氏碘液A.5.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.5.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.5.3沙黄复染液A.5.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.5.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.5.4染色法A.5.4.1涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.2滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂A.5.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A.5.4.4滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.6S I M动力培养基A.6.1成分胰胨20.0g多价胨6.0gG B 4789.30 201611 硫酸铁铵0.2g 硫代硫酸钠0.2g 琼脂3.5g 蒸馏水1000m L A .6.2 制法将上述各成分加热混匀,调节p H 至7.2ʃ0.2,分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂A .6.3 试验方法挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到S I M 培养基中,于25ħ~30ħ培养48h ,观察结果㊂A .7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(M R 和V P 试验用)A .7.1 成分多价胨7.0g 葡萄糖5.0g 磷酸氢二钾5.0g 蒸馏水1000m L A .7.2 制法溶化后调节p H 至7.0ʃ0.2,分装试管,每管1m L ,121ħ高压灭菌15m i n ,备用㊂A .7.3 甲基红(M R )试验A .7.3.1 甲基红试剂A .7.3.1.1 成分甲基红10m g 95%乙醇30m L 蒸馏水20m LA .7.3.1.2 制法10m g 甲基红溶于30m L95%乙醇中,然后加入20m L 蒸馏水㊂A .7.3.1.3 试验方法取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中,36ħʃ1ħ培养2d ~5d ㊂滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果㊂鲜红色为阳性,黄色为阴性㊂A .7.4 V -P 试验A .7.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液成分及制法:取α-萘酚6.0g ,加无水乙醇溶解,定容至100m L ㊂。