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EP6-AISBN 1-56238-498-8V olume 23 Number 16 ISSN 0273-3099Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures:A Statistical Approach;Approved GuidelineEP6-A：定量测量方法的线性评价： 一种统计学方法，批准指南NCCLS…通过自愿一致化的方式为世界医学科学团体服务NCCLS是医疗领域一个非赢利性的，不同学科之间，自愿参与的促进标准化和建立指南的教育组织。
NCCLS创建于1968年并获得美国国家标准研究院的认可。
NCCLS所依据的原则是，对病人高质量服务所需的临床实验室检测，自愿一致的标准是必不可少的。
NCCLS通过各临床实验室、检验团体学会、工厂和政府机构的参与而代表临床检验界。
叙述了文件叙述了实验室的程序、常规和参考方法以及评估方案可应用于所有检验学科。
文件审核的一致化过程由一些正式的步骤组成，叙述了NCCLS文件和规范的编制如何发展到被接受为临床实验室标准。
出版物NCCLS文件以标准、指南、委员会报告出版。
标准：通过一致化过程形成的文件，并对材料、方法、或实践以不能修改方式明确规定其特定的基本要求。
此外，标准也可以包含明确规定的选定要素。
指南：通过一致化过程形成的文件，叙述了用于临床检验界的一般实验操作、方法或材料的规范。
使用者可以使用成文文件或修改指南以适应特定的需要。
报告： 没有经过一致化审定过程的文件，由理事会颁布。
“标准”一词，除了有特定含义外，还常用来指有关的NCCLS文件。
一致化过程NCCLS的自愿一致化审定程序是一个为以下方面建立正式规范的方案：1. 标准项目的权威性2文件的编制和公开评审3根据实验室使用者反馈的评论修改文件4文件被接受为临床实验室标准大多数NCCLS文件必须有“建议”和“批准”两种层次的一致化文件，根据特定的一致化过程，文件也可以有一个中间（“试行”）一致化的水平层次。
定量检测系统线性评价方法— EP6-A法线性范围是分析方法的重要技术指标之一，线性范围越宽，说明该分析方法的性能越好，越适用于临床。
目前评价分析方法线性范围的方法很多，如：目测法、EP6-P法、美国临床病理学家协会设备委员会（CAP-IRC）法、EP6-A法等。
本文主要介绍了目前评价分析方法线性范围最好的方法即EP6-A法。
1. 仪器熟悉阶段在线性评价实验之前，仪器应当在实验室安装并使用相当长的一段时间，以便实验者熟练掌握仪器的操作，并保证仪器经过正确的定标、实验样本经过适当的准备。
如果仪器生产商为实验者提供了培训，这也可以作为本阶段的一个部分。
2. 线性评价实验2.1 实验样本的数目线性评价实验的样本数目依据实验目的而确定：①如果实验目的是验证某方法的线性范围，需要5～7个不同浓度水平的样本，这些样本的浓度必须覆盖厂家申明的线性范围，并且每个样本重复测量2次。
②如果实验目的是建立新方法的线性范围，需要7～11个不同浓度水平的样本，这些样本的浓度必须覆盖预期的线性范围。
一般情况下，新方法线性范围的建立者希望有更多浓度水平的实验样本，并且这些实验样本的浓度应该比预期的线性范围宽20%～30%，这样能确定最合适的线性范围。
此外，再根据检测系统不精密度的大小，每个样本重复测量2～4次。
③多元回归分析法评价线性范围时至少需要5个不同浓度水平的实验样本，并且实验样本越多，就越能准确地评价线性范围。
2.2 实验样本的配制EP6-A文件推荐使用高值和低值浓度的样本按特定的比例精确配制成一系列不同浓度的样本，并且这些样本的浓度可以为等间距排列，也可以为不等间距排列，具体配制方法可以参考文件后的附录A。
在配制过程中，实验者应优先选用移液管法配制实验样本，因为用移液管精确吸量高值、低值浓度样本配制实验样本所产生的误差比称量法、配制复溶溶液法要小。
此外，实验者在吸取小体积溶液时要特别小心。
2.3 实验样本的编号在线性评价实验前，实验样本中分析物浓度可以为未知条件，只是此时必须对每个实验样本进行编号来反映实验样本中分析物浓度的关系。
CLSI 所有EP标准的适用范围和简介1. EP05-A3定量测量程序精密度评估：批准指南发布日期：2014年10月版本号A3适用范围：本文件为临床实验室的研究提供指南，目的是为定量测定程序建立批内精密度性能特征，以及进行批间变异研究。
本文阐述了多个实验方案，并考虑了如何选择和优化方案使其成为某特定测定程序的最佳方案，以及该方案的使用目的。
对于仅仅是验证厂家声明的精密度的用户，不适用于本文件，应参照CLSI 文件EP15。
EP05首要适用于制造商和开发商者，对终端用户验证重复性和和实验室内精密度的建议可参考EP15，EP15中的实验方案已改为和EP05中单一实验室研究设计的兼容性。
单一实验室方案与前版EP05方案类似，对给定样品和试剂批号等需要检测20天，每天测2批，每批重复测定2次。
第3版仍使用该方案并以此作为制造商和开发者的规范实验，用于评估测量程序的重复性和实验室内的精密度。
新的EP05是第二个标准化实验：多中心方案至少要在3个地方重复测定5天，第4章提到了如何实施3（地）x5（天）x5（每天重复次数）和3（地）x5（天）x2（每天批次）x3（每批重复次数）。
该辅助方案阐述了实验室间变异和再现性的估计。
为了帮助理解基本概念，新版EP05中有针对非统计学研究人员的扩展教程（见1.5小节）。
鉴于本指南中计算的复杂性，建议使用CLSI 提供的StatisPro 方法评估软件。
2. EP06-A：定量测量程序的线性评估：统计学方法发布日期：2003年4月版本号A使用范围：本文件提供了一种方法用于建立、验证和证明定量测量程序的线性范围。
他不能鉴别造成明显费线性的原因。
样本数越多越能明确的检查线性。
因此，若线性评估失败则需要重做，重做时可以增加重复次数，或减少浓度水平以覆盖较小的线性范围。
本指南主要是评价线性关系，尽可能不受精密度和准确度的影响。
众所周知，精密度差会影响线性评估的有效性，因此本文件还包括了对重复性差的检查。
1.EP05-A3定量测量程序精密度评估：批准指南发布日期：2014年10月版本号A3适用范围：本文件为临床实验室的研究提供指南，目的是为定量测定程序建立批内精密度性能特征，以及进行批间变异研究。
本文阐述了多个实验方案，并考虑了如何选择和优化方案使其成为某特定测定程序的最佳方案，以及该方案的使用目的。
对于仅仅是验证厂家声明的精密度的用户，不适用于本文件，应参照CLSI文件EP15。
EP05首要适用于制造商和开发商者，对终端用户验证重复性和和实验室内精密度的建议可参考EP15，EP15中的实验方案已改为和EP05中单一实验室研究设计的兼容性。
单一实验室方案与前版EP05方案类似，对给定样品和试剂批号等需要检测20天，每天测2批，每批重复测定2次。
第3版仍使用该方案并以此作为制造商和开发者的规范实验，用于评估测量程序的重复性和实验室内的精密度。
新的EP05是第二个标准化实验：多中心方案至少要在3个地方重复测定5天，第4章提到了如何实施3（地）x5（天）x5（每天重复次数）和3（地）x5（天）x2（每天批次）x3（每批重复次数）。
该辅助方案阐述了实验室间变异和再现性的估计。
为了帮助理解基本概念，新版EP05中有针对非统计学研究人员的扩展教程（见1.5小节）。
鉴于本指南中计算的复杂性，建议使用CLSI提供的StatisPro TM方法评估软件。
2. EP06-A：定量测量程序的线性评估：统计学方法发布日期：2003年4月版本号A使用范围：本文件提供了一种方法用于建立、验证和证明定量测量程序的线性范围。
他不能鉴别造成明显费线性的原因。
样本数越多越能明确的检查线性。
因此，若线性评估失败则需要重做，重做时可以增加重复次数，或减少浓度水平以覆盖较小的线性范围。
本指南主要是评价线性关系，尽可能不受精密度和准确度的影响。
众所周知，精密度差会影响线性评估的有效性，因此本文件还包括了对重复性差的检查。
本实验所用样品的基质尽可能与待分析标本类型一致。
EP6-A法分析测量X围评价应用举例分析测量X围〔线性检测X围〕评价采用的方法有目测法、EP6-P法、改良Doumas法、CAP-IRC 法和EP6-A法.EP6-A法操作简便,适合于临床常规实验室人员评价线性,是目前最好评价线性的方法.EP6-A法是NCCLS在EP6-P和CAP-IRC 线性评价方法的基础上,经过不断的实践和不断的改进,于20##颁发的批准性指南文件.一、标本要求推荐用高值和低值浓度的样本按比例精确配置等间距的不同浓度样本,低、高值样本分别测定2～4次取均值,为2个样本的实测值,如低值以L表示,高值以H表示,分别为第一管和最后一管,各管依照L与H样品配置的比例,可以计算出实验样品的预期值.每管的浓度由以下公式来计算,第1管的浓度为C1,体积为V1,以次类推,第5管的浓度和体积分别为C5和V5计算浓度C=〔C1×V1+ C5×V5〕/<V1+V5> ,注意每管要充分混匀,并防止蒸发或其它改变.二、结果判断:该法的线性判断过程大致分为四个步骤：〔1〕确定不同项目可接受不精密度和线性偏差.EP6-A强调任何用户有必要确定自己对线性程度的要求,或非线性的允许误差X围,目标的确定应基于实验室客户的需要与所用方法的特性.设定误差目标所要考虑的因素：线性目标来源于偏倚目标,因而应小于或等于偏倚目标；偏倚目标应应小于或等于测量误差.〔2〕计算不精密度：目测检查无明显离群值,计算不精密度.重复性用L个样本的所有重复测量结果的集合方差来评价.用SDr或CVr表示.公式………………………………①L为样本数；ri1和ri2分别为两次测量的实际结果,或与均值的百分比.〔3〕不精密度符合要求后,作多项式回归分析.多项式回归分析可以借助多种商业统计软件完成.例如用SPSS的话,选"分析〞→"回归分析〞→"曲线估计〞→"因变量〞、"自变量〞、"模型〔线性、平方、三次方〕〞→得三个方程.将测定数据分别拟合一次、二次和三次多项式阶别回归方程回归自由度〔Rdf〕一次Y=a+b1X 2二次Y=a+b1X+b2X2 3三次Y=a+b1X+b2X2+b3X3 4一次多项式模型为直线,是判断某种方法是否为线性的最适方程,二次多项式模型代表一种抛物线反应曲线,有增加趋势〔曲线上升〕或减少趋势〔曲线下降〕两种,三次多项式模型代表一种"S〞形反应曲线,在测量X围的两端呈非线性.回归系数用bi表示,在二次多项式模型中,b2为非线性系数；在三次多项式模型中,b2和b3为非线性系数.计算每个非线性系数斜率的标准差,然后进行t检验,判断非线性系数是否有统计学意义,即与0之间有无差异.如果二次多项式模型的非线性系数b2,或三次多项式模型的b2或b3中任一个与0比较,差异有显著性<P<0.05>,则该组数据存在非线性.否则认为存在线性关系.非线性程度判断：根据回归分析的标准误〔Sy,x〕的大小,以最小者确定为最适多项式.Sy,x 是统计分析测量结果与模型的差值,因而Sy,x越小,说明该模型越适合数据组.〔4〕计算线性偏差.最适多项式为非线性时,计算每个浓度点处的线性偏差：DLi=p<Xi>－〔a+b1Xi〕.每一个浓度处的线性偏差<DLi或称非线性程度>,即非线性拟合模型与线性拟合模型在每个浓度点的差值〕与设定的误差X围比较,如果DLi小于预先设定误差,即使检测到统计学上的非线性,由于非线性误差小于设定目标,因而也是可以接受的.如果任一个点DLi超过设定目标,则代表该点可能是非线性,此时两种方法进行处理：①试图找到非线性的原因<样本准备、干扰物质、仪器校准等>并解决.②观察测量浓度与预期值散点图,判断非线性是在分析浓度X围的两端或是中间.如果是在两端,试着舍去DLi最大值的浓度点,重新进行统计分析,这样就会缩小线性X围.三、举例〔一〕验证检测ALT的线性X围1．样本准备收集待测物浓度在厂家所给可报告X围上、下限附近的病人血清,作为低浓度〔L〕和高浓度<H> 样品；配制成等间距浓度关系的6管样本.见表1.表1：等间距浓度标本的配制管号 1 2 3 4 5 6配制方法5L 4L+H 3L+2H 2L+3H 1L+4H 5H预期值 5.0 221.4 437.8 654.2 870.6 1087.02．样本测定在日立7170A全自动生化分析仪上测定ALT,每标本按随机方式重复测定两次,在一个分析批内完成,测定结果见表2.假定实验室设定的重复性和线性的允许误差X围分别为2.0%和5.0%.作好记录并目测线性关系和重复相关性,检查是否有离群值.表2：样本测量结果标本号测量结果#1 测量结果#2均值1 5 5 5.02 222 225 223.53 435 433 434.04 673 672 672.55 853 857 855.061054 1096 1075.03．结果判断〔1〕按公式①计算SDr% SDr%=1.21,重复测量误差符合要求.〔210.0以上〕完成.建表Data View,如下:.此命令产生的过程是：Analyze→Regression→CurveEstimation→将表中Y列选入右侧的Dependent<s>窗中→将表中X列选入右侧的Independent窗中→把Models中的Linear〔一次方程〕、Quadratic〔二次方程〕和Cubic 〔三次方程〕勾选→将Display ANOV A table勾选→击右下方的Save钮→将新出现的小窗SaveVariables中的PredictedValues与Residuals勾选→Continue→Paste→出现下列CURVEFIT命令.或在语法编辑器中直接运行下列命令.* Curve Estimation.CURVEFIT /VARIABLES=X WITH group/CONSTANT/MODEL=LINEAR QUADRATIC CUBIC/PRINT ANOVA/PLOT FIT/SAVE=PRED RESID .〔3〕输出结果见表3表3：回归分析结果〔4〕判断非线性程度: 根据回归分析的标准误〔Sy,x〕的大小,以最小者确定为最适多项式.从表3可见三个拟合方程均合适,t检验二次、三次B值与"0〞比较无显著性,可忽略.4. 结论: 多项式回归分析最适多项式为一次〔线性〕,线性X围 5～1075 U/L.〔二〕验证检测IgM的线性X围1．收集待测物浓度在厂家所给可报告X围上、下限附近的病人血清,作为低浓度〔L〕和高浓度<H> 样品；配制成等间距浓度关系的5管样本,见表4.表4：等间距浓度标本的配制标本号 1 2 3 4 5制备L 0.75L+0.25H 0.50L+0.50H 0.25L+0.75H H预期值26.35 121.39 216.43 311.46 406.502．标本检测每标本按随机方式重复测定两次,在一个分析批内完成,见表5.假定实验室设定的重复性和线性的允许误差X围分别为2.0%和5.0%.作好记录并目测线性关系和重复相关性,检查离群值并判断检测结果是否有效.表5：样本测量结果标本号测量结果#1 测量结果#2 均值阶别回归系数结果标准误差t检验自由度回归标准误一次b1 213.80 2.93 72.87 10 12.27二次b2 -1.86 2.05 -0.91 9 12.55三次b2 0.52 20.14 0.03三次b3 -0.23 1.90 -0.12 8 15.311 26.5 26.2 26.352 139 138 138.53 269 273 271.04 337 343 340.05 409 404 406.53．结果判断<1> 按公式①计算SDr%为0.9%,低于规定的误差目标2.0%.<2> 多项式回归分析: 借助SPSS统计软件完成.建表Data View〔同前〕<3>输出结果,见表6.表6：回归分析结果阶别回归系数结果标准误差t检验自由度回归标准误一次b1 96.18 5.10 18.8 8 22.8二次b2 -11.06 1.95 5.7 7 10.3三次b2 6.08 17.41 0.3三次b3 -1.90 1.92 -1.0 6 10.3<4> 判断回归分析结果：由表6可见,二次拟合模型比一次线性模型要好,有统计意义的系数为b2.三次模型有相似的拟合度,但没有显著性的系数.因而最适多项式为二次.<5> 计算线性偏差:由于最适多项式为非线性时,故需计算每个浓度点处的线性偏差,见表7.其中预期值〔1st〕为Data View表中的fit_1; 预期值〔2nd〕为Data View表中的fit_2.表7：线性偏差结果从一次和二次多项式模型的差值分析结果来看,有四个浓度水平的差值超过实验室设定的5%目标.另外从IgM 的线性评价散点图〔见图1〕中也可以发现中间的点偏离较大,但是该点无法消除,因此系统被认为非线性的,要求重新分析.图1：IgM 的线性评价散点图4.结论: 该方法在实验所涉与的浓度X 围内不成线性.〔三〕验证Ca 检测的线性X 围1．样本准备与测定同上,假定实验室设定Ca 的重复性和非线性误差均为0.20mg/dL,它不是百分比形式,因为大多认为Ca 的偏差不是成比例变化的,是一个恒量.对6个不同浓度水平的标本进行重复测定.2．测量结果,见表8.表8：两次测量的均值和差值 标本号 测量值1 测量值2 均值 差值D D 2/21 4.7 4.6 4.65 0.1 0.0052 7.8 7.6 7.7 0.2 0.023 10.4 10.2 10.3 0.2 0.02 4 13 13.1 13.05 0.1 0.005 5 15.5 15.3 15.4 0.2 0.02 616.3 16.1 16.2 0.20.023. 结果判断<1> 按公式①计算SDr 为0.12mg/dL,小于0.20mg/dL ,符合要求. <2>多项式回归分析:同上.附回归分析图〔见图2〕.图2：多项式回归分析图<3> 输出结果,见表9.表9：回归分析结果 <4>分析结果：由表9可见,二次和三次多项式模型的非线性系数均有统计学意义〔自由度=8时的允许水平2.306〕.三次多项式模型还有较低的回归标准差,提示三次多项式为最适模型.<5>计算线性偏差:由表10可见差值从0.13到0.93mg/dL,有五个浓度的差值超过实验室设定的误差水平〔0.20mg/dL 〕.从图3中可知,最后一点明显偏离直线.试探除去最后一个点,重新作多项式回归分析,重复性误差符合要求,由修正后的多项式回归分析〔见表11〕可见,二次多项式模型的回归系数b2有显著意义,三次模型的b2和b3无显著意义.最适模型为二次多项式.实测均值 预期值〔1st 〕 ① 预期值〔2nd 〕 ② 2nd -1st ③ %差值 ③/①*100 26.4 44.1 22.0 -22.1 -50.1138.5 140.3 151.3 11.0 7.8271.0 236.5 258.6 22.1 9.3340.0 332.7 343.7 11.0 3.3406.5 428.8 406.7 -22.1 -5.2阶别 系数 数值 系统误差 t 检验 回归标准误 自由度 1st b1 2.39 0.11 21.2 0.667 10 2nd b2 -0.22 0.04 -6.0 0.313 9 3rd b2 0.48 0.18 2.6 3rd b3 -0.07 0.02 -3.8 0.197 8表10：线性偏差结果 图3：Ca 线性图表11：修正后的回归分析结果计算修<7> 再正后的线性偏差:见表12.从表12可看出一次多项式和二次多项式模型的差值都没有超过实验室设定的0.2mg/dl,所以方法在该X 围内〔4.65～15.40mg/dl 〕呈线性. 表12：修正后的线性偏差结果 <7> 修正后的Ca 线性图：见图4. 图4：修正后的Ca 线性图 4. 结论：去掉最后一个点后得到缩小X 围的线性： 4.65～15.40mg/dl〔四〕验证T3检测的线性X 围： 定同上,假定实验1．样本准备与测室设定T3的重复性和非线性误差为5%和10%.对6个不同浓度水平的标本进行重复测定.作好记录并目测线性关系和重复相关性,检查离群值并判断检测结果是否有效. 2．结果判断：<1> 按公式①计算SDr%为2.68%,低于规定的误差目标5.0%.<2> 多项式回归分析：借助SPSS 统计软件完成.建表Data View 〔同前〕 <3>输出结果：见表13.表13：回归分析结果阶别 系数 数值 系统误差 t 检验 回归标准误 自由度 1st b1 1.90 0.055 34.16 0.228 10 2nd b2 0.073 0.009 7.88 0.057 9 3rd b2 -0.052 0.019 -2.70 3rd b3 0.012 0.002 6.56 0.015 8<4> 判断回归分析结果：由表13可见,二次和三次多项式均有统计学意义的非线性系数,由于三次多项式的回归标准误较小,最适多项式为三次.<5> 计算线性偏差: 由表14可见只有第一个点的偏差超过了允许的X 围10%. 表14：线性偏差结果测量均值 预期值1st 预期值3rd 3rd- 1st % 差值 0.49 0.284 0.491 0.207 42.24 2.2 2.192 2.193 0.001 0.05测量均值 预期值fit_1 ① 预期值fit_3② 差值 ②-① 4.655.25 4.71 -0.54 7.70 7.63 7.50 -0.13 10.30 10.02 10.45 0.43 13.05 12.41 13.15 0.74 15.40 14.80 15.22 0.42 16.2017.1916.26-0.93阶别 系数 数值 系统误差 t 检验回归标准误 自由度 1st b1 2.68 0.05 59.0 0.204 8 2nd b2 -0.09 0.02 -3.8 0.124 7 3rd b2 -0.13 0.23 -0.563rd b3 0.004 0.02 0.17 0.134 6测量均值 预期值fit_1 ① 预期值fit_2 ② 差值 ②-① 4.65 4.85 4.67 -0.18 7.70 7.54 7.62 0.08 10.30 10.22 10.40 0.18 13.05 12.90 12.99 0.09 15.40 15.59 15.41 -0.183.944.1 3.934 -0.166 -4.215.776.008 5.785 -0.223 -3.867.83 7.916 7.818 -0.098 -1.2510.1 9.825 10.103 0.278 2.75<6> 去掉该点后再分析：重复测量误差3.54％,符合要求.多项式回归分析〔见表15〕:最适多项式为二次.表15：修正后的回归分析结果阶别系数数值系统误差t检验回归标准误自由度1st b1 1.97 0.063 31.04 0.201 102nd b2 0.092 0.008 11.47 0.030 93rd b2 -0.027 0.061 -0.463rd b3 0.010 0.005 1.98 0.019 8<7> 再计算线性偏差:由表16可见,所有点都在误差X围内:表16：修正后的线性偏差结果测量均值预期值1st预期值2n d2nd- 1st% 差值2.20 2.03 2.21 0.18 8.383.944.00 3.91 -0.09 -2.345.77 5.97 5.78 -0.18 -3.197.83 7.94 7.84 -0.09 -1.1810.10 9.91 10.09 0.18 1.824.结论:得到缩小X围的线性：注：本文参考##省中医院庄均华《检测系统线性评价方法》讲稿编写。
应用CLSI EP 6-A文件评价血液学危急值项目线性范围李云凤;张淑华;张海涛;王华新【期刊名称】《标记免疫分析与临床》【年(卷),期】2016(023)007【摘要】评估WBC、PLT、HGB出现极端危急值结果的可信度.应用CLSI EP6-A 文件对BC5300全自动血细胞分析仪分析测量范围(AMR)和临床可报告范围(CRR)进行评价.WBC、PLT、HGB的AMR (0.024 ～96.82)×109/L、(9.7 ～970)×109/L、12.5 ～ 251g/L,WBC和PLT CRR上限分别为4841×109/L和48500×109/L.BC5300全自动血细胞分析仪在AMR范围内的测定结果准确,在CRR范围内可向临床发出危急值报告.【总页数】4页(P838-841)【作者】李云凤;张淑华;张海涛;王华新【作者单位】河北黄骅开发区博爱医院,河北黄骅061100;河北黄骅开发区博爱医院,河北黄骅061100;河北黄骅开发区博爱医院,河北黄骅061100;河北黄骅开发区博爱医院,河北黄骅061100【正文语种】中文【相关文献】1.应用CLSI EP12-A2文件评价HBsAg酶联免疫吸附试验试剂盒的分析性能 [J], 韩弋戟;郭明琴;刘梦;侯爵;王钞2.应用CLSI EP5-A2文件评价全自动血液流变学分析仪的精密度性能 [J], 吴双;吴少华;赵桂梅;王秋菊;董翠莲3.应用CLSI EP10-A2文件初步评价细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）试剂盒性能 [J], 展秀君4.应用 CLSI EP10-A2文件对 DXI800化学发光仪性能评价的结果分析 [J], 杨方华;杨宝瑞;马东礼;邓芳梅;孙莉芳5.应用CLSI EP5-A2文件评价ADAMSTM Alc HA-8160全自动糖化血红蛋白仪的精密度 [J], 崔晓阳;朱彩云;周卫;吴敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
方法批内批间低值高值低值高值钒酸盐法均值21.9190.421.4187.3CV 3.58% 2.46% 4.22% 2.57%亚硝酸盐法均值23.2185.622.7186.5CV1.12%2.94%2.36%2.72%胆红素的测定,传统使用重氮试剂法,该法使用时间较早,测值准确,但其试剂稳定性差、副反应明显。
经过多次改良仍然不能消除其比较明显的缺点。
化学氧化法包括钒酸盐氧化法、亚硝酸盐氧化法、过硫酸盐氧化法及综合氧化法等,化学氧化法因其具有抗干扰能力强、线性范围宽、重复性好及准确度高[1]等优点现在是最流行的测定血清胆红素的方法。
目前市场主要使用钒酸盐氧化法和亚硝酸盐氧化法,且两方法使用的原料差别不大,试剂性能也相近,本实验参考CLSI 的部分评价方法,主要通过精密度,线性范围,抗干扰性能三方面比较两试剂的区别,方便实验室或医院根据不同的需要选择。
1材料1.1试剂和仪器仪器使用日立7080全自动生化仪,试剂使用北京利德曼生化股份有限公司生产的总胆红素测定试剂盒(钒酸盐法)以及上海荣盛生物药业有限公司生产的总胆红素测定试剂盒(亚硝酸盐法)。
1.2标准液与质控液标液使用朗道定标血清2350-794,质控液使用朗道质控血清1530-791,1532-616。
1.3样本选用当天新鲜血清,无溶血,脂血(黄疸样本可作为高值样本)。
1.4干扰物抗坏血酸干扰物:100g/L 的抗坏血酸注射液用生理盐水稀释到10g/L。
肝素干扰物:使用12500U/支的肝素抗凝剂。
枸橼酸钠干扰物:使用3.2%枸橼酸钠抗凝剂。
血红蛋白干扰物:为外购干扰试剂。
1.5数据分析使用IBM SPSS Statistics 19数据分析软件进行统计分析。
2实验方法2.1精密度测试参考CLSI EP5[2]文件要求:取高值和低值的血清样本各一份,用两总胆红素试剂测试高低值样本各20次,计算批内精密度。
取高值和低值血清各一份,分装为20份于-20℃左右避光保存。
CLSI发布标准介绍附件：《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则（征求意见稿）》Guideline-Second Edition.2. EP5-A: Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices; Approved Guideline.3. EP6-A: Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures; A Statistical Approach; Approved Guideline.4. EP7-A: Interference testing in clinical chemistry; Approved Guideline.5. EP9-A2: Method comparison and bias estimation using patient samples; Approved Guideline-Second Edition. 每项性能的主要研究方法均采用以上标准和国内实际采用的评价方法相结合的方法。
我中心对于专家起草的指导原则的初稿进行了适当的文字调整，之后将分析性能评估指导原则发给十位相关专业的专家征求意见。
意见返回后我们对专家的回复意见进行了整理，对有些意见进行了采纳，有些意见暂时没有采纳。
采纳的意见，如：线性范围中的“3.4计算公式”的描述采用专家意见将公式的书写进行了文字更改，与CLSI文件一致；“3.3剔除离群值”中的Y的均描述由Yave改为；还有一些文字性错误也进行了修改。
有一些专家意见因为对一些概念还存在分歧，因此暂时未采纳，待经过专家讨论会后再进行确定。
如“检测限评估”中的检测方法“连续测定20次，计算均值加2SD的方法缺少依据，建议采用可报告范围评估下限所提供的方法。
”；“建议将批内/批间精密度”改为“分析内/分析间精密度”；“精密度是用变异系数表示还是用置信区间表示”；参考值：“结果分析中应首先验证是否为正态分布，对于正态分布，则应根据临床应用目采用均值±2SD或均值±3SD，对于偏态分布则应选择单侧95％分位数或双侧2.5％-97.5％分位数”。
定量检测系统线性评价方法— EP6-A法线性范围是分析方法的重要技术指标之一，线性范围越宽，说明该分析方法的性能越好，越适用于临床。
目前评价分析方法线性范围的方法很多，如：目测法、EP6-P法、美国临床病理学家协会设备委员会（CAP-IRC）法、EP6-A法等。
本文主要介绍了目前评价分析方法线性范围最好的方法即EP6-A法。
1. 仪器熟悉阶段在线性评价实验之前，仪器应当在实验室安装并使用相当长的一段时间，以便实验者熟练掌握仪器的操作，并保证仪器经过正确的定标、实验样本经过适当的准备。
如果仪器生产商为实验者提供了培训，这也可以作为本阶段的一个部分。
2. 线性评价实验2.1 实验样本的数目线性评价实验的样本数目依据实验目的而确定：①如果实验目的是验证某方法的线性范围，需要5～7个不同浓度水平的样本，这些样本的浓度必须覆盖厂家申明的线性范围，并且每个样本重复测量2次。
②如果实验目的是建立新方法的线性范围，需要7～11个不同浓度水平的样本，这些样本的浓度必须覆盖预期的线性范围。
一般情况下，新方法线性范围的建立者希望有更多浓度水平的实验样本，并且这些实验样本的浓度应该比预期的线性范围宽20%～30%，这样能确定最合适的线性范围。
此外，再根据检测系统不精密度的大小，每个样本重复测量2～4次。
③多元回归分析法评价线性范围时至少需要5个不同浓度水平的实验样本，并且实验样本越多，就越能准确地评价线性范围。
2.2 实验样本的配制EP6-A文件推荐使用高值和低值浓度的样本按特定的比例精确配制成一系列不同浓度的样本，并且这些样本的浓度可以为等间距排列，也可以为不等间距排列，具体配制方法可以参考文件后的附录A。
在配制过程中，实验者应优先选用移液管法配制实验样本，因为用移液管精确吸量高值、低值浓度样本配制实验样本所产生的误差比称量法、配制复溶溶液法要小。
此外，实验者在吸取小体积溶液时要特别小心。
2.3 实验样本的编号在线性评价实验前，实验样本中分析物浓度可以为未知条件，只是此时必须对每个实验样本进行编号来反映实验样本中分析物浓度的关系。
如果实验样本中分析物浓度是按等间距排列，且最高浓度是最低浓度的n倍时，则可以把最低浓度的实验样本编为1号，其余实验样本的编号按分析物浓度由低到高依次为2、3、4……n。
如果实验样本中分析物浓度不是按等间距排列，实验者必须知道相邻实验样本中分析物浓度之间的关系，此时的样本编号可以不为整数。
2.4 基质效应在实验过程中，实验者还应考虑基质效应对实验结果的影响，因此线性评价的实验样本应该与临床实验室所用的测试标本相似，并且还应不含有对测试方法有干扰的因素如溶血、黄疸、脂血等。
如果无法达到上述条件，则应在实验报告中注明实验样本所采用的处理方法或基质类型。
以下为线性评价实验可能用到的样本类型，注意在评价一些特殊方法的线性范围时要选用合适的基质。
①患者样本混合液：患者样本混合液是理想的实验样本类型，用接近预期线性范围上限、下限的高值、低值浓度样本配制所有实验样本。
②用推荐稀释液稀释的患者样本：用于稀释高值患者样本的稀释液可能对测试结果产生影响，因此必须使用试剂生产商推荐的或者经过实验室证实为可接受的稀释液稀释患者样本。
③在患者样本混合液中添加分析物：如果患者样本中不存在干扰物质，添加的分析物不需要很高的纯度，反之则应在实验报告中标明添加分析物的来源、纯度、预期影响等。
如果添加的分析物为浓溶液，则浓溶液的加入量应尽可能的少（小于总体积的10%），并且记录所使用的溶剂。
④用处理过的低浓度物质或混合物质稀释的患者样本：如果可能，可以使用低浓度的患者样本作为稀释液。
另外，患者样本经过适当处理（如透析、热处理、层析）后可以降低其分析物浓度，但是需要注意这些处理可以改变分析物的基质。
⑤商品化质控物/定标物/线性评价实验物：如果使用这些物质作为实验样本，则应将它们与患者样本同样地进行分析。
如果没有合适浓度的质控物/定标物/线性评价实验物，则可以将高值、低值质控物/定标物/线性评价实验物混合得到中间浓度的实验样本。
但需要注意的是，此时应保证分析物与正常生理状态下的形式一样。
⑥用其他不是推荐稀释液稀释的患者样本：使用这些物质作为实验样本时，应注意基质差异对检测结果的影响，加入的稀释液也应尽可能少。
⑦稀释不足/过度稀释的商品化质控物：同样也应注意基质差异对检测结果的影响，并且影响的程度还随着稀释倍数不同而改变，同时要保证质控物完全溶解。
⑧水溶液：当使用水溶液作为实验样本时，基质效应可能会影响分析物与试剂的反应。
⑨其他溶剂：当使用其他有机溶剂作为稀释剂时，基质效应可能更大。
2.5 样本添加物的选择当实验过程中需要在低浓度患者样本混合液中添加分析物时，需要选择合适的添加物，因为使用其他某些添加物可能会对实验结果产生一定的影响。
EP6-A文件的表1列出了一些物质作为分析对象时的建议添加物质，如以谷氨酸氨基转移酶作为分析物时的建议添加物质为纯化酶，实验者在实验过程中可以参考该表。
此外，在使用某些推荐的添加物时需要考虑其溶解度，如纯胆固醇在血清或水基质中都不易溶解。
2.6 分析顺序及数据收集将实验样本按随机的顺序进行测定。
如果实验结果存在明显的携带污染或漂移，则应采取相应的改进措施。
此外，在实验过程中，必须保证仪器的室内质量控制在控。
全部实验数据尽可能在较短的时间内收集，如可能，单个分析试验最好在一天内做完。
3.实验数据的处理3.1初步数据检查实验数据必须经过可接受性和有用性评估，详细的评估步骤有如下几点：①检查数据是否存在明显大的差异，如果差异产生的原因可以确定为分析或技术上的问题，将发现的问题纠正后重新测定全部实验样本。
②如果没有发现极其明显的分析或技术性结果差异，则应目视检查每个实验样本重复测定的结果是否存在离群点。
首先以样本浓度或其相对浓度为x 轴、测定浓度为y轴绘制散点图，其次再将每个样本重复测定结果的均值画在图上，用手工或计算机方法将这些均值点连接起来，观察各测定值与均值连线的大致偏差，如果某测定值明显偏离组内其他数据的表现，可以判断其为离群点。
③当某个样本的某测定值明显偏离其他测定值时，目视判断它是一个离群点。
④在线性分析前必须将离群点从数据组中删除。
如果发现两个或两个以上不可解释的离群点时，就应怀疑系统的性能，查找问题产生的原因，必要时请求厂家协助。
⑤目视检查xy散点图对于后续的线性评价是相当重要的，它可以很容易地发现非线性或实验样本的浓度范围是否太窄或太宽，同时还可以为后续的统计分析选择最合适的统计方法提供依据。
⑥如果需要，将每个样本的各测定值按检测时间顺序排列，检查各测定值是否存在漂移或趋势性变化。
如果发现明显的偏差，在纠正偏差产生的原因后重新测定整批实验样本，要避免在纠正原因之前选择多次重复测定结果中的“好”数据进行线性分析。
⑦观察相邻样本重复测定结果均值之间的差值。
在线性模型中，各段的斜率大致相等，如果存在斜率增加或降低的趋势则提示非线性。
3.2 离群点检查在本指南中，“离群点”是指某个结果在目视和/或统计学上明显偏离其他测定结果，它仅适用于评价某个重复测定的结果，而不适用于评价某样本多个重复测定的结果或测定结果的均值，出现离群点提示非线性或其他系统误差。
根据离群点的定义可知，判断某个结果是否为离群点的方法有两种：一种是统计学方法，另外一种是通过目视判断。
尽管目前有多种统计学方法用于离群点的判断，但是在大多数情况下，通过目视检查测定值与预期值的散点图即可以发现离群点。
如果数据组中出现一个离群点时可以删除而不需要替换，但是有两个或两个以上的离群点时，则应考虑检测系统的精密度是否达到实验要求，此时必须查找原因并纠正。
4. 线性范围的确定4.3.1 对数据进行多项式回归分析在收集完所有数据后，实验者对数据进行多项式回归分析（可以用统计软件完成，如SPSS的Curve Estimation子菜单），具体步骤如下：①实验者对数据进行一次、二次和三次多项式回归分析，回归方程分别为y=b0+b1x、y=b0+b1x+b2x2、y=b0+b1x+b2x2+b3x3，式中b i为回归系数。
一次回归多项式为线性模型，二次、三次回归多项式为非线性模型。
在二次回归多项式中，b2为非线性系数；在三次回归多项式中，b2和b3为非线性系数。
②实验者对每个非线性系数的斜率求标准误SE i，然后进行t检验，判断非线性系数与0是否有显著性差异。
回归多项式中的b0和b1不需要分析，因为它们不反应非线性。
b2和b3的检验统计量计算公式如下：t=b i /SE i，如果b i为负数，则取t的绝对值。
自由度的计算公式为df=L.R-Rdf，式中L为线性实验的样本个数；R为每个样本重复测定的次数；Rdf为回归分析占用的自由度，一次、二次、三次多项式回归分析的Rdf分别为2、3、4。
③查t值表（见EP6-A文件的附录B，选择双侧检验且α=0.05）。
如果非线性系数b2和b3的检验统计量t<t0.05(df)，则P>0.05，可以认为数据组呈线性关系。
如果二次回归多项式的b2，或三次回归多项式的b2或b3的检验统计量t>t0.05(df)，则P<0.05，可认为数据组呈非线性关系。
需要注意的是，这只表示分析方法在实验样本的浓度范围内为非线性，并不认为因为非线性的存在已经影响到患者的结果。
④如果二次回归多项式的b2和三次回归多项式的b3都是显著的，则需要选择最适多项式，具体方法为比较二次多项式和三次多项式回归标准误（Sy.x，计算公式参考EP9-A2文件）大小，取Sy.x较小的多项式为最适多项式。
4.3.2 非线性度的判断计算每个样本的线性偏离DL i ，公式为DL i = p(x i) - (b0+b1x i),式中x的取值范围为x1…x n；p(x i) 为最适多项式在点x i处的计算值；b0+b1x i为一次回归多项式在点x i处的计算值，因此DL i 是最适非线性模型与线性模型在点x i处的差异。
由公式可知，DL i的单位与分析物的计量单位一致，因此可以将DL i 与预期目标进行比较。
如果预期目标以百分比表示，则可以将DL i 除以已知的样本浓度或多次重复测定结果的均值（使用相对浓度时）再乘以100%。
检查每个样本的DL i 并将其与该浓度水平处规定的误差标准作比较，如果每个DL i 均小于规定的误差标准，虽然回归多项式在统计学上已经检出显著的非线性，但是这还是可接受的。
如果任意一个DL i 大于规定的误差标准，说明分析方法在该浓度水平处可能存在非线性，可以按以下两种方法进行处理：①寻找非线性的原因（样本准备、干扰、仪器校准等）并将其纠正，必要时请求仪器生产商协助。
②观察测定值与预期值的散点图，观察非线性在分析浓度范围内的位置，如果是在两端，可以先删除DL i 太大那个点，并重新进行统计分析，但是这样会缩小线性范围。
