土壤酶活活性测定方法

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。

将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。

用2mL甲苯处理15分钟。

往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。

仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。

与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。

培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。

摇匀，将悬液过滤。

吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。

然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。

以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH3-N 的毫克数来表示脲酶活性。

土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。

用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。

（二）试剂1）1%精胶2）甲苯3）铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O 溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。

4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至 1 L （1mL含50µg NH3-N）。

（三）操作步骤（1）标准曲线绘制取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。

显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。

（2）土壤蛋白酶活性测定称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。

培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。

显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。

以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（µg）表示蛋白酶活性。

土壤磷酸酶测定方法：磷酸苯二钠法（一）方法原理本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生色。

用比色法测定出游离的酚量，用以表示磷酸酶活性。

（二）试剂配制1）0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；2）pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液——取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；5）甲苯；6）0.3％硫酸铝溶液。

（三）操作步骤（1）标准曲线绘制取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg·g-1浓度的酚标准溶液梯度。

30min后比色测定。

绘制标准曲线。

（2）土壤磷酸酶的测定称取5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL 0.5％磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。

后于培养液中加100mL 0.3％硫酸铝溶液并过滤。

吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。

用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在风光光度计上于660nm处比色。

磷酸酶活性，以37℃下24h后1g土壤中释放处的酚的毫克数表示。

土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法（一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。

（二）试剂1）酶促反应试剂：基质5%蔗糖（用pH5.5磷酸缓冲液配制）；甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。

准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。

若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。

再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。

暗处保存备用。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

（2）土壤蔗糖酶测定称取5 g土壤，置于100mL三角瓶中，加10 mL水、1mL甲苯。

摇匀土壤均匀分散后，放置15分钟，加入15mL5%蔗糖-磷酸缓冲液。

摇匀、塞紧，放于37℃恒温箱中，培养24h。

按此操作，用不加土壤的基质和150℃干热灭菌1h 的土壤进行对照试验。

培养结束后，用滤纸过滤，取1mL滤液，按绘制标准曲线方法，测定并由标准曲线其中还原糖含量。

土壤蔗糖酶活性，以1g土壤在37℃时，24h释放出的葡萄糖毫克数来表示。

过氧化氢酶测定(容量法)1. 试剂配制a. 0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释b. 3N 硫酸c. 0.1N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。

2. 操作步骤（1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液。

（2）同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。

（3）将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。

再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。

吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。

3. 结果计算用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为B，用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）为A。

（A-B）×T即为过氧化氢酶活性。

以20min后1g土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。

式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。

（就是最后换算成每克，所以还要测土壤含水量）高锰酸钾溶液标定称取0.2g（准至0.0001g）于105~110℃烘至恒重的基准草酸钠。

溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液[c（KMnO4）=0.1mol/l]滴定，近终点时加热至65℃，继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验。

高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.06700式中c（1/5KMnO4）=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L；m——草酸钠之质量，g；V1——高锰酸钾溶液之用量，mL；V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c（1/5KMnO4）=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。

脱氢酶测定（比色法）取20g土壤于50ml三角瓶中，加0.2g碳酸钙。

混匀后加2ml1%三苯基四唑氯化物，再加水至最大持水量的90%，在恒温恒湿培养箱中（30℃，相对湿度70%）培养24h。

培养结束后，加25ml甲醇，振荡5min，过滤。

再用甲醇多次洗涤漏斗上的土壤，直至获得无色滤液。

合并滤液和洗液并定容50ml或100ml，在分光光度计上于460nm处比色。

标准曲线的绘制：吸取10ml分别含20—300微克的三苯基四唑氯化物溶液，加10mgNaHSO3还原，显色后在分光光度计上于460nm处比色测定并绘制标准曲线。

酶活性表示及计算：以20g土壤中氢离子的微升数表示。

X=av*150.35式中：a——1ml滤液中甲醇的毫克数（查标准曲线）V——滤液体积（ml）150.35——将甲醇量换算成氢的体积（微升）的系数多酚氧化酶活性的测定——邻苯三酚比色法（1）标准曲线的绘制取重铬酸钾标准溶液，用0.5mol/LHCl稀释成各种不同浓度。

定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。

以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

（2）操作步骤称取1g风干土壤样品（过0.25mm筛），置于50mL三角瓶中，然后注入10mL1%邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30℃恒温箱培养2h。

取出后加4mLPH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液，再加35mL乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。