第五章亲和层析

亲和层析（一）原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。

所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

此法具有高效、快速、简便等优点。

（二）载体的基本要求和选择理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。

在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。

纤维素的非特异性吸附强。

聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。

琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。

因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

（三）试剂与配制1．Sepharose 4B2．CNBr（剧毒）3．抗原或抗体4．1Mol/L NaHCO3取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

5．0.1Mol/L NaHCO36．2Mol/L NaOH7．0.01Mol/L pH7.4 PBS0.2Mol/L Na2HPO438.0ml0.2Mol/L Na2HPO4162.0mlNaCl 32.76g加水至4 000ml。

第5章亲和层析第5章亲和层析一、亲和层析的特点：①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。

②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。

③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。

二、基本原理：生物大分子的识别功能：①酶：底物、抑制剂底物类物；②抗体：抗原、病毒细胞；③激素：受体；④外源凝集素：糖蛋白、表面受体蛋白；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白。

1 配基：亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主要有以下几类：①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。

②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。

③染料主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等。

2 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。

3 活化剂：（最常用的几种活化剂）溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、1，4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐等。

三、亲和层析介质的制备：1 配基的选择（配基必备条件）：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配基和目标分子的专一结合特性。

②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。

③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。

④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。

常用的配基：①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）；②抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白；③外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；④核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白。

2 载体的选择（理想载体的特性）：①不溶于水，但具有高度亲水性。

②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。

③机械性能良好，在一定静水压下不变形。

④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。

亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。

本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。

一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。

其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。

通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。

2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。

固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。

3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。

当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。

4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。

二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。

以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。

常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。

2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。

免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。

3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。

常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。

4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。

常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。

三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。