实例解析——高效液相色谱(HPLC)
一、原理
利用不同物质在两相中（液液、液固、离子交换、尺寸排阻）具有不同的分配系数，当二者相对运动时候，物质在两相中反复多次分配，从而使得物质得到完全分离
二、适用范围
高沸点、热不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物、离子型样品、生化样品三、特点
高压、高效、高灵敏度
四、仪器组成
流动液贮存提供脱气，输液系统、进样系统、分离系统、检测系统，控制记录系统贮液瓶、高压泵、进样器、分离柱、检测器、记录仪
五、仪器选择
由实验条件确定是选用二元高压还是四元低压、一般来说，二元高压的准确度较高。四元低压是先将样品按比例混合再泵入，而二元高压是先泵入不同比例的溶剂再混合。确定采用的脱气系统，一般采用在线脱气。确定进样方式，人工手动六通阀进样，还是进样针自动进样，一个适用于少量样品，一个适用于大量样品。
选择检测器，如果是有较强的紫外吸收的可用紫外可见检测器(二极管阵列检测器)，如果是芳香族化合物，可选用荧光检测器，对于离子可采用电导检测器。
六、实验条件优化
配置待测物质的标准溶液
1、色谱柱的确定
分析样本确定是采用何种类型的色谱柱
(1)分配色谱，两项间分配系数
流动相选用极性的物质（甲醇、乙腈、水）则固定相选择非极性物质。一般用
C18 ODS柱。
(2)吸附色谱，
(3)离子交换色谱
各种离子与树脂上交换集团的交换能力不同。固定相：离子交换树脂，流动相
为无机酸、无机碱。常用于分离离子或者可解离的化合物
(4)排阻色谱法
配置含待测物质的标准品溶液，采用不同C18柱分离，检测，对照不同色谱图像，可得到分离效能最高的色谱柱
2、最佳流动相梯度洗脱程序的确定
梯度洗脱：按照一定的程度，不断改变流动相中个溶剂组成的比例以改变流动相的
极性。将色谱柱上不同的组分洗脱出来。
配置不同的梯度洗脱方案，用标准溶液进行试验，并选取能达到最高分离效能的梯
度洗过方案作为最佳流动相梯度洗脱程序
3、流动相的确定
在分离效能相似条件下选择更经济、毒性小的流动相
4、流速确定
流速太大，待分离组分来不及与固定相充分作用，故其中的组分较易被洗脱下来，出峰时间变短，而且柱压比较高，会引起泵负荷的增加，进而导致色谱柱的使用命
的缩短，色谱峰的分离度变差。流动相流速太低时，会导致
色谱柱柱效降低，使得待测物质难洗脱，各个组分保留时间延长，容易引起色谱
峰变形或者导致色谱峰拖尾严重。用不同梯度的流速实验确定最佳流速
5、柱温确定
柱温太低会导致色谱组分在两相中的扩散速度大为减小，分配不能迅速平衡，峰变
宽，柱效下降，延长分析时间。但温度过高，出峰过快，可能会导致峰重叠。设置
温度梯度进行试验，确定最佳温度
6、对于二极管阵列检测器确定最佳检测波长
测定在不同待测物质最大吸收波长下标准样的出峰情况，选择能使大部分标准样品
出峰的波长作为最佳波长
七、方法评定
(1)确定色谱条件后的色谱
(2)测定分离度R是否符合要求，测定拖尾因子T是否符合要求
(3)侧定不同待测物质的标准曲线
(4)验证该方法的精密度RSD是否在2%以内
八、定性分析
九、定性分析
在最优条件下测定试样中待测组分的谱线情况
1、和和文献相比较，比较保留时间初步确定是否含有待测物质
2、在相同测定条件下，在待测样品中加入可能含有的待测物质的标准样品，测定谱线，
如果在向应保留时间处的峰增高，则可证明该物质的存在
3、和具有定性分析的仪器相连用，例如傅立叶变换红外（FTIR）、质谱(MS)进行检测。
十、定量分析
测量不同质量的标准物的谱线，用公式f=m/s得到待测物质的绝对校正因子
在确定待测物质之后，选择采用的定量分析方法：标准曲线法，内标法，标准加入法
1、标准曲线法（外标法）
用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全
相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代
替。
特点：操作和计算简便，不必用校正因子，但要求色谱操作条件稳定，进样重现
性好。
2、归一化法
测定不同纯标准样品的相对质量校正因子Fi，Xi%=FiAi/∑FiAi×100%，可以不需要
知道进样量。但是需要：1、各组分都应流出，且检测器有信号2、与进样量无关3、
不用标样4、简单
3、内标法
在用内标法做色谱定量分析时，先配制不同重量比的被测组分和内标样品的混合物
做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。
在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的一致。
内标物的选择：
（1）试样中不含有该物质；
（2）与被测组分性质比较接近；
（3）不与试样发生化学反应
（4）出峰位置应位于被测组分附近。
十一、质量控制和保证
1、检出限
最小检出限(Detection Limit或Limit of Detection)一般是指特定分析方法在给定的置信度区间内可以从样品中检出待测物质的最小浓度或最小含量，通常规定为信号值是噪音的3倍(S/N=3)。
2、回收率
加入一定已知量的标准物质测定其回收率对方法的准确度进行评价。看是否符合要求
