双荧光素酶报告实验820

双荧光素酶实验步骤及原理《双荧光素酶实验步骤及原理》
嘿，大家好呀！今天我来给大家讲讲双荧光素酶实验，这可真是个有趣的玩意儿呢！
先来说说原理哈，就好像是两个小伙伴，一个叫荧光素酶 A，一个叫荧光素酶 B，它们各自有着自己的特点和任务呢。

当我们给它们特定的东西时，它们就会发出亮光，我们就可以通过观察这些亮光来了解一些情况啦。

那具体步骤呢，就像我们做一件很精细的手工活儿一样。

首先呀，得准备好各种材料，就像我们要做一个漂亮的手工艺品得先把纸呀、剪刀呀啥的都准备好。

然后呢，把要研究的东西和这两个荧光素酶小伙伴放在一起，就像是把不同颜色的纸拼在一起。

接下来就是等待啦，等它们反应一会儿，就像等胶水干一样。

最后呢，用专门的仪器去检测那些亮光，看看它们都告诉了我们什么信息。

我记得有一次我做这个实验的时候，特别紧张，就好像我是个小心翼翼的糕点师，生怕哪个步骤做错了就毁了整个作品。

我仔细地量着每一种试剂，眼睛紧紧盯着刻度，就怕有一点点偏差。

当我把它们混合在一起的时候，心里还默默祈祷着一定要成功呀。

然后等待的过程中，我感觉时间过得好慢好慢，就像在等一个重要的消息一样。

终于到了检测的时候，我紧张得手都有点抖，当看到仪器上显示出的数据时，我开心得差点跳起来，就像我精心制作的糕点终于完美出炉了一样！
总之呢，双荧光素酶实验就是这样一个有趣又有点小挑战的事情，大家如果有机会一定要试试哦！嘿嘿，这就是我给大家分享的双荧光素酶实验啦，希望你们也能觉得有意思呀！。

第1篇摘要：双荧光素酶报告系统（Dual Luciferase Reporter Assays, DLRA）是一种广泛应用于生物科学研究中的细胞功能检测技术。

通过分析荧光素酶的活性，可以评估细胞内信号通路的激活情况，从而研究基因表达调控、细胞增殖、细胞凋亡等多种生物学过程。

本文将对双荧光素酶报告数据分析的方法、注意事项以及结果解读进行详细阐述。

一、引言双荧光素酶报告系统是一种基于荧光素酶活性的细胞功能检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

荧光素酶是一种在细胞内自然存在的酶，能够将荧光素底物催化生成荧光物质。

在双荧光素酶报告系统中，通常使用两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FL）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, RL）。

FL的荧光强度通常作为报告基因的活性，而RL的荧光强度则作为内参基因，用于校正实验误差和细胞活力。

二、实验原理双荧光素酶报告系统的基本原理是：将目的基因与荧光素酶基因（FL或RL）的启动子连接，构建报告基因质粒。

将报告基因质粒转染到细胞中，细胞内荧光素酶的活性与目的基因的表达水平成正比。

通过检测细胞内两种荧光素酶的荧光强度，可以评估目的基因的表达水平。

三、实验方法1. 构建报告基因质粒（1）设计荧光素酶基因（FL或RL）的启动子序列，并与目的基因序列连接。

（2）将连接好的基因序列克隆到载体质粒中，构建报告基因质粒。

2. 细胞培养与转染（1）培养细胞至对数生长期。

（2）用脂质体或电穿孔等方法将报告基因质粒转染到细胞中。

3. 荧光素酶活性检测（1）收集转染后的细胞，用荧光素酶底物进行孵育。

（2）使用荧光光度计检测细胞内FL和RL的荧光强度。

4. 数据分析（1）计算FL和RL的相对荧光强度（RFU）。

（2）计算目的基因的表达水平（FL/Rlu）。

四、数据分析方法1. 相对荧光强度（RFU）计算RFU = 荧光强度 / 标准曲线斜率2. 目的基因表达水平计算目的基因表达水平 = FL/Rlu其中，FL为FL的相对荧光强度，Rlu为RL的相对荧光强度。

植物双荧光素酶报告基因实验步骤引言：植物双荧光素酶（dual-luciferase reporter gene）是一种广泛用于研究基因表达和调控的实验技术。

这种技术主要基于荧光素酶酶促反应原理，通过测量两种荧光素酶的活性来评估靶基因的调控效应。

本实验将详细介绍植物双荧光素酶报告基因实验的步骤。

材料：1.载体DNA：包含荧光素酶的荧光素酶基因、荧光素酶底物和载体DNA。

2.受试基因DNA：靶基因的DNA序列。

3.发光底物：用于检测荧光素酶活性的底物。

实验步骤：1.载体构建a.将荧光素酶基因和荧光素酶底物的DNA序列分别克隆到载体DNA 上，构建荧光素酶报告基因载体。

b.对构建好的载体进行测序，确认序列的准确性。

2.细胞培养a.选择合适的植物细胞系进行培养，如人类表皮细胞（HEK293细胞）或真菌菌株（酵母）。

b.在无菌条件下，将细胞培养在含有适当培养基和抗生素的培养皿中。

3.转染a.将刚构建好的荧光素酶报告基因载体和受试基因DNA利用合适的转染试剂转染至目标细胞中。

b.转染条件需要根据所选细胞系的特性进行优化，如转染剂浓度、转染时间和转染温度。

4.荧光素酶检测a.收集转染后的细胞，以适当的方法裂解细胞膜并提取细胞内的蛋白质。

b.在离心管中先加入荧光素酶底物A，然后加入荧光素酶底物B，并加入含有缓冲液的发光底物。

c.利用荧光素酶检测仪测量反应体系的发光强度。

d.记录发光强度，并进行数据统计和分析。

5.数据分析a.根据荧光素酶底物的发光强度计算荧光素酶活性。

b.根据测得的荧光素酶活性，分析靶基因的调控效应。

c.可以利用多种方法对数据进行统计学分析，如方差分析和配对t 检验。

结论：植物双荧光素酶报告基因实验是一种有效的研究基因调控的实验技术。

通过测量荧光素酶的活性，我们可以评估靶基因在特定条件下的表达水平。

这项实验可以帮助我们更好地了解基因调控机制，为相关研究提供重要的数据支持。

双荧光素酶报告基因检测实验过程在生物实验室里，双荧光素酶报告基因检测可真是一门有趣的技术。

听起来复杂，其实也不难，咱们就来聊聊这其中的酸甜苦辣吧。

双荧光素酶就像两个好朋友，默契配合，帮助我们探测基因的活动。

想象一下，一对小伙伴儿，打着灯笼，帮你照亮那条神秘的基因小路。

你看看，这灯光一亮，哎呀，所有的秘密都暴露无遗了！咱们实验的第一步就是准备样品。

这个过程呢，就像做一顿美味的家常菜，得有好食材。

我们需要选择适合的细胞或者组织，像是挑选新鲜的蔬菜水果一样，小心翼翼。

然后把这些样品处理得干干净净，保证它们能发出耀眼的荧光。

你瞧，这准备工作就像打好基础，只有基础打牢，后面的实验才会顺顺利利。

就这点小细节，可别大意了哦。

就是要把我们的双荧光素酶基因转染到细胞里。

转染的过程其实挺像是给细胞植入一个小秘密，嘿嘿，细胞可不知道它们要接收什么新鲜玩意儿。

一旦转染成功，细胞就开始疯狂表达这两个荧光素酶，像是开了趴一样热闹。

不久后，这些小家伙儿就会开始发光，灯火通明。

这时候，你可能会想，“哇，真的发光了？”没错，这就是科学的魅力，真是让人惊叹不已啊。

然后，我们就得用荧光显微镜来观察这些细胞。

看着这些发光的小家伙，就像看星星一样，特别美妙。

这里的关键在于调节显微镜的参数，光亮得刚刚好，不多不少。

太亮了可能看不清，太暗了就显得有些无趣。

就像调味料，得掌握好分寸。

这个过程有点像是在做一场灯光秀，要把每一个细节都调到最佳，才能让你眼前一亮。

然后呢，咱们得定量分析一下这些荧光的强度。

说白了，就是要算一算，哪些基因在欢欢喜喜地工作，哪些可能在“打瞌睡”。

这可不是简单的算术题，而是一场数据的盛宴。

把所有的荧光强度都记录下来，汇总成一个漂亮的数据表。

看到那些图表的时候，你会觉得，哎，自己的努力真是没有白费。

每一个数字都像是一颗颗璀璨的宝石，闪闪发光。

哦，对了，实验过程中还得小心翼翼，不要让外部因素影响到结果。

就像在厨房里，锅得掌握好温度，火候过了就糟糕了。

双荧光素酶检测启动子活性试验
服务简介
双荧光素酶报告基因试验（luciferase Assay）目前由两个主要的应用方向，第一是
检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。

某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。

双荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，第二是研究微小
RNA(microRNA)对于靶基因的调控，通过生物信息学方法预测microRNA潜在的靶基因以及干预位点序列，并设计合适的microRNA质粒或干预片段，同时构建靶基因的报告基因质粒，二者同时转染细胞，这是确定microRNA是否能影响（上调或下调）靶基因的首选研究方法。

实验方案：
1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic（转录因子与靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase质粒（微小RNA与靶基因）
2）将要检测的转录因子表达质粒（或microRNA质粒）与报告基因质粒共转染293细
胞或目的细胞。

如果此转录因子（或microRNA）能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会
表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

双荧光素酶报告实验实验名称：双荧光素酶报告实验实验基础知识：荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。

在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。

没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。

双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。

检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。

通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。

报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。

通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。

理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。

这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。

相反, 结合萤火虫( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠( Renilla reniformis ) 双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。

实验原理：将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。

然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。

机制研究的利器——双萤光素酶报告基因检测实验想验证miRNA与靶基因的作⽤？ --双萤光素酶报告基因检测想了解miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作？--双萤光素酶报告基因检测想知道转录因⼦对下游基因的作⽤？ --双萤光素酶报告基因检测。

⽂章中经常看到、研究中经常⽤到、平时经常听到。

不过很多⼩伙伴有时还会⼀脸懵，今天我们就来详细说说双萤光素酶报告基因检测实验。

1双萤光素酶报告系统介绍Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统：在细胞中同时表达萤⽕⾍萤光素酶(Firefly Luciferase简称F-Luc)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase简称R-Luc)，其中F-Luc作为报告基因反应⽬的基因表达的改变，R-Luc作为内参基因，为实验提供统⼀基准线（减少内在变化因素如培养细胞的数⽬，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。

所构成的报告系统⼴泛⽤于基因调控、⾮编码RNA靶向互作等研究领域。

 F-Luc表达框的上游启动⼦区域插⼊不同功能序列，通过转录起始条件改变造成其报告萤光的变化。

F-Luc的3’UTR区域替换成靶基因的3’UTR，过表达microRNA（降解mRNA或者翻译抑制），可以反映是否存在靶向互作。

2 应⽤介绍2.1miRNA靶基因验证实验原理miRNA主要通过作⽤于靶基因的3’UTR起作⽤（降解或抑制翻译），将⽬的基因3’UTR（野⽣型和结合位点突变型）序列构建⾄载体中报告基因F-Luc的3’端，通过⽐较过表达miRNA后，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降还是不变），来确定miRNA与靶基因3’UTR的作⽤位点。

案列介绍题⽬: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation tofoster lung metastasis of liver cancer期刊: Nature Communications⼩结：验证B4GALT3（β-1,4-半乳糖基转移酶III）基因具有miR-1247-3p的靶向结合位点。

双荧光素酶报告实验实验名称：双荧光素酶报告实验实验基础知识：荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyralis的萤火虫体内的荧光素酶。

在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。

没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。

双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。

检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。

通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。

报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。

通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。

理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。

这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。

相反, 结合萤火虫( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠( Renilla reniformis ) 双荧光素酶的系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。

实验原理：将目的基因3’UTR区域或者lncRNA序列构建至载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。

然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。