双荧光素酶报告基因检测系统-promega

双荧光素酶报告系统作者：windyrain 2008-05-29 21:54:33标签：杂谈双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。

但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。

Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。

双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。

系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。

对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。

双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。

介绍有内参照双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。

检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。

通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。

报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。

通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。

使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。

但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。

双荧光素酶报告基因实验步骤实验目的：本实验采用双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告系统，探究基因调控机制。

通过构建表达报告基因的质粒，研究不同因素对基因转录的影响。

实验材料：1. 双荧光素酶检测试剂盒（Promega）2. 293T细胞系3. Lipofectamine 2000转染试剂4. 培养基（DMEM + 10% FBS）实验步骤：1. 构建表达报告基因的质粒。

选择含有目标基因启动子区域的DNA片段，与质粒载体pGL3-基因报告载体连接，形成表达质粒pGL3-目标启动子-火萤酶（Luciferase）。

2. 细胞培养。

将293T细胞接种于6孔板中，培养至70-80%的稳定生长。

注意，细胞仅用到2×105个，否则检测结果会受内源性酶的影响。

3. 细胞转染。

将转染试剂与质粒混合，加入到细胞培养皿中。

注意，Lipofectamine 2000转染试剂与质粒的比例应按照转染试剂说明书进行调整。

4. 点亮荧光素酶（Luciferase）。

在细胞转染后48小时，加入荧光素酶检测试剂和积木酶抑制剂，使细胞产生发光，并通过微量板阅读器记录荧光值。

5. 关闭荧光素酶（Luciferase）。

在荧光素酶检测试剂作用后加入积木酶检测剂，称为“阻滞液”，使细胞发出的光信号被阻断。

加入Renilla荧光素酶检测试剂，使细胞重新产生新的发光信号，并通过微量板阅读器记录荧光值。

6. 数据统计。

按照公式计算相邻荧光信号的比值（荧光素酶/Renilla荧光素酶），以此作为表达目标启动子的相对活性。

（注意，双荧光素酶检测试剂盒中已包含此项标准）实验结果：通过双荧光素酶报告系统，研究了不同生物因素对基因转录的影响。

在细胞实验中，通过记录不同重复单元（replicate）的相对活性，为科研人员提供基因调控机制的新思路。

（数据统计请参照附表）结论：本实验采用双荧光素酶报告系统，通过构建表达报告基因的质粒，检测对基因转录的影响。

Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统产品包装目录号价格Dual-Luciferase® Reporter Assay System 100 次检测E19101000次检测E1960Dual-Luciferase® Reporter Assay System10-pack1000次检测E1980Dual-Luciferase® Reporter 1,000 AssaySystemPassive Lysis 5× Buffer 30ml E1941描述：普洛麦格公司的双荧光素酶报告基因(DLR™)检测系统为双报告基因检测提供有效手段。

在DLR™ 检测中，萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶和海肾(Renilla reniformis)荧光素酶可在单个样品中连续测量。

测量过程是：加入荧光素酶检测试剂II (LARII)产生萤火虫荧光信号，信号持续至少1 分钟，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。

定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop & Glo®试剂，将上述反应猝灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二次测量。

如果使用带有试剂自动注射器的荧光发光计，两个检测可在4秒内完成。

在DLR™检测系统中，两个报告基因产生的线性检测范围均在小于10-18摩尔的灵敏度范围内，两个报告基因在实验宿主细胞内均无内源活性。

另外，此系统中一体化形式的双荧光素酶检测既可快速定量检测转染细胞，也可用于快速定量检测无细胞转录/翻译反应体系中的两个报告基因。

普洛麦格公司的合成海肾基因phRL系列：普洛麦格公司曾为双荧光素酶报告基因（DLR™）检测系统设计了萤火虫荧光素酶报告基因载体和野生型海肾报告基因载体pRL系列。

phRL和pRL系列载体均提供海肾荧光素酶的组成性表达，可与任何实验用萤火虫荧光素酶载体组合，共同转染哺乳动物细胞。

双荧光素酶报告基因启动子活性分析（双荧光素酶报告基因实验）一、实验目的：分析启动子活性二、实验原理：荧光素酶报告基因的活性用Dual-Luciferase?Reporter AssaySystem（Promega）试剂盒来检测。

利用单通道多标记荧光检测仪测定荧光素酶活性。

在双荧光素酶系统中，除了用于检测启动子活性的萤火虫荧光素酶外，另外一种组成型表达的Renilla荧光素酶质粒PRL-TK也被同时转染入细胞内作为内参。

三、实验材料：Dual-Luciferase?Reporter Assay System （Promega）试剂盒，PBS，细胞裂解液，96孔，四、实验设备：单通道多标记荧光检测仪五、实验方法及步骤：1）启动子萤光素酶报告载体与共转染质粒按照质量等比例、总量0.8μg的原则转染细胞，36h后收获细胞；2）96孔板吸弃细胞培养基，PBS冲洗细胞一次，加入1×PLB细胞裂解液20μl，置于室温震荡裂解20min；3）轻轻吹打细胞，取10μl细胞裂解液加入50μl Luciferase Assay Reagent，轻轻震荡混匀，立刻置于单通道多标记荧光检测仪中测定Firefly Luciferase活性；4）读数后立即加入50μl Stop & Glo?Reagent轻轻震荡混匀，读取Renilla Luciferase活性；5）所得的结果为各个实验样品的Firefly Luciferase活性与Renilla荧光素酶活性的比值。

每个实验组重复3-4孔，整个实验独立重复3次。

实验结果均为3次独立的实验结果的平均值。

所有的结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。

六、注意事项1.做好对照。

2.多做几个复孔，求平均值。

七、补充知识点双荧光素酶报告基因实验1.试剂盒：Dual-Glo TM Luciferase Aassy System（promega E2920）组成如下：? Dual-Glo?萤光素酶缓冲液Dual-Glo?萤光素酶底物（冻干粉）Dual-Glo?Stop-Glo?缓冲液Dual-Glo?Stop-Glo?底物2.报告基因的作用细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或“效果”3.原理–制备含有luc/ R luc的DNA–转染–提供刺激–测量荧光–用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=实验的(萤火虫萤光素酶)/ 对照的（海肾萤光素酶)4.载体- 萤火虫萤光素酶载体pGL3 家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-Promoter海肾萤光素酶报告基因载体pRL-TK5.试剂制备–将Dual-Glo? 萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo? 萤光素酶底物中，Dual-Glo? 萤光素酶试剂，分装后-70℃保存，避免反复冻融–用Dual-Glo? S top &Glo? 缓冲液按1:100 稀释Dual-Glo? Stop &Glo? 底物（现用现配）–所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于–20°C两步加入试剂：加，读，加，读6.检测步骤：实验前，将Dual-Glo? 萤光素酶试剂平衡到室温1.确认使用的细胞板可以用于荧光检测2.测萤火虫荧光素酶活性：向待测细胞板每孔中加入与培养基等体积的Dual-Glo? 萤光素酶试剂，混匀。

promega双荧光素酶说明书
Promega双荧光素酶说明书
一、简介
Promega双荧光素酶系统是一种灵敏的报告基因检测工具，用于检测细胞
或组织中荧光素酶的表达水平。

该系统包括荧光素酶基因报告质粒、荧光素酶活性检测试剂和荧光检测仪。

通过将荧光素酶基因报告质粒转染到细胞中，可以监测荧光素酶的表达水平，从而了解基因的表达情况。

二、主要特点
1. 高灵敏度：可检测低至 pg荧光素酶的活性。

2. 快速：可在短时间内完成检测。

3. 简便：无需特殊设备，只需一台荧光检测仪即可完成检测。

4. 稳定：荧光素酶基因报告质粒可在细胞内稳定表达，提供可靠的检测结果。

三、使用方法
1. 转染荧光素酶基因报告质粒：将荧光素酶基因报告质粒转染到细胞中，按照说明书操作。

2. 培养细胞：在适宜条件下培养细胞，使荧光素酶表达。

3. 收集细胞：离心收集细胞，并洗涤去除培养基中的荧光素酶抑制剂。

4. 检测荧光素酶活性：将细胞悬浮在检测缓冲液中，加入荧光素酶活性检测试剂，充分混匀后进行荧光检测。

5. 数据分析：通过荧光检测仪获取数据，并使用相关软件进行数据分析。

四、注意事项
1. 请在专业人员的指导下操作。

2. 避免直接接触试剂，以免对皮肤和眼睛造成刺激。

3. 试剂应存放在阴凉干燥处，避免阳光直射和高温。

4. 转染荧光素酶基因报告质粒时，应遵循无菌操作原则，避免交叉污染。

双荧光素酶报告基因分析1. 介绍荧光素酶报告基因表达的转录调控常被用来研究培养细胞的生物学特性。

荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的荧光素酶。

Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。

通常，报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。

实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。

实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物分别与检测试剂反应可以使灵敏度最大化。

由于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于制药和生物技术产业中。

双荧光素酶报告基因检测系统适配于各种培养哺乳细胞的培养基，如1640，MEM，DMEM，F12等。

这些试剂与被动裂解液所附带的试剂盒，可以从Promega试剂盒中分开，单独使用。

具有超高灵敏度和超宽线性范围的Veritas™微孔板发光检测仪特别适合DLR 报告基因检测系统，Veritas™软件中预装了DLR 的检测程序使得安装更为方便，内置自动加样器使得应用更为简单。

Veritas™微孔板发光检测仪使用荧光素酶检测试剂II (LAR II)最低可以检测到1X10-19 mol 荧光素酶分子，使用Stop & Glo®试剂可以检测到1X10-18 mol 海肾荧光素酶分子，检测线性范围分别为8 和6 个数量级。

所有的检测均采用纯化的重组萤火虫荧光素酶(E1701)和纯化的重组海肾荧光素酶。

图1－3 使用Promega 公司Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统，萤火虫荧光素酶(1x10-19 到1x10-11 mol)和海肾荧光素酶(1x10-14 mol)在Modulus™仪上测量结果。

双荧光素酶报告基因双荧光素酶报告基因（双荧光素酶报告基因，Dual-Luciferase Reporter Assay System）是一种用于研究基因调控和信号转导的常用实验技术。

该技术利用双荧光素酶作为报告基因，通过测定其荧光素酶活性来分析靶基因的启动子活性、miRNA的靶向调控等生物学过程。

本文将介绍双荧光素酶报告基因的原理、操作步骤以及应用范围，希望能够为相关研究人员提供一些参考和帮助。

原理。

双荧光素酶报告基因系统主要由两种荧光素酶构成，火萤酶（Luciferase）和甲氧基荧光素酶（Renilla）。

其中，火萤酶作为实验基因的报告基因，用于研究感兴趣基因的启动子活性或miRNA的靶向调控；而甲氧基荧光素酶则作为内参基因，用于校正转染效率和荧光素酶活性的差异。

通过在细胞中共转染携带不同启动子序列的火萤酶报告基因质粒和甲氧基荧光素酶质粒，再分别加入两种底物来测定其荧光素酶活性，从而得出感兴趣基因的表达水平和启动子活性。

操作步骤。

1. 细胞培养和转染，将感兴趣的细胞系进行培养，并在适当的时机进行转染，使其表达双荧光素酶报告基因系统中的火萤酶和甲氧基荧光素酶。

2. 荧光素酶活性检测，在转染后的适当时间点，加入火萤酶底物和甲氧基荧光素酶底物，分别测定其荧光素酶活性。

3. 数据分析，根据实验结果，计算出火萤酶活性与甲氧基荧光素酶活性的比值，得出感兴趣基因的表达水平和启动子活性。

应用范围。

双荧光素酶报告基因系统广泛应用于基因调控和信号转导等研究领域。

例如，用于筛选miRNA的靶基因、研究转录因子对启动子的调控、评价药物对基因表达的影响等。

此外，双荧光素酶报告基因系统还可以用于高通量筛选和药物研发等领域。

结语。

双荧光素酶报告基因系统作为一种灵敏、快速、准确的基因表达分析技术，已成为生物学研究中不可或缺的工具。

通过测定火萤酶和甲氧基荧光素酶的活性，可以全面地了解靶基因的表达水平和启动子活性，为研究人员提供了重要的实验数据。

双荧光素酶报告基因检测基因检测是一种通过检测个体基因组中的特定基因或基因组序列来评估个体患病风险、遗传特征或药物反应的技术。

随着科学技术的不断进步，基因检测技术也在不断发展和完善。

其中，双荧光素酶报告基因检测技术是一种常用的基因检测方法之一，它通过双荧光素酶作为报告基因来检测目标基因的表达水平，具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点，被广泛应用于基因功能研究、疾病诊断和药物筛选等领域。

双荧光素酶报告基因检测技术的原理是利用双荧光素酶（Dual-Luciferase）作为报告基因，通过测定其荧光素酶活性来间接反映目标基因的表达水平。

该技术通常包括两个步骤，首先，将双荧光素酶基因和目标基因的启动子序列连接在一起，构建成双荧光素酶报告基因表达载体；然后，将该表达载体转染到细胞中，利用双荧光素酶检测系统来测定双荧光素酶的活性，从而反映目标基因的表达水平。

通过比较不同条件下的双荧光素酶活性，可以评估目标基因在转录水平上的调控情况，为进一步研究基因功能、疾病机制和药物筛选提供重要信息。

双荧光素酶报告基因检测技术具有许多优点。

首先，该技术具有高灵敏度和高特异性，能够准确地检测目标基因的表达水平，对于低表达水平的基因也能够进行有效检测。

其次，双荧光素酶报告基因检测技术还具有高通量的特点，能够同时检测多个基因的表达水平，从而提高实验效率。

此外，该技术还可以应用于活细胞中，能够实时监测基因的表达动态变化，为研究基因调控网络和信号转导通路提供重要的实验手段。

双荧光素酶报告基因检测技术在科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。

在科学研究领域，该技术被广泛应用于基因功能研究、信号转导通路分析、药物筛选和毒性评价等方面。

例如，科研人员可以利用双荧光素酶报告基因检测技术来研究某一基因在特定疾病发生发展过程中的表达变化，探索其潜在的治疗靶点。

在临床诊断领域，该技术可以用于评估患者的遗传风险和药物反应，帮助医生制定个性化的治疗方案，提高治疗效果和减少不良反应。

Dual-luciferase reporter assay kit(1) Promega公司双荧光素酶报告基因(DLR TM)检测系统试剂盒组分：Promega的DLR TM检测试剂盒专利给出了Luciferase assay bufferII和Stop & Glo® buffer的相关组分和浓度范围，没有具体的数值。

我在专利和文献中也没有找到针对DLR TM检测试剂盒中的passive lysis buffer的成分。

Assay protocol：(2) 文献中用到的几种非商业性双荧光素报告基因检测系统细胞裂解液（cell lysis buffer）配方：(a)源自promega公司的单荧光素酶报告试剂盒：T ris-phosphate（PH7.8）25mMEGTA or EDTA2mMDTT2mMBSA1mg/mlTriton X-1001%Glycerol10%(b) Make the following stock solutions.1M HEPES pH 8 (室温RT)1M DTT (4℃)100mM MgCl2 (RT)裂解液第二种配方（100ml体系）：来自/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=250710ml 1M HEPES PH80.5ml 1M DTT2ml 100mM MgCl22ml Triton X10085ml distilled water反应缓冲液：Firefly Luciferase Assay；Renilla Luciferase Assay Reagent。

a>“A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis”文献作者给出了2种荧光素酶活性检测的反应试剂配方，并与promega公司试剂盒进行了效果比较，检测效率和灵敏度都很高，不逊于promega产品。

机制研究的利器——双萤光素酶报告基因检测实验想验证miRNA与靶基因的作⽤？ --双萤光素酶报告基因检测想了解miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作？--双萤光素酶报告基因检测想知道转录因⼦对下游基因的作⽤？ --双萤光素酶报告基因检测。

⽂章中经常看到、研究中经常⽤到、平时经常听到。

不过很多⼩伙伴有时还会⼀脸懵，今天我们就来详细说说双萤光素酶报告基因检测实验。

1双萤光素酶报告系统介绍Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统：在细胞中同时表达萤⽕⾍萤光素酶(Firefly Luciferase简称F-Luc)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase简称R-Luc)，其中F-Luc作为报告基因反应⽬的基因表达的改变，R-Luc作为内参基因，为实验提供统⼀基准线（减少内在变化因素如培养细胞的数⽬，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。

所构成的报告系统⼴泛⽤于基因调控、⾮编码RNA靶向互作等研究领域。

 F-Luc表达框的上游启动⼦区域插⼊不同功能序列，通过转录起始条件改变造成其报告萤光的变化。

F-Luc的3’UTR区域替换成靶基因的3’UTR，过表达microRNA（降解mRNA或者翻译抑制），可以反映是否存在靶向互作。

2 应⽤介绍2.1miRNA靶基因验证实验原理miRNA主要通过作⽤于靶基因的3’UTR起作⽤（降解或抑制翻译），将⽬的基因3’UTR（野⽣型和结合位点突变型）序列构建⾄载体中报告基因F-Luc的3’端，通过⽐较过表达miRNA后，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降还是不变），来确定miRNA与靶基因3’UTR的作⽤位点。

案列介绍题⽬: Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation tofoster lung metastasis of liver cancer期刊: Nature Communications⼩结：验证B4GALT3（β-1,4-半乳糖基转移酶III）基因具有miR-1247-3p的靶向结合位点。

Dual-Luciferase® Reporter Assay试剂准备Luciferase Assay Buffer II 10mlLuciferase Assay Substrate 1vialStop & Glo® Buffer 10mlStop & Glo® Substrate, 50X 200ulPassive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH0中，40C2保存（一个月）。

R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay BufferII 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。

3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo® Substrate加入49体积的Stop& Glo® Buffer中（-200C保存15天）。

（每次试验需要100ul）细胞处理1. 吸除细胞培养液2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞3. 加入1X PLB（推荐用量）4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。

重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。

pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。

具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。

1. 将质粒DNA(3.2µg)与phRL-tk (0.8µg)按1:4混合后为A液，混匀30s，PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s;2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min;3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB混合液，每孔0.8mL;4. 6h后，加入2mL完全DMEM;5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM;6. 100µg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 µM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）7. 采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性，检测仪器为化学发光仪(30IOC化学发光测定仪)，所有实验严格平行操作。

双荧光素酶报告基因测定法一、引言双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因测定法是一种常用的非侵入性转录物分析方法，广泛应用于研究基因表达调控、信号传导途径和转录因子激活等生物学过程。

双荧光素酶测定法结合了荧光素酶的双荧光素酶报告基因和育像蛋白的内参基因，通过检测这两种酶的活性比例来分析目标基因的表达水平及其受到的调控影响。

本实验旨在介绍双荧光素酶报告基因测定法的原理、实验步骤和数据分析方法，以及其在科研实验中的应用。

二、原理双荧光素酶报告基因测定法基于两种荧光素酶的差异表达，分别是火萤酶（LUC）和荧光素酶（RLUC）。

在实验中，双荧光素酶质粒将目标基因的启动子或响应元件与火萤酶基因和荧光素酶基因进行融合，构建成双荧光素酶报告基因表达载体。

通过质粒转染或病毒载体介导的基因递送，将双荧光素酶报告基因载体导入细胞内，使其表达成片段性。

当目标基因的启动子或响应元件被激活，通过蛋白质结合、酶诱导或信号通路激活等途径，可导致火萤酶表达增加。

而荧光素酶则作为内参基因，保持其在不受影响的状态下稳定表达。

在此情况下，通过双荧光素酶酶活体系检测细胞总表达情况下火萤酶和荧光素酶的活性比例，从而间接反映出目标基因的表达水平及受到的调控影响。

三、实验步骤（1）细胞培养和质粒转染细胞培养：选择适当的细胞系，并按照细胞培养的常规方法进行培养和传代。

质粒转染：将双荧光素酶报告基因表达载体转染至培养好的细胞中。

一般可采用化学方法如聚乙烯亚胺转染、磷酸钙法转染或电穿孔法转染等。

（2）激活实验将细胞转染后，配置相应的实验处理组和对照组。

对照组可以设置为空缺转染、阴性对照和阳性对照等。

实验处理：对照组和处理组分别按照实验方案进行处理。

如添加激活剂、抑制剂、基因过表达、RNA干扰等。

培养时间：培养细胞至接近稳态，通常培养时间为24-48h。

（3）细胞裂解和双荧光素酶活性检测裂解细胞：用裂解缓冲液加入到细胞培养瓶内，彻底裂解细胞并悬匀。

双荧光报告实验步骤：荧光步骤实验报告荧光酶报告实验植物写物理实验报告的步骤实验报告模板篇一：双荧光报告系统报告基因Promega中文通讯第2期2002荧光素酶双荧光素酶报告基因测试∶结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。

但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。

Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。

双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。

系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。

对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。

双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。

介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。

检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。

通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。

报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。

通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。

使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。

但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势, 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。

promega双荧光素酶说明书摘要：I.引言- 介绍Promega 双荧光素酶报告基因检测系统- 说明该系统的应用领域和实验流程II.实验原理- 介绍荧光素酶报告基因检测技术的基本原理- 阐述Promega 双荧光素酶报告基因检测系统的技术优势III.实验操作- 详细介绍实验操作步骤，包括实验材料、实验方法等- 强调实验过程中需要注意的事项IV.实验结果分析- 介绍实验结果的检测方法和分析流程- 阐述实验结果的可靠性和准确性V.应用案例- 分享几个Promega 双荧光素酶报告基因检测系统在实际应用中的成功案例- 说明这些案例证明了该系统在研究中的重要性和可靠性VI.结论- 总结Promega 双荧光素酶报告基因检测系统的优点和应用价值- 展望该系统在未来的发展和应用前景正文：Promega 双荧光素酶报告基因检测系统是一种广泛应用于生物学、医学等领域的检测工具，它可以帮助研究人员快速、准确地检测基因表达和调控。

该系统采用了荧光素酶报告基因技术，通过荧光信号的强度来反映基因表达的水平，从而实现对基因表达的定量分析。

该系统的应用领域非常广泛，可以用于检测基因表达、基因调控、药物筛选、生物学通路研究等。

在实验流程上，首先需要将待检测的基因与荧光素酶报告基因构建成报告基因质粒，然后将质粒转染到目标细胞中，最后通过检测荧光信号的强度来定量分析基因表达水平。

Promega 双荧光素酶报告基因检测系统的技术优势在于，它采用了两种荧光素酶，可以同时检测两个基因的表达水平，从而提高了检测的准确性和可靠性。

此外，该系统还具有灵敏度高、检测速度快、操作简单等优点，深受广大研究人员的青睐。

在实验操作过程中，需要注意的事项包括：正确选择实验材料、准确设置实验条件、严格控制实验操作等。

只有做好这些细节，才能保证实验结果的可靠性和准确性。

实验结果的分析是整个实验的重要环节。

通过荧光信号的检测和分析，可以得到基因表达水平的数据，这些数据可以用于进一步的研究和分析。

双荧光素酶报告基因检测系统——更亮、更快、更准产品背景双荧光素酶报告基因常用于启动子对基因表达影响的研究。

将所研究目的基因的调控序列克隆到含有报告基因的表达质粒中，然后将重组质粒导入适当的细胞系，通过测定报告基因表达的水平来间接评价在调控序列指导下启动子对基因表达的诱导作用。

荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，转录后无需修饰即具有报告基因的功能。

产品原理萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）大小为61KDa，单亚基蛋白，能够催化荧光素（luciferin）氧化，生成氧化荧光素oxyluciferin；海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为36 KDa的单亚基蛋白，能够催化腔肠素（coelenterazine）氧化形成coelenteramide。

二者在翻译后均无需修饰即可发挥作用。

通常情况下，海肾荧光素酶作为内肾，用以减少内在因素的某些变化对实验所造成的影响。

该试剂盒先对转染后的细胞进行裂解，然后以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶的活性，之后在淬灭该荧光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾荧光素酶报告基因的活性；具有检测信号强、线性范围广、无内源活性干扰等特点。

产品特点裂解能力更强：能够彻底裂解绝大部分种类细胞。

信号更强：能够精准检测弱启动子的表达。

灵敏度更高：可检测低至10‐20摩尔荧光素酶分子。

线性范围更广：线性检测范围超过酶浓度的8个数量级。

操作流程加入海肾荧光素酶反应液的作用1：淬灭萤火虫荧光素酶的发光 2：加入海肾荧光素酶的底物腔肠素产品数据检测试剂和荧光素酶相互作用，可获得最佳的发光强度，加入海肾荧光素酶底物后，萤火虫荧光素发光淬灭情况：基本能够完全淬灭。

产品价格产品订购FAQQ1：双荧光素酶报告基因最适反应温度？A：室温（20-22℃）。

反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。

此两种荧光素酶的反应速率是受温度影响的，为了保证实验的一致性，我们推荐此两种工作液在检测时都孵育至室温。