《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》
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实验日期：5月27日-5月30日
微生物综合实验
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
班级16级生物技术1、2班姓名
学号座位号
实验日程安排
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
一、实验原理
抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：
药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可以形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中药物的吸收、分布不同，使药物的浓度难以恒定。因此在评定新药的药效时除做体外抑菌实验外还需要做体内的抗菌实验。
二、实验材料及方法
1.材料
（1）菌株
大肠杆菌（Escherichia coli）EC40菌株。
（2）用具
灭菌培养皿（9 cm），灭菌三角烧瓶（250 mL），灭菌枪头（蓝、黄），灭菌离心管(EP管)，灭菌棉签，镊子，涂布器，氯霉素，苯唑西林，庆大霉素及复方新诺明（SXT），左氧氟沙星（LEV），庆大霉素（CN），苯唑西林（OXA）纸片。
（3）培养基
① LB液体培养基：蛋白胨1.0 g ,酵母膏 0.5 g,NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL，pH 7.2，高压灭菌0.1 Mpa,20 min。
②LB固体培养基：蛋白胨1.0 g ,酵母膏 0.5 g,NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL，琼脂粉2.0 g，pH 7.2，高压灭菌0.1 Mpa,20 min。
2.实验步骤
（1）实验器具的准备、灭菌，培养基的配制、处理
（2）菌液制备
挑取少量大肠杆菌40菌株，接种于LB液体培养基中，置37℃过夜培养。第二天将菌液按1:10稀释备用。
（3）体外抑菌实验
A. MIC法检测不同抗生素对大肠杆菌的最小抑菌浓度
a.上述制备好的菌群稀释液与LB培养基按1:100稀释。
b.取无菌EP管27支，分成3排，第1排9支，第2排9支，第2排9支。每一排中，除第1管加入1 ml LB培养基外，其余每管加入LB培养基0.5 ml。
c.向第1排第1管加入抗菌药物苯唑西林（苯唑西林浓度为160 mg/ml）100ul混匀，然后吸取0.5 ml至第2管，混匀后再吸取0.5 ml至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.5 ml弃去，第9管为不含药物的生长对照。
d.向第2排第1管加入抗菌药物氯霉素（氯霉素初始浓度为15 mg/ml）4ul 混匀，然后吸取0.5 ml至第2管，混匀后再吸取0.5 ml至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.5ml弃去，第9管为不含药物的生长对照。
e.向第3排第1管加入抗菌药物庆大霉素(庆大霉素初始浓度为10mg/ml)4ul混匀，然后吸取0.5 ml至第2管，混匀后再吸取0.5 ml至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.5ml弃去，第9管为不含药物的生长对照。
f.然后置37℃培养箱培养24h，待观察。
B.纸片法检测不同抗生素对大肠杆菌的抑菌圈：
a. 将制备好的LB琼脂平板底面用记号笔划线平均分成4份，然后用灭菌好的棉签试子蘸取上述制备好的菌群稀释液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。用棉签试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60˚，最后沿平板周边绕两圈，保证涂布均匀。
b. 待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴抗生素滤纸片。用无菌镊子取纸片一张，贴在琼脂平板每份的中央（注：LEV与SXT对称放置，OXA与CN对称放置）。用镊子尖轻压，使其贴平，纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂中。置37℃培养箱培养24h，待观察。
（4）体内抗菌实验全血材料制备及细菌培养实验
取无菌试管三支，分别加入1 ml的血。向其中两支试管中分别加氯霉素10 ul（氯霉素浓度为1.5mg/ml）和苯唑西林10 ul（苯唑西林浓度为16 mg/ml）然后向三支试管中分别加入10 ul的上述菌群稀释液。置37℃摇床振荡培养。（记为0 h）
（5）体内抗菌实验
1）培养约4h的全血及细菌混合液处理
a.取无菌EP管9支，放三排，每排3支，分别标记为1（10-1）、2（10-2）、
