HE染色操作流程

HE 染色的步骤
待干燥后的切片进行HE 染色，具体操作如下：1、脱蜡：室温条件下，将切片
夹于弹簧夹上，然后置于二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ（各10 min）→无水乙醇：二甲苯（1：1、3 min）；2、下行梯度酒精复水：无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇（各3
~
5 min）；3、苏木素染色：将脱水后的切片置于苏木素内染
色（15 min），然后蒸馏水洗涤 2 次；4、盐酸分化：用0.25%盐酸快速分化；5、蓝化：将切片置于30℃左右的自来水中蓝化（20 min）；6、上行梯度酒精脱水：50% 乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇（各3
~
5 min）；7、伊红染色：将切片置于伊红染
液中染色（15S）；8、脱水：95%乙醇（5 min）→无水乙醇Ⅰ（10 min）→无水乙醇Ⅱ（10 min）→无水乙醇：二甲苯（1：1、3 min）9、透明：二甲苯Ⅰ（10 min）→
二甲苯Ⅱ（10 min）；10 、封片：用中性树脂胶将切片封好即可。

he染色流程(一)he染色简介•什么是he染色?•为什么需要he染色?流程1. 样本制备•获取组织样本(如组织切片)•将样本固定在载玻片上•进行脱水和透明化处理2. 血液片制备•获取新鲜血液样本•密度离心分离白细胞•将细胞悬液涂布在载玻片上•进行干燥和固定处理3. 染色液制备•准备hematoxylin溶液和eosin溶液•根据需要进行稀释4. he染色•将载玻片浸入hematoxylin溶液中，染色一段固定时间•洗去多余溶液•将载玻片浸入eosin溶液中，染色一段固定时间•再次洗去多余溶液•干燥载玻片5. 倒置显微镜观察•将he染色载玻片放置在倒置显微镜上•调整镜头和光照条件以观察染色效果•进行细胞组织结构的分析和判定结论•he染色是一种常用的细胞和组织染色方法•它可以用于观察细胞和组织的形态结构•he染色广泛应用于病理学和组织学领域，有助于疾病的诊断和治疗参考文献•[论文/reference]•[书籍/reference]注意：此处所提供的流程仅为示例，实际操作中可能存在差异。

请严格按照实验室标准操作，并遵循相关实验室安全规定。

he染色简介•什么是he染色?–he染色是一种常用的细胞和组织染色方法，用于观察细胞和组织的形态结构。

•为什么需要he染色?–he染色可以帮助病理学家和研究人员观察细胞和组织的结构，对疾病的诊断和治疗起到重要的作用。

流程1. 样本制备•获取组织样本(如组织切片)。

•将样本固定在载玻片上，保持其原始形态。

•进行脱水和透明化处理，以去除组织中的水分，便于染色。

2. 血液片制备•获取新鲜血液样本。

•密度离心分离白细胞，得到富含白细胞的细胞悬液。

•将细胞悬液涂布在载玻片上，形成血液片。

•进行干燥和固定处理，以保持细胞形态。

3. 染色液制备•准备hematoxylin溶液和eosin溶液，用于染色。

•根据需要进行稀释，以调整染色液的浓度。

4. he染色•将载玻片浸入hematoxylin溶液中，染色一段固定时间。

骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。

2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。

4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。

5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。

6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。

7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。

免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。

2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。

3.PBS冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。

5.PBS冲洗3次，每次5min。

6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。

7.PBS冲洗3次，每次5min。

8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。

10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。

12.DAB显色5min。

13.自来水冲洗10min。

14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。

15.自来水冲洗10min。

16.常规脱水，透明，封片，镜检。

HE染色试剂配置A：~1%的伊红酒精溶液：称取伊红~1g,加少量蒸馏水溶解后,再滴加冰醋酸直至浆糊状;以滤纸过滤,将滤渣在烘箱中烤干后,以95%酒精即工业酒精,如果不怕浪费,用无水乙醇配制也可100毫升溶解;B：苏木素染液配方：配制3000ml,可按比列减少苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇,再将硫酸铝钾溶于蒸馏水,溶解后将甘油倾入一起混合,最后加入冰醋酸和碘酸钠;C：1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可;染色流程1二甲苯Ⅰ15min2二甲苯Ⅱ15min3二甲苯：无水乙醇=1:12min4100%乙醇Ⅰ5min5100%乙醇Ⅱ5min680%乙醇5min7蒸馏水5min8苏木精液染色5min9流水稍洗去苏木精液1-3s101%盐酸乙醇1-3s11稍水洗10-30s12蒸馏水过洗1-2s13%伊红液染色1-3min14蒸馏水稍洗1-2s1580%乙醇稍洗1-2s1695%乙醇Ⅰ2-3s1795%乙醇Ⅱ3-5s18无水乙醇5-10min19石炭酸二甲苯5-10min20二甲苯Ⅰ2min21二甲苯Ⅱ2min22二甲苯Ⅲ2min23中性树胶封固注：①第11、12步可省去,13步冲水时间需延长至20-30min;②第21步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇;冷冻切片HE染色步骤：1冰冻切片固定10～30s2稍水洗1～2s3苏木精液染色60℃30～60s4流水洗去苏木精液5～10s51%盐酸乙醇1～3s6稍水洗1～2s7促蓝液返蓝5～10s8流水冲洗15～30s9%曙红液染色30～60s10蒸馏水稍洗1～2s1180%乙醇1～2s1295%乙醇1～2s13无水乙醇1～2s14石炭酸二甲苯2～3s15二甲苯Ⅰ2～3s16二甲苯Ⅱ2～3s17中性树胶封固;注：第14步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇;染色结果：细胞核蓝色,胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈深浅不一的红色;4．12切片脱水透明切片经HE染色后,要彻底脱水透明,才能用中性树胶封盖;如果脱水不彻底,封片后呈白色雾状,镜下观察模糊不清,且容易褪色;切片1-2级无水乙醇脱水,也可使用石碳酸二甲苯进行脱水;石碳酸有较强脱水能力,但长时间可使切片脱色,因此要经过多次二甲苯以使石碳酸完全除去;染色评定标准：1切片完整,厚度4-6微米,厚薄均匀,无皱褶无刀痕；2染色核浆分明,红蓝适度,透明洁净,封裱美观;4 染色结果编辑细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色,软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色,粘液呈灰蓝色;细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色,胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色;胶原纤维呈淡粉红色,弹力纤维呈亮粉红色,红血球呈橘红色,蛋白性液体呈粉红色;着色情况与组织或细胞的种类有关,也随其生活周期及病理变化而改变;例如,很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱,当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染;胶原纤维在老化和出现透明变性时,伊红着色由浅变深;Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一;试剂：Regaud 氏苏木精：苏木精1g,95%酒精10ml,甘油10ml,蒸馏水80ml;将苏木精加入蒸馏水内加温溶解,冷却后加入酒精和甘油,放数日后即可应用;Masson丽春红酸性复红液：丽春红,酸性复红,蒸馏水99ml,冰醋酸1ml; %冰醋酸水溶液：冰醋酸 ml,蒸馏水100 ml;1%磷钼酸水溶液：磷钼酸1g,蒸馏水100 ml;苯胺蓝水溶液：苯胺蓝2g,蒸馏水98 ml,冰醋酸2 ml;1%光绿水溶液：光绿 1g,蒸馏水100 ml;Masson三色法步骤1．石蜡切片脱蜡至水;2．铬化处理或去汞盐沉淀甲醛固定的组织此步可略;3．依次自来水和蒸馏水洗;4．用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5-10min;5．充分水洗,如过染可盐酸酒精分化;6．蒸馏水洗;7．用Masson 丽春红酸性复红液5-10min;8．以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻;9． 1%磷钼酸水溶液分化3-5min;10. 不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min;11．以%冰醋酸水溶液浸洗片刻;12．95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固;结果：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色如光绿液染色为绿色,胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色,胞核黑蓝色;体会与说明：1．控制好染色步骤;2．组织固定起着很重要的作用,根据不同的固定液可延长或缩短染色时间; 3．%冰醋酸水溶液洗,可使色调清晰鲜艳;4．磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用,分化时镜下控制, 肌纤维和纤维素呈红色,胶原纤维呈淡粉红色即可;天狼猩红染色试剂配制1天狼星红饱和苦昧酸液 O．5％天狼星红10ml,苦味酸饱和液90ml;2天青石蓝液天青石蓝B1．25g．铁明矾1．25g,蒸馏水250ml;溶解煮沸、待冷却过滤加入甘油30ml,然后再加入浓盐酸0．5ml;染色步骤1中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水;2人大青石蓝液染5一lOmin;3蒸馏水洗3次;4天狼星红饱和苦昧酸浓染15-30min5无水乙醇直接分化与脱水;Devil二甲苯透明,中性树胶封固;注意事项1细胞核里染色可以用Harris苏木素染色液谈染;2染色封固后的切片,须及时用偏光显微镜进行观察和照相已保持鲜艳的色彩注：在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维;l型胶原纤维：紧密排列,显示很强的双折光性,呈黄色或红色的纤维oll型胶原纤维：显示弱的双折光,呈多种色彩的疏松网状分布;皿型胶原纤维：显示弱的双折光,呈绿色的细纤维;lv型胶原纤维：显示弱的双折光的基膜,呈淡黄色;免疫组化步骤ABC法1;4%多聚甲醛常规灌注固定,取材并置20%蔗糖溶液4℃中过夜;蜡块制作;切片,贴片;清洗5min×3后；2;加入配好的%的过氧化氢甲醇溶液甲醇80ml＋ 100ml＋30%过氧化氢30min,以消除内源性过氧化物酶的影响,清洗5min×3；3;加入配好的% Triton X10030% Triton X100＋ 100ml30min,以增加细胞的通透性,清洗5min×3；4;加入用血清稀释液牛血清白蛋白＋ 100ml＋叠氮纳稀释的一抗,4℃存放24-48h；吸去抗体,洗5min×3；5;加入稀释的的二抗,室温孵育2h;洗5min×3；6;加入ABC复合物之类的抗体,室温孵育2h,洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7;加入显色液,进行免疫组织化学显色,时间一般不超过30min,可不时在显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲三次后加入终止反应；8;梯度酒精脱水之后,封片,拍照;免疫组化SP法步骤：SPstreptavidin-perosidase法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类,如荧光染料、放射性同位素、酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶、铁蛋白、胶体金等,可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等;按染色步骤可分为直接法又称一步法和间接法二步、三步或多步法；按结合方式可分为抗原—抗体结合,如过氧化物酶-抗过氧化物酶PAP法和亲和连接,如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物ABC法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法等,其中SP法是最常使用的方法;一般的sp法步骤啊,具体如下：1.烤片,68℃,20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min,PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置枸橼酸缓冲液PH 中用煮沸95℃,15－20min,自然冷却20min 以上,再用冷水冲洗缸子,加快冷却至室温,PBS冲洗3X5min;5. 正常羊血清工作液封闭,37℃10 min,倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS冲洗3X5min用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育30min, PBS 冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色,自来水充分冲洗后,苏木素复染,常规脱水,透明,干燥,封片;免疫组化Elivision二步法：1石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用的PBS冲洗三次,每次3分钟3×3’;2取一定量pH=柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’;注：不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定3每张切片加1滴3% H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性;PBS冲洗3×3’;4除去PBS液,每张切片加1滴相应的第一抗体相应稀释倍数,室温下孵育2小时;5PBS冲洗3×5’;除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂试剂A,室温下孵育20分钟;PBS冲洗3×3’;6除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物试剂B,室温下孵育30分钟;PBS冲洗3×5’7除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液,显微镜下观察5分钟;8苏木素复染,%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察;注：即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒,购自福州脉新生物技术开发有限公司;包括：生物素化抗兔二抗、亲和素Reagent A、生物素－辣根过氧化物酶Reagent B、二氨基联苯胺DAB脱钙剂的配置10%EDTA的配置：1加热水浴锅到65℃2称取NaOH11g加到900mlddH2O中3再加入EDTA-Na2100g至水中；4水浴加热,搅拌至透明溶解5加入Na2HPO46g,NaH2PO4,NaCl9g;蒸馏水定容至1000ml 6调节pH值至~,室温或4度保存。