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曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定1.1基本原理：多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。
在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。
因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。
1.2实验试剂和仪器：a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）b．试剂1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。
母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。
取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。
2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。
3）50mmol/L邻苯二酚溶液取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。
1.3实验步骤1）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
生物化学实验》课程实验大纲一、学时学分总学时：30 学分：1 实验时数：30二、实验目的生物化学是生物技术及生命科学相关专业的专业基础课程，其实验教学是使学生理解和掌握生物化学基本原理的必需环节。
生物化学实验所包含的基本技能涉及生物科学的各个领域，是完成其它专业课程实验的基础，在教学中占有重要地位。
本课程的实验目的主要包括：（1）加深生物化学基本概念和基本原理的理解与掌握；（2）培养学生掌握基本生化实验方法和实验技术，掌握各个实验的基本原理；（3）系统训练专门的实验技能，熟练使用各种常用生化实验仪器；（4）训练学生观察实验现象、准确记录实验数据、正确处理与分析实验结果的技能，培养严谨细致的科学作风。
三、实验基本原理蛋白质的溶解受盐、酸、碱、重金属等因素的影响，发生可逆和不可逆沉淀；在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，加入SDS后由于各种蛋白质分子量大小不同，所以蛋白质在电泳中迁移率也会有不同；蛋白质的分子大小不同，小分子蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面而迅速通过层析柱；碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；激活剂、抑制剂、温度等对酶促反应速度有极大影响；电子传递过程中的氧化还原反应可通过伴有颜色变化的化合物作受体来研究；纸层析技术可以用于转氨基作用中不同物质的检测。
四、实验基本要求严格遵守实验室各项规章制度；实验前认真预习实验指导书中有关实验的原理与步骤；认真听取理解教师在实验进行前的重点讲解；分小组进行实验，保持实验室安静，保持实验台整洁有序；正确使用实验仪器；认真观察与分析实验现象，客观真实地填写实验数据并进行结果分析；认真、准确、整洁地撰写实验报告并按时上交。
五、考核与报告考核分笔试和平时成绩两项。
笔试成绩占70%，平时成绩占30%。
平时成绩根据整个课程实验过程中学生的各方面表现和实验报告撰写情况打分。
六、主要仪器与设备组织捣碎机、水浴锅、高速冷冻离心机、台式离心机、柱层析系统、电泳仪、垂直与水平电泳槽、紫外与可见分光光度计、蛋白质检测仪、紫外透射反射仪、冰箱、电子天平、反渗透系统等。
果蔬成分生化分析果蔬成分的分析主要分为四个方面：维生素C含量的测定、总糖和还原糖含量的测定、蛋白质含量的测定、过氧化物酶的分析。
总体从实验目的、实验原理、实验试剂、实验结果和分析的角度进行分析一．实验目的：1、掌握微量测定维生素C的方法和技术。
2、了解果蔬中维生素C含量。
3、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。
4、掌握蛋白质测定的方法和技术。
5、了解果蔬中蛋白质的含量。
6、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。
二．实验原理：1.还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。
氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。
成为还原型后为无色。
用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。
滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。
（此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。
）2.蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收。
多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。
3. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。
植物中过氧化物酶的鉴定及其在抗氧化作用中的应用植物是生命的源头，其生命活动极其复杂且繁忙。
在这个过程中，植物需要应对各种外界环境压力，包括氧化压力。
氧化压力是体内存在的一种现象，与许多疾病的发生有关。
植物中的过氧化物酶（POD）是非常重要的一种酶，在氧化压力中发挥着重要作用。
因此，本文将介绍如何鉴定植物中的POD以及它在抗氧化作用中的应用。
一、过氧化物酶的鉴定POD是一种酸性酶，存在于植物细胞的各个部位，如细胞壁、叶绿体、线粒体、高尔基体等。
鉴定POD的方法有很多，其中主要有以下几种方法：1、活性测定法POD酶的活性可以通过检测其催化的底物的降解速度来测定。
常见的检测底物有过氧化氢、苯酚等，检测方法包括光度法、荧光法等。
这种方法简单易行，较为常用，但无法准确区分不同的POD等级。
2、免疫印迹法免疫印迹法可以测定特定POD蛋白的存在和表达水平。
该方法通过电泳将蛋白分离并转移到固体载体上，再使用特异性抗体与POD结合，然后用荧光素二磷酸酯显色，最后用胶片等媒介记录。
与活性测定法不同，免疫印迹法可以区分不同的POD等级。
3、PCR法PCR法是通过扩增特定的POD基因序列进行鉴定。
通过PCR扩增出的目的产物可以直接克隆到表达载体中，然后进行蛋白表达测定。
这种方法准确度高，但需要PCR技术的支持。
二、POD在抗氧化中的应用氧化作用是许多疾病和老化的修补过程，但如果氧化作用过度，则会产生有害的自由基，对细胞造成严重的损害。
植物中的POD可以将过氧化氢转化为水和氧，从而减轻氧化压力。
POD的应用也成为了目前研究的热点领域。
1、抗菌过氧化物酶在植物病害中起到了很大的作用。
POD能够作为抗病机制的一部分。
吲哚乙酸是一种有效的植物生长调节剂，可以提高POD的活性，从而增加植物抵抗菌虫的能力。
2、抗氧化POD是植物细胞内重要的抗氧化酶之一，能够清除氧化物质，维持细胞稳态。
然而，在氧化环境下，POD的活性会降低或失去，导致过氧化氢等有害物的累积，从而引发细胞损伤。
收稿日期:2002211225 基金项目:湖南省科技厅资助项目(00N KY 1005201) 作者简介:杨大伟(19682),男,白族,湖南沅陵人,湖南农业大学硕士研究生. 文章编号:100721032(2003)0320258204黄花菜中过氧化物酶活性的测定及褐变控制杨大伟,夏延斌,谭兴和,龚吉军(湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128)摘 要:为了探索黄花菜预处理过程中合理抑制POD 活力的方法,以鲜黄花菜为材料,研究其在采后及加工过程中POD 的活性及变化情况.发现外花瓣和花梗的POD 活力强,内花瓣的弱,并随着采收后贮藏时间的延长,活力缓慢下降,经贮藏2d 以上的黄花菜不宜用来作为脱水黄花菜的原料.比较热(沸)水杀酶、蒸汽杀酶与非蒸汽(干燥空气,远红外线,微波)杀酶等方法发现,热(沸)水与非蒸汽不能有效的杀灭黄花菜中的POD ,湿热空气(蒸汽)比干热空气灭酶效果好,蒸汽灭酶的工艺参数为漂烫温度98℃,漂烫时间70～80s .关 键 词:过氧化物酶;黄花菜;酶活力;酶促褐变中图分类号:T S 201.2+5 文献标识码:AO n the Inhibiti on of Peroxidase in the P rocess of D ehydrated D aylilyY ANG Da 2w e i ,XI A Yan 2bi n ,T AN Xi ng 2he ,GONG J i 2j un(Co llege of Food Science and T echno l ogy ,HNAU ,Changsha 410128,PRC )Abs trac t :In o rder to discuss the m ethod fo r inh ibiting POD reas onably ,the activity and variati on ofPOD in fresh daylily are researched w hen it w as harvested and p rocessed .R esults show that POD ac 2tivity is vari ous in differen t parts ,the POD activity of ste m and ex ternal petal is strong and that of in 2ner petal is w eak .M eanw h ile the POD activity sl ow ly decreases w ith sto rage ti m e after harvesting ,s o day 2lily w h ich is sto red mo re than 2d is no t suitable fo r the m aterial of dehydrated day 2lily .W ith the comparis on of m ethods of k illing enzym e by heat o r bo iling w ater ,stea m and non 2stea m such as drying at mo s phere ,infrared ray and m icrow ave ,it indicates that heat o r bo iling w ater and non 2stea m do no t k ill the POD efficien tly ,and at mo s phere w ith stea m k ills enzym e mo re efficien tly than drying at mo 2s phere does .T he op ti m al techno l ogy fo r k illing enzym e is to blanch the m aterial by stea m fo r 70～80seconds.Ke y w o rds :perox idase ;daylily ;enzym e activity ;enzym atic brow n ing 黄花菜营养价值高,香味浓郁,深受人们喜爱,在湖南祁东、邵东等地已成为一项特色产业.但黄花菜脱水加工过程中存在褐变问题,在多种引起褐变的原因中,过氧化物酶(POD )引起的酶褐变对脱水黄花菜产品的品质影响最大.据报道[1],过氧化物酶是一种非常耐热的酶,当果蔬中的过氧化物酶在热加工中失活时,其他的酶(如多酚氧化酶,PPO )以活性形式存在的可能性很小,因而在果蔬加工中POD常被用作热处理是否充分的指标.目前,国内外文献中有关POD 对黄花菜加工品质影响的报道不多[2],还未见有对黄花菜干制影响的研究报道,因而有必要对其进行系统的研究.笔者在大量试验的基础上,研究黄花菜中POD 的特性,找到了一条在预处理工艺中合理抑制酶活力的方法,从而为生产高品质的脱水黄花菜奠定了基础.1 材料与方法1.1 材 料仪器与设备有721分光光度计,TD 25多管架自第29卷第3期湖南农业大学学报(自然科学版) V o l .29N o .32003年6月Journal of H unan A griculturalU n iversity (N atural Sciences )Jun .2003动平衡离心机,101A 21型电热鼓风干燥箱,远红外鼓风干燥箱,格兰仕W P 700型微波炉,电子万用炉,电热恒温水浴锅.试剂有N a 2H PO 4,N aH 2PO 4,H 2O 2,N a 2H PO 4・12H 2O ,愈创木酚,邻苯二酚.供试材料为湖南祁东黄花集团公司提供的鲜黄花菜.1.2 方 法1.2.1 酶活力的测定POD 活力采用愈创木酚法[3],多酚氧化酶PPO 活力采用吸光光度法[4].将完整的黄花菜在形态结构上分解成四部分:外花瓣、内花瓣、整花及花梗,并分别测定不同部位的POD 活力.将刚采收的鲜黄花菜在4℃冰箱中贮藏1,2,3d 后,分别测定外花瓣和花梗的POD 活力.1.2.2 非蒸汽灭酶分别取鲜黄花菜100g ,放在100℃热风干燥箱中和远红外干燥箱中干燥5m in ,用高功率、中等功率、低功率微波辐射3m in ,以及用70℃和80℃热水漂烫2m in ,90℃和98℃热水漂烫1m in ,以褐变程度为评价指标,褐变严重为POD 活力高,无褐变则为POD 无活力.1.2.3 蒸汽灭酶各取鲜黄花菜100g ,分别采用家庭液化气灶(98℃,漂烫时间设60,65,70,75,80,90,100,110s ),电子万用炉(98℃,时间设60,70,80,90,100,110,120s )及电热恒温水浴锅(80℃,时间设150,180,210,240,270,300s ;90℃,时间设60,90,120,150,180,210s ;98℃,时间设10,20,30,40,50,60s )作蒸汽发生的热源进行灭酶处理,然后在75℃的热风干燥箱中干制到含水量为15%时止.以灭酶、冷却、干燥过程中褐变程度和产品质量为评价指标.2 结果与分析2.1 鲜黄花菜不同部位POD 和PPO 的活力POD 的活力水平在不同部位上相差较大(表1),花梗上POD 分布均匀且含量较高,因而总的POD 活力水平最高.外花瓣POD 分布极不均匀,离花嘴越近的部位,POD 活力水平越高,因而外花瓣POD 活力平均水平比花梗的低.由于内花瓣POD 活力水平为零,故整花POD 活力水平比外花瓣与花梗均低.2种酶的活力水平与苹果、桃、梨、马铃薯、蘑菇等相关酶的活力水平[5]相比要小得多.PPO 不耐热,用热力灭酶很容易将其抑制,干制过程中不会引起褐变现象.而POD 非常耐热,需要严格的抑制酶活力工艺条件,否则在灭酶过程中或者后续干制脱水过程中产生褐变,使产品质量下降.表1 黄花菜不同部位的POD 及PPO 活力值Tabl e 1 Ac ti v ity of POD and PPO i n d i ffe rentpa rts of daylil yU(m in ・100g )酶整花花梗外花瓣内花瓣POD 310±7420±14 370±9 9±0.5PPO 248±11283±10 273±13 230±8.02.2 不同贮藏时间的POD 活力花梗和外花瓣的POD 活力随贮藏时间的延长有所下降,但下降幅度不大(图1).这表明黄花菜脱水加工存在较大的难度,一方面采后的黄花菜仍然有较强的呼吸作用,随着贮藏时间的延长,将促使植物组织结构变得越来越脆弱,植物细胞在外力的作用下容易崩解;另一方面,POD 活力并没有随贮藏时间延长而显著减少,抑制酶活力的热力强度不能减弱,这样会引起植物组织结构的破坏、崩溃,细胞破裂,蛋白质与糖类等化合物密切接触,促进美拉德反应的发生,脱水干制容易形成油条状产品.因此黄花菜脱水干制应采用刚采收的新鲜原料,贮藏2d 以上的原料不宜用来生产脱水黄花菜.图1 不同贮藏时间POD 的活力变化F i g .1 Ac ti v ity va ri a ti on of POD w ith d i ffe rent s to rage ti m e2.3 不同灭酶方法对产品质量的影响2.3.1 非蒸汽灭酶效果100℃干燥空气,100℃远红外线辐照和70,80℃热水灭酶时产生严重的褐变,用90℃热水和微波处理也产生较为严重的褐变,98℃热水灭酶虽不产生褐变但易散花.上述结果表明:1)100℃干燥空952 第29卷第3期杨大伟等 黄花菜中过氧化物酶活性的测定及褐变控制气和100℃远红外线辐照根本起不到抑制酶活力的作用,其原因是:灭酶时在物料表面存在一气膜层,这一层气膜大大增加了热量传递时的阻力(热量在气膜层中的传递是以传导方式进行的),使热量很难在较短时间内到达POD部位,其温度也很难在较短时间内升到应有的灭酶温度,POD在一定的时间内、较低的温度下发生了褐变反应.2)微波不能杀灭黄花菜中的POD,说明微波灭酶并不适合所有的食品原料.因POD主要集中在黄花菜的外花瓣和花梗上,而微波灭酶时物料表面温度较低,不能杀灭非常耐热的POD.3)虽然沸水灭酶能抑制褐变,但会出现散苞开花现象,而花已开放的黄花菜是不宜作干制原料的.热水或沸水灭酶易导致开花的原因是:花苞在热水或沸水里很易吸水,被吸收进花苞里的水在受热情况下其体积会增大,在一定的压力下花苞就会开放.此外,热水或沸水漂烫灭酶容易引起维生素C等营养成分的损失,使干制品的营养品质下降.2.3.2 蒸汽灭酶效果由于在黄花菜干制过程中的褐变反应既包括酶褐变也有部分非酶褐变.反应过程较慢,且很复杂.为了便于分析,观察每一个样品灭酶过程中的变化、冷却过程中的变化、干燥后的变化,以便找到影响褐变的重要因素,结果见表2,3.表2 不同温度的蒸汽灭酶对产品质量的影响Tabl e2 Effec t of killi ng enzym e by s team w ith d i ffe rent tem pe ra ture on qua lity of produc t脱水过程80℃150s180s210s240s270s300s330s90℃60s90s120s150s180s210s240s98℃10s20s30s40s50s60s灭酶时++++++++++++++++—————————————冷 却+++++++++++++++++++++++————++—————干 燥+++++++++++++++++++++++++———++++++———产品质量▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲●★●▲▲▲●★●▲ +++.褐变很严重;++.褐变严重;+.褐变较严重;—.无褐变;▲.质量差;●.质量较好;★.质量好.表3 98℃时家庭液化气灶和电子万用炉发生的蒸汽灭酶对产品质量的影响Tabl e3 Effec t of killi ng enzym e by s team from li quefi ed gas fo r cooki ng and uni ve rsa l e l ec tri c s tove on qua lity of produc t脱水过程家庭液化气灶60s65s70s75s80s90s100s110s120s电子万用炉60s70s80s90s100s110s120s灭酶时+————————+++—————冷 却+++———————+++++————干 燥+++———————++++++++———产品质量▲●★★★●●▲▲▲●●●★●▲ 从表2和表3可知:1)当温度低于80℃时,不能有效杀灭POD,必须使温度大于90℃时才能将其杀灭,这与文献[1]报道的相符;2)湿热空气(蒸汽)比干热空气灭酶效果好,原因是湿热空气在上升流动的过程中将热量以对流的方式传递到黄花菜表面,热量通过物料表面气膜层时产生的传热阻力很小,能在极短的时间内使物料表面的温度上升到规定的灭酶温度,将POD杀灭;3)同是常压下98℃饱和蒸汽,家庭液化气灶、电子万用炉、水浴锅3种热源的灭酶时间,以水浴锅灭酶时间最短,电子万用炉最长,其原因是水浴锅产生的蒸汽对流效果最好,电子万用炉产生的蒸汽对流效果最差.由不同热源蒸汽灭酶对相对活力的影响结果(图2)可以看出:1)不同蒸汽灭酶时,POD失活的速率不同.水浴锅灭酶的速率最大,大于或小于最佳灭酶时间时,产品质量将下降,可操作性差.电子万用炉灭酶的速率最小,在最佳灭酶时间两侧的缓冲时间比较长,但受热时间过长也会影响产品质量.家庭液化气灭酶的速率适当,可操作性好,受热时间不长,能保证产品质量.家庭液化气灭酶时有3个有效灭酶时间,另外2种灭酶方式只有一个有效灭酶时间.生产中灭酶时间掌握不好,会影响产品质量.2)无论是水浴锅蒸汽灭酶,还是电子万用炉蒸汽灭酶,灭酶时间要适当,时间太短,POD抑制不彻底,容易导致酶再生,灭酶失败,产品质量下降.时间太长, POD虽能杀灭,由于热处理时间过长,导致黄花菜中组织网络结构崩溃,细胞破裂,内含物流出,相互密切接触,加速褐变反应的进程,产品呈干瘪的油条状,复水时持水性下降,复原性差.062湖南农业大学学报(自然科学版)2003年6月 图2 不同热源蒸汽灭酶对POD相对活力的影响F i g.2 I m pac t of killi ng enzym e by s team from d i ffe rentw ays on POD re l a ted ac ti v ity3 结 论通过POD不同部位以及经过不同贮藏时间的活力水平的分析测定,POD活力并没有随贮藏时间延长而显著减弱,热力灭酶容易破坏采后逐渐脆弱的植物细胞组织,导致干制品的复水性差,质量下降,因此应选择刚采收的黄花菜作脱水产品的原料.通过POD不同部位的活力水平的分析测定以及POD杀灭方法的比较研究,POD在外花瓣和花梗中的活力强,在内花瓣中的活力弱,表明微波不能杀灭POD,湿热空气(蒸汽)比热(沸)水和干热空气(含远红外线)灭酶效果好,且适宜的蒸汽灭酶工艺参数为漂烫温度98℃,漂烫时间70～80s.参考文献:[1] 王 璋.食品科学[M].北京:中国轻工业出版社,1999.2242225.[2] 张 欣,马 明.黄花菜速冻工艺的研究[J].冷饮与速冻食品工业,2002,(2):10211.[3] 宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1997.7502752.[4] 姜 通,罗志刚,蒲丽军.甘薯中多酚氧化酶活性的测定及褐变控制[J].食品科学,2001,(3):19222.[5] 张 .特种脱水蔬菜加工贮藏和复水学专论[M].北京:科学出版社,1996.33235.简 讯湖南农业大学期刊社成立 根据湘农大[2003]61号文件,为整合出版资源,湖南农业大学学报编辑部已从湖南农业大学科技处分离出来,单独成立湖南农业大学期刊社(正处级).期刊社的成立,标志着湖南农业大学的办刊模式将分步分层次地变更,即由主要依赖学校财政拨款办刊向主要依托市场自主经营自负盈亏转变;由单一从事编辑出版向多种经营转变;由只出版学术期刊向出版多类型期刊转变,以便做大做强,加速期刊的专业化与产业化发展.162 第29卷第3期杨大伟等 黄花菜中过氧化物酶活性的测定及褐变控制。
８种大白菜过氧化物酶同工酶分析摘要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对8个大白菜品种的过氧化物酶（pod）同工酶进行分析。
结果表明，8个品种的pod同工酶酶谱在酶带数、迁移率、酶量（酶带宽窄）及酶活性（酶带深浅）等方面均存在相似性，但也有一定的差异。
依酶谱带特征初步将8个品种进行分类，并对其亲缘关系进行了分析。
关键词大白菜；过氧化物酶同工酶；谱带；亲缘关系中图分类号 s634.1 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2009）05-0008-02同工酶广泛存在于生物界中，它表现出明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志[1]。
过氧化物酶同工酶在高等植物中广泛而大量地存在，具有高度多型性、器官组织特异性和相对稳定性，即同一器官的同一发育时期，pod同工酶酶谱和活性强弱是稳定的，能反映植物的遗传特性[2]。
因而同工酶分析技术被广泛地运用于植物的分类鉴定、亲缘关系及矮化砧木的预选、抗寒性和抗病性鉴定等研究领域。
笔者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对潍坊地区普遍栽种的8个品种的大白菜过氧化物酶同工酶进行分析研究，以期在测定同工酶谱带的基础上，探讨以同工酶谱带特征作为大白菜品种鉴定的依据，进一步测定大白菜品种间的亲缘关系。
1 材料与方法1.1 试验材料试验材料购于潍坊市农科院蔬菜研究所，共8个品种，分别为：潍白秋冠、潍白-78、潍白-68、潍白er-60、潍白-45、潍白四号、潍白二号及潍白一号。
1.2 试验方法1.2.1 酶液提取。
取8个品种大白菜的种子放入培养皿中，加水在培养箱中（15～25℃）黑暗条件下培养4d。
分别取叶片（除去叶脉）0.5g，洗净用滤纸吸干水分，剪碎置于预冷的研钵中，加入酶提取液（由蔗糖10ml、电极缓冲液2ml、无离子水8ml组成）1ml，研磨成匀浆，移入离心管中，8 000rpm离心10min，取上清液备用。
1.2.2 电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳参照张卫国（2006）等的方法[2-6]，略有改进。
黄瓜叶片组织过氧化物歧化酶的测定一、实验目的与要求：测定黄瓜叶片中POD的活性二、原理在H2O2存在的条件下，过氧化物酶能使创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲基苯酚，该物质在470处有最大吸收峰，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化，从而测定过氧化物酶的活性三、植物材料，仪器设备及试剂1.植物材料：15盆（3组完全液，3组100mg/L铅处理，3组300mg/L铅处理，3组500mg/L 铅处理，3组700mg/L铅处理）黄瓜叶片2.仪器设备：高速冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计，制冰机，冰箱，微量进样器，容量瓶，研钵，电子天平等3.试剂（1）0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS）（PH7.0）（2）反应混合液：取50mL 0.2mol/L 磷酸缓冲液置于烧杯中，加入28μL愈创木酚，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入19μL 30% H2O2，混合均匀，保存于4℃冰箱中。
四、实验步骤（一）酶液提取称取新鲜植物材料1g，剪碎，放入预冷的研钵中，加适量硫酸缓冲液，于冰浴中研磨成匀浆，4℃，4000g离心15min,上清转入50mL容量瓶中，残渣再用50mL磷酸缓冲液提取一次，上清并入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，此提取液即为POD粗提液，置于4℃备用。
（二）比色测定取两个比色杯，与一个比色杯中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL作为对照，另一个比色杯中加入混合液3mL和1mL磷酸提取液（如酶活性过高可适当稀释），立即开启秒表记录时间，每隔1min记录一次吸光值。
五、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小。
参比管测定管编号完全液叶片100mg/L铅处理叶片200mg/L 300mg/L 500mg/L 700mg/L反应1min470nmPOD值反应2min470nmPOD值。
