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2010版gmp实施指南(无菌)无菌制剂 GMP实施指南 14.6过滤除菌14.6过滤除菌本节旨在提供系统的方法对除菌过滤工艺进行选择和验证。
除菌过滤过程中的关键设备为除菌(级)过滤器，对其进行的具体确认和验证项目的相关原理和要求等，将在以下14.6.1~14.6.3中详细阐述。
按照不同药品分类，需要、推荐、可选和评估后确定是否进行的确认和验证项目，总结为下表。
项目应用于非最终灭菌产应用于可最终灭菌产品品的除菌过滤的过滤每种型号除菌每种型号除菌级过推荐推荐级过滤器选型滤器的标准细菌截的确认留试验数据与完整(由过滤器生性检测数值的关联产商完成) 每种型号除菌级过推荐推荐滤器的溶出物分析构成过滤器的各种推荐推荐材料的生物安全性每批除菌级过每批除菌级过滤器推荐推荐滤器的确认抽样进行细菌截留(由过滤器生标准试验，并确认与产商完成) 完整性检测数值关联的持续有效出厂前每支完整性推荐推荐检测抽样进行滤出液质量确认，例如:pH、内毒素、总TOC和洁净度抽样进行湿热灭菌推荐推荐耐受测试工艺验证细菌截留需要可选溶出物需要需要化学兼容性需要可选产品润湿的完整性可选可选吸附评估评估很多生产最终灭菌产品的企业，在最终灭菌前，为控制微生物污染水平，使用过滤器对最终灭菌前的产品进行过滤。
此时，不论该企业采用了何种过滤器，包括精度(标称)为0.45μm的过滤器、0.2μm的微生物污染控制过滤器，甚至0.2μm 除菌级过滤器，因为这些过滤器的使用目的都是在最终灭菌之前对微生物污染水平进行控制，而不是作为产品生产过程中最后一步的灭菌手段，对这些过滤器的工艺验证要求，低于非最终灭菌产品除菌过滤过程中所使用的除菌级过滤器。
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无菌制剂GMP实施指南14.6.1除菌级过滤器的验证/细菌截留【法规要求】《药品生产质量管理规范》2010修订版:附录1 无菌药品第九十条对可最终灭菌的产品不得以除菌过滤工艺替代最终灭菌工艺。
韩国假单胞菌防病机制材料与方法说实话韩国假单胞菌防病机制材料与方法这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我最开始想到的就是先去搜集这韩国假单胞菌的样本，那我就跑到各种各样可能有这种菌的环境里去找。
就像大海捞针似的，这可费了我好大的劲儿。
我去了好多农田呀，想着这菌可能跟农作物有点关系，就拿着专门的采样工具，在农作物根部周围的土壤里小心翼翼地取样。
有时候取回来的样本一检测，根本就没有我要的韩国假单胞菌，那时候觉得特别沮丧，就像辛苦种的花怎么都不开。
然后我想研究它的防病机制，就想着得给它个发病的环境，就选了一些容易被病害感染的植物来做实验。
我当时就傻乎乎地把刚取来的样本直接往植物上放，结果啥都没观察到，后来才知道不能这么草率，样本得经过处理，要确保只有这一种菌，而且要控制菌的数量。
这就好比做饭，食材得处理干净，量也得合适。
后来我处理好菌之后，再把它接种到植物上，这时候就在那仔细观察植物的反应。
我每天从早到晚就在那守着看，记录啥时候叶片变色了呀，长斑点了没有。
而且我还用到了显微镜来看细胞的变化，这可好学半天怎么操作那显微镜呢，捣鼓半天才把放大倍数调好，细胞啥样能看清楚。
要说研究它产生的物质对防病的作用。
我一开始想把这菌产生的东西一下子全提取出来，可技术有限呀，根本做不到。
后来我就按步骤一个一个来，先采用特定的培养液让菌生长繁殖，然后再慢慢提取那些可能和防病有关的代谢产物。
还有就是对照试验，这是我后来才深刻体会到重要性的。
我之前没设置好对照试验，得出的结果模棱两可的。
后来呀，我专门设置了一组正常植物，一组接种菌的植物，还有一组接种菌再加一些干扰因素的植物，这样对比起来，才能更清楚地知道这韩国假单胞菌防病机制到底是怎么回事。
不确定的地方也有，比如说这菌和其他微生物的协同防病机制就太难搞清楚了。
我现在也还在探索，但是目前这些方法确实能让我初步了解它的防病机制了。
如果大家也做这方面的研究，千万要吸取我之前的教训啊，样本采集要有耐心，实验步骤要严谨，对照试验要设置好。
假单胞菌假单胞菌（Pseudomonas）是一类广泛存在于自然界的细菌。
它们具有多样的形态和生理特征，可以在各种环境中生存和繁殖。
假单胞菌是一类很重要的病原菌，对人类和动物的健康造成了严重威胁。
在本文中，我们将深入探讨假单胞菌的特征、生物学特性以及其与疾病的关系。
首先，我们来了解一下假单胞菌的基本特征。
假单胞菌是革兰氏阴性菌，呈杆状或短杆状。
它们不产生芽孢，并且可以通过运动的方式移动。
假单胞菌在培养基上形成发亮的芽孢样结构，这是它们在环境中适应的一种策略。
此外，它们还能产生耐热酶、色素和多种酶类，使得它们能够适应各种极端环境。
假单胞菌是一类很常见的细菌，广泛存在于土壤、水体和植物表面等环境中。
它们会利用不同的营养物质，包括碳源、氮源和能量源，在各种环境中快速生长和繁殖。
假单胞菌具有很强的生物降解能力，能够降解有机物和有毒物质。
这使得它们在环境修复和废物处理方面有着广泛的应用。
然而，假单胞菌也是一类人畜共患病的致病菌。
它们会引起多种疾病，包括肺部感染、尿路感染、创伤感染等。
假单胞菌的感染往往与宿主的免疫系统和身体健康状况密切相关。
它们能够通过产生毒素、侵袭宿主细胞和干扰宿主免疫系统等方式引起病症。
对于假单胞菌感染的诊断和治疗，我们需要依靠相关的实验室检测和药物治疗。
实验室检测可以通过培养和鉴定来确定感染的菌株，同时还可以进行抗生素敏感性试验以指导治疗。
对于假单胞菌感染的治疗，目前常用的抗生素包括氨基糖苷类、喹诺酮类和β-内酰胺类等。
此外，我们还需要关注假单胞菌的多重耐药问题。
由于假单胞菌具有很强的适应性和变异能力，它们能够迅速产生抗药性。
这给假单胞菌感染的治疗带来了一定的困难。
因此，我们需要加强对假单胞菌的监测和控制，合理使用抗生素，避免产生更多的耐药菌株。
总结起来，假单胞菌是一类在自然界广泛存在的细菌，具有多样的形态和生理特征。
它们既可以发挥生态系统的重要功能，又能够对人类和动物的健康造成威胁。
除菌过滤器微生物截留的试验分析录入时间:2011-9-22 9:20:27 来源：中国论文下载中心【摘要】目的：探讨非最终灭菌注射剂生产过程中除菌过滤器对微生物的截留效果，确认过滤除菌工艺的有效性与安全性。
方法：采用孔径为0.22 μm除菌级聚醚砜滤芯，以直径在0.3～0.4 μm的缺陷假单胞菌为生物指示剂，将菌液用滤芯过滤，计算被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值(LRV)。
结果：菌液过滤前后微生物数量比的常用对数值LRV大于7。
结论：滤芯每平方厘米有效过滤面积符合中国药典2005年版2部附录ⅩⅦ灭菌法的规定，确认除菌过滤工艺在注射剂生产过程中的有效性与安全性。
【关键词】除菌过滤器；缺陷假单胞菌；微生物截留；无菌保证程度除菌过滤器在药品生产中主要用于无菌药品的除菌过滤，除菌过滤是药品生产过程中非常重要的一种除菌方式，特别是对非最终灭菌的注射剂而言，除菌过滤是消除药液中微生物的唯一方法。
通过对除菌过滤器滤芯材质的选择、灭菌方法、完整性测试以及细菌的截留试验，确认除菌的效果，提高除菌过滤在注射剂生产过程中无菌保证程度重要性的认识。
1 材料与方法1.1 试验材料(1)滤芯：滤膜材质为聚醚砜，10英寸226卡式，孔径：0.22 μm，级别：除菌级，滤膜面积：3 600 cm2。
来源：颇尔过滤器(北京)有限公司。
(2)全自动过滤器完整性测试仪：上海先维过滤设备厂，型号：212A。
(3)甘露醇：广西南宁化学制药有限公司，批号：0809110，配置20 kg 浓度为0.5%的水溶液。
(4)微生物指示剂：缺陷假单孢菌(ATCC19146直径0.3～0.4 μm)，北京鑫四环消毒技术开发中心。
(5)菌液浓度：每平方厘米应达到107个菌的挑战水平。
(6)培养基：硫乙醇酸盐流体培养基：北京三药科技开发公司，批号:081111；营养琼脂：广东环凯微生物科技有限公司，批号:200902081；营养肉汤：广东环凯微生物科技有限公司，批号:200901071。
灭菌验证中关于生物指示剂关于生物指示剂生物指示剂系一类特殊的活微生物制品。
可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。
用于灭菌验证中的生物指示剂一般是细菌的孢子。
（一）制备生物指示剂用微生物的基本要求不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物必须具备以下特性：①菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染微生物的耐受性；②菌种应无致病性；③菌株应稳定。
存活期长，易于保存；④易于培养。
若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
（二）生物指示剂的制备生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，需先确定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时间，以分表示）等。
菌株应用适宜的培养基进行培养。
培养物应制成悬浮液，其中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。
生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式，通常是将一定数量的孢子附着在惰性的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。
生物指示剂应选用合适的材料包装，并设定有效期。
载体和包装材料在保护生物指示剂不被污染和损耗的同时，还应保证灭菌剂穿透并能与生物指示剂充分接触。
载体和包装应设计原则是便于贮存、运输、取样、转移接种。
有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和化学特性的替代品中。
使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。
（三）生物指示剂的应用在灭菌程序的验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标。
可使用市售的标准生物指示剂，也可使用由日常生产污染菌监控中分离的最耐受微生物制备的孢子。
在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的耐受性，并测定孢子的纯度和数量。
验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。
假单胞菌菌落在平板上的形态特征下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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缺陷假单胞菌（B.diminuta）ATCC○R19146TM菌种鉴定1.菌落形态TSA平板：微黄，光滑，边缘整齐。
2. 革兰氏染色2.1原理通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
2.2实验步骤革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。
涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2 涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3 晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
7 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
8 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
9 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。
至此，革兰氏染色结束。
2.3染色结果革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
缺陷假单胞菌（B.diminuta）ATCC○R19146TM菌种鉴定
1.菌落形态
TSA平板：微黄，光滑，边缘整齐。
2. 革兰氏染色
2.1原理
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
2.2实验步骤
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：
1取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。
涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2 涂片：
液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3 晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4 固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5 染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6 水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
7 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
8 脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。
9 复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。
至此，革兰氏染色结束。
2.3染色结果
革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
缺陷假单胞菌是革兰氏阴性菌
3．靛基质（Indole）试验
3.1 原理
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
3.2 试验方法
将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml 培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
缺陷假单胞菌为阴性结果
4．甲基红试验
4.1 原理
某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。
若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。
4.2 方法
挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C （以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。
迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
4.3 结果
呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。
缺陷假单胞菌为阴性结果
5. V-P试验
培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g，完全溶解于1000ml水中后，
分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。
5.1 原理
某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）
→2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。
5.2 方法
5.2.1 O’Meara’s法
试剂：40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中，加入0.3g肌酐即成。
用琼脂培养物将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于35～37℃（哈夫尼亚菌则应在22～25℃）培养48-96小时，。
于每毫升培养物中加入0.1ml，猛烈摇振混合。
5.2.2 Baritt’s法
试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。
同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。
5.3 结果
试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应，如无反应，应放在
36±1℃下培养4h再进行观察。
（长时间无反应，可置室温过夜），次日不变者为阴性。
缺陷假单胞菌为阴性结果
6. 过氧化氢酶试验
6.1 试剂
3%过氧化氢溶液：临用时配制。
6.2 方法
挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。
6.3 结果
于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
缺陷假单胞菌为阳性结果
7. 细胞色素氧化酶试验
7.1试剂
1%盐酸二甲基对苯二胺溶液，1%α-萘酚－乙醇溶液。
7.2 方法
取37℃(或低于37℃)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各2～3滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。
如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。
7.3 结果
于2min内呈现蓝色者为阳性。
阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。
缺陷假单胞菌为阳性结果
8. 麦康基琼脂培养基试验
麦康基琼脂培养基一种用于分离鉴定细菌的培养基，大肠杆菌在其上呈红色或粉红色，有的菌落只是中间呈现红色。
由于含有胆酸盐，能抑制革兰氏阳性菌生长，有利于大肠杆菌和沙门氏菌的生长。
以麦康基琼脂培养基培养检测细菌，观察其生长情况。
9. 溴烷铵耐受性试验
十六烷基三甲基溴化铵属阳离子表面活性剂，有较强的杀菌作用。
主要是改变细菌细胞的通透性，使菌体内的氯、磷和其他物质逸出，细菌发生自溶。
亦能使菌体蛋白质变性沉淀，从而导致细菌死亡。
在一定浓度下，此培养基抑制大肠埃希氏菌生长，并使革兰氏阳性菌生长差。
对铜绿假单胞菌无抑制作用，表现有很强的选择性。
以十六烷基三甲基溴化铵琼脂培养细菌，观察其生长情况。
