脲酶、蛋白酶和L-天冬酰胺酶活性测定方法

大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。

空白试验：不加尿素，其他同上。

品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。

•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。

四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。

尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。

一、实验目的1. 了解脲酶的基本性质及其催化反应原理。

2. 掌握脲酶活性测定的实验方法。

3. 通过实验验证脲酶活性受温度、pH值等因素的影响。

二、实验原理脲酶是一种水解脲的酶，可以将脲分解为氨和二氧化碳。

在酸性条件下，氨与苯酚反应生成蓝色络合物，通过测定蓝色络合物的吸光度，可以计算出脲酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：脲酶溶液、脲底物、苯酚、硫酸、NaOH、pH缓冲液、蒸馏水、移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。

2. 实验仪器：移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。

四、实验方法1. 配制脲酶溶液：取一定量的脲酶粉末，加入适量的蒸馏水溶解，配制成一定浓度的脲酶溶液。

2. 配制底物溶液：将脲底物与苯酚按照一定比例混合，加入适量的硫酸，配制成底物溶液。

3. 脲酶活性测定：a. 取一定量的脲酶溶液，加入底物溶液，混匀；b. 将混合液置于恒温水浴锅中，设定一定的温度；c. 在一定时间内，每隔一定时间取样，用紫外可见分光光度计测定吸光度；d. 根据吸光度计算脲酶活性。

五、实验结果与分析1. 温度对脲酶活性的影响：a. 在不同温度下（如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析温度对脲酶活性的影响。

2. pH值对脲酶活性的影响：a. 在不同pH值条件下（如pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析pH值对脲酶活性的影响。

六、实验结论1. 温度对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着温度的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适温度后，脲酶活性逐渐降低。

2. pH值对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着pH值的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适pH值后，脲酶活性逐渐降低。

七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制温度和pH值，以保证实验结果的准确性。

2. 操作过程中注意移液器的准确使用，避免污染和误差。

一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。

使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。

在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。

取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。

脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

摘要：本实验旨在利用酶标仪检测脲酶活性，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，研究不同条件下脲酶的活性变化。

实验结果表明，酶标仪能够准确、快速地测定脲酶活性，为相关研究提供有力工具。

关键词：酶标仪；脲酶；ELISA；活性测定一、引言脲酶是一种广泛存在于生物体内的酶，主要催化尿素分解为氨和二氧化碳。

脲酶在生物体内具有重要作用，如参与氮代谢、氮循环等。

近年来，脲酶的研究在农业、医药、环保等领域具有重要意义。

为了准确、快速地测定脲酶活性，本研究采用酶标仪进行ELISA实验，探讨不同条件下脲酶活性的变化。

二、实验材料与仪器1. 实验材料：- 脲酶试剂盒（包括标准品、酶联试剂、洗涤剂等）- 样品（如尿液、组织等）- 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）2. 实验仪器：- 酶标仪- 洗板机- 移液器- 低温离心机- 培养箱三、实验方法1. 样品处理：- 将样品按照试剂盒说明书进行稀释和预处理。

- 将预处理后的样品置于低温离心机中，离心5分钟，取上清液。

2. ELISA实验：- 将酶联试剂按照说明书进行配制，加入待测样品，进行酶联反应。

- 加入底物，进行显色反应。

- 加入终止液，终止反应。

- 使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。

3. 数据处理：- 将实验数据与标准曲线进行拟合，计算脲酶活性。

四、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 以酶联试剂的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

- 标准曲线线性良好，相关系数R²>0.99。

2. 不同条件下脲酶活性变化：- 在不同pH、温度、酶浓度等条件下，脲酶活性存在显著差异。

- 在pH 7.4、温度37℃、酶浓度1 U/mL的条件下，脲酶活性最高。

3. 实验结果分析：- 本实验采用酶标仪进行ELISA实验，能够准确、快速地测定脲酶活性。

- 不同条件下脲酶活性存在显著差异，可能与酶的稳定性、活性位点暴露程度等因素有关。

五、结论本实验通过酶标仪ELISA技术，成功测定了不同条件下脲酶的活性。

酶活性测定方法汇编一、过氧化氢酶活性的测定——J.L.Johnson和K.L.Temple法1. 主要试剂（1）3%过氧化氢，临时配制（2）3N硫酸：8.4ml浓硫酸溶于水，定容至100ml。

（3）0.1N高锰酸钾：3.161g高锰酸钾（AR）溶于水，定容至1000ml，于棕色瓶中保存。

2. 操作步骤称取2.0g过1mm筛孔的风干土壤于125mm的三角瓶中，注入40ml蒸馏水，5ml0.3%过氧化氢，振荡20分钟，加入5ml 3N硫酸，用滤纸过滤；吸取25ml滤液于100ml三角瓶中，用0.1N高锰酸钾滴定至微红色（30秒不变），记录高锰酸钾用量V1。

同时作对照（不加土壤）试验，高锰酸钾用量为V2。

3. 结果计算：Ｍ(0.1mol/L KMnO4 ml/g土)＝（V2—V1）T/g T为校正值二、蛋白酶活性的测定——G.Hoffman和K.Teicher法1. 主要试剂（1）2%白明胶水溶液。

（2）甲苯（3）CaCO3（4）青色溶液：10g Cu(NO3)2*H2O 溶于700ml水中，加入250g CH3COONa•3H2O，定容。

（5）甘氨酸标准溶液：267.9mg 甘氨酸溶于水，定容至1000ml (50µg/ ml 氨态氮)。

（6）标准曲线：取0~20ml甘氨酸标准溶液，加入20ml水，加2ml 铜溶液，比色测定。

2. 操作步骤称取10.0g过1mm筛孔的风干土壤于100mlL量瓶中，加入500mg 碳酸钙，1.5ml 甲苯。

15分钟后，加入20ml 2%白明胶溶液。

混合均匀，在37℃恒温箱中放置20小时，用38℃热水稀释至刻度。

同时用水代替白明胶作对照。

过滤，吸取10ml滤液于50ml 三角瓶中，加入10ml水和2ml铜溶液，定容。

用4cm比色皿于650nm处与标准溶液一起测定.3.结果计算M(NH2-N mg/g土)= (X样品- X对照- X无基质)×25÷10三、脲酶活性的测定——E. Hofmann与W. Schmidt法1. 主要试剂（1）10% 尿素。

蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。

磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。

由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。

利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。

2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。

3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。

3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。

实验四脲酶活力测定(纳氏试剂比色法)一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。

反应式：(NHO2CO+ HO ^脲酶＞2NH3 + CO2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。

反应式：NH・ F2O+ 2KHgl4 + 3KOH ■—HgO • HgNH + 7KI + 3H 20(纳氏试剂) (碘化氨氧合汞)二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3支干净干燥试管，编号：1空白；2、标准；3、样品。

按下表步骤加入实验制备的酶液及试剂：(7)从样品管加尿素开始计时，准确反应5min,立即向样品管(3号管)加1 mol -L HSQ 1.00mL，终止反应。

(8)另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色(9)各管混匀后，30min内，用分光光度计测试:比色记录A260nm A i A A3三、结果计算脲酶活力(U • mL -1) = ( A 3 - A 1 ) *标准管中的NH微摩尔数(A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数式中：n为酶样品的稀释倍数四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。

2、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。

3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。

4、磷酸盐缓冲液（pH7.0）: 6.70 g Na2HPO4 • 2 H2O , 3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。

5、 1 mol • L -1 HSQ溶液：56mL浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。

6、硫酸铵标准溶液：称取在60° C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL。

此溶液含NH3为40卩mol • mL-1。

第1篇一、目的本规程旨在规范脲酶试验的操作流程，确保试验结果的准确性和可靠性。

二、原理脲酶是一种催化脲分解成氨和二氧化碳的酶。

在本试验中，脲酶将脲分解，产生的氨与酸化后的水杨酸酚反应，生成紫色化合物，通过比色法测定脲酶的活性。

三、试剂与材料1. 试剂：- 脲酶试剂：含有脲、水杨酸酚、氢氧化钠、硫酸铜等成分的溶液。

- 酸化试剂：含有硫酸的溶液。

- 标准氨溶液：已知浓度的氨溶液。

- 比色试剂：用于比色的溶液。

- 比色仪：用于测定吸光度的仪器。

2. 材料：- 试管：用于加样和反应的容器。

- 移液器：用于精确量取试剂的仪器。

- 磁力搅拌器：用于混合溶液的仪器。

四、操作步骤1. 标准曲线制备：- 准备一系列已知浓度的氨溶液。

- 将氨溶液加入试管中，每组加入2ml。

- 加入等体积的酸化试剂，混匀。

- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用比色仪测定吸光度，以氨浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 脲酶活性测定：- 准备待测样品，按需稀释。

- 将样品加入试管中，每组加入2ml。

- 加入等体积的酸化试剂，混匀。

- 加入等体积的脲酶试剂，混匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用比色仪测定吸光度。

- 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。

五、注意事项1. 试剂应保存在阴凉、干燥、避光处，避免与有机溶剂接触。

2. 操作过程中应避免样品污染，确保实验结果的准确性。

3. 试剂加入顺序应严格按照操作规程进行，避免产生误差。

4. 实验过程中，严格控制反应时间，确保反应完全。

5. 使用比色仪时，注意校准仪器，确保测量结果的准确性。

六、结果记录与分析1. 记录每组实验的吸光度值。

2. 根据标准曲线，计算样品中脲酶的活性。

3. 对实验结果进行统计分析，判断脲酶活性是否符合预期。

七、质量控制1. 定期进行空白试验，以排除试剂和操作过程中的干扰。

2. 使用已知脲酶活性的标准样品，对实验结果进行校准。

3. 定期对仪器进行维护和校准，确保实验结果的准确性。