土壤脲酶活性测定(改良靛酚蓝比色法)

土壤脲酶的测定方法（改良靛酚蓝比色法）一、原理以尿素为底物，经培养后根据脲酶酶促产物--氨（忽略硝化过程造成的氨氮损失）在碱性介质中与苯酚、次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。

该生成物数量与氨浓度成正比。

后即称为靛酚蓝比色法，其结果精确性较高，重现性较好，在脲酶活性测定中的应用最为广泛。

二、试剂1）甲苯1ml/ps注：甲苯易挥发，要在通风条件好的地方操作。

2）5%尿素：称取5g尿素，用水溶至100ml。

10ml/ps3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

20ml/ps注：柠檬酸和氢氧化钾混合时大量放热，需小心缓慢混合，冷却后定容。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

4ml/ps注：实际配比为：125g苯酚+4ml甲醇+37ml丙酮+25ml乙醇，混合溶解为A液。

54g氢氧化钠溶解为B液，冷却后备用。

A+B,定容至1000ml即得苯酚钠溶液。

苯酚有毒，常温下凝固，不宜称取，需小心。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

3ml/ps注:一般次氯酸钠溶液瓶上标注为活性≥5.5%，163.64ml次氯酸钠定容至1000ml。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至500ml，得到1ml含有0.2mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取5ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。

二、器材50ml三角瓶，50ml容量瓶，漏斗，25ml试管，定量滤纸，振荡器，分光光度器四、操作步骤1）称取5g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，盖好；注：实际称取2g土。

微量法土壤脲酶（S-UE）活性检测试剂盒说明书注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：UPLC-MS-4045规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件试剂一液体2mL×1瓶（自备）2-8℃保存试剂二粉剂×2瓶2-8℃保存试剂三液体20mL×1瓶2-8℃保存试剂四A液液体1mL×1支2-8℃保存试剂四B液液体4mL×1瓶2-8℃保存试剂五液体0.3mL×1瓶2-8℃保存标准品液体1mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂一：自备甲苯；2、试剂二：临用前取1瓶加入2.7mL蒸馏水，充分溶解待用，用不完的试剂2-8℃保存4周；3、试剂四：临用前将A液和B液按体积比1：4混合待用；用多少配多少；4、试剂五：液体置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。

临用前加入5.7mL蒸馏水，混匀，待用；用不完的试剂2-8℃保存两周；5、标准品：1mg/mL氮标准液。

产品说明：S-UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。

土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。

土壤脲酶活性反应了土壤的氮素状况。

利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。

Urea S-U E NH4++H2CO3NH4++ClO-+Phenol Alkaline solution Indophenol Blue(630nm)注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、30-50目筛、研钵、冰、甲苯（不允许快递）和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30~50目筛。

一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。

使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。

在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。

取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。

脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

土壤脲酶实验常见问题解答土壤脲酶实验常见问题解答在土壤科学研究领域，脲酶实验是一种常用的方法来评估土壤中有机氮的分解和转化情况。

然而，进行土壤脲酶实验时，常常会遇到一些问题和困惑。

本文将对土壤脲酶实验常见问题进行解答，并分享我对这一主题的观点和理解。

1. 什么是土壤脲酶？土壤脲酶是一种存在于土壤中的酶类，能够催化尿素转化为氨和二氧化碳。

它是土壤中重要的氮转化酶之一，能够反映土壤中有机氮的分解和微生物活动状况。

2. 如何进行土壤脲酶实验？进行土壤脲酶实验需要提取土壤中的酶活性，并通过添加一定浓度的尿素来测定其催化能力。

具体操作步骤包括：取样、配制试剂、提取酶液、加入底物、反应恒温、停止反应、测定氨氮浓度等。

3. 有哪些因素会影响土壤脲酶活性的测定？土壤脲酶活性的测定受到多种因素的影响，主要包括土壤湿度、温度、pH值、底物浓度、反应时间等。

其中，温度和湿度是影响酶活性的重要因素，一般来说，适宜的温度和湿度能够促进酶活性的表现。

4. 土壤脲酶活性与土壤质地有关吗？土壤质地对土壤脲酶活性有一定的影响。

砂质土壤通透性好，空气含量较高，利于土壤中微生物的生长和代谢，因此一般来说砂质土壤的脲酶活性相对较高。

而黏土质地的土壤因为颗粒粘结，通气性较差，微生物的代谢活动受到限制，脲酶活性相对较低。

5. 土壤脲酶活性与土壤肥力有关吗？土壤脲酶活性与土壤肥力密切相关。

高肥力土壤中有机氮含量较高，土壤中微生物的生长和繁殖条件良好，因此一般来说高肥力土壤的脲酶活性相对较高。

相反，低肥力土壤中有机氮含量较低，微生物活动相对较弱，脲酶活性也较低。

6. 土壤脲酶实验有何应用价值？土壤脲酶实验可以评估土壤中有机氮的分解和转化情况，为合理施肥和农田管理提供科学依据。

通过监测土壤脲酶活性的变化，还可以了解土壤环境质量、土壤健康状况以及土壤中微生物群落结构的变化。

总结：通过对土壤脲酶实验常见问题的解答，我们可以更深入地了解土壤脲酶及其在土壤科学研究中的重要性。

土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的方法，它可以测量土壤中脲酶的存在和活性。

这种方法通常使用一种叫做脲酶试剂盒的工具，该试剂盒中包含了所需的试剂和比色剂。

具体的测试步骤如下：
取一定量的土壤样品，并加入适量的水，搅拌均匀。

将混合物加入试剂盒中，加入脲酶试剂。

按照试剂盒中的说明，在一定的时间内进行反应。

比较样品的颜色和标准对照物的颜色，并记录下来。

根据脲酶试剂盒的不同，颜色的变化可能会有所不同。

一般来说，脲酶的存在和活性越高，样品的颜色就会越深。

通过对样品颜色的比较，就可以知道土壤中脲酶的存在和活性水平。

请注意，这种方法只能测量土壤中脲酶的活性水平，并不能测量脲酶的种类和数量。

土壤脲酶活性的比色法测定是一种常用的测量土壤中脲酶存在和活性的方法。

它使用脲酶试剂盒，包含所需试剂和比色剂。

测试步骤包括取样、加水搅拌、加入试剂盒、反应并比较颜色。

结果表明，脲酶存在和活性越高，样品颜色越深。

注意，这种方法只能测量脲酶活性水平，不能测量脲酶种类和数量。

土壤与环境微生物研究法／李振高，骆永明，滕应编著．一北京：科学出版社，2008过氧化氢酶（398-399）脲酶（404-405）磷酸酶（412-413）关松荫/土壤酶及其研究法农业出版社 1986年七月第一版蔗糖酶274-276土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，加蒸馏水90ml。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中，另取147.5g KOH 溶于蒸馏水，再将二种溶液合并，用1N NaOH将pH调节至6.7，用水稀释至1L。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A 液），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B液）,存于冰箱中。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将两种溶液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg 氮的标准液（100ppm）。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即为10ppm，吸取0、1、2、3、4、5、10、15、20 mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。

即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。

将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

土壤脲酶的测定方法（改良靛酚蓝比色法）一、原理以尿素为底物，经培养后根据脲酶酶促产物--氨（忽略硝化过程造成的氨氮损失）在碱性介质中与苯酚、次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。

该生成物数量与氨浓度成正比。

后即称为靛酚蓝比色法，其结果精确性较高，重现性较好，在脲酶活性测定中的应用最为广泛。

二、试剂1）甲苯1ml/ps注：甲苯易挥发，要在通风条件好的地方操作。

2）5%尿素：称取5g尿素，用水溶至100ml。

10ml/ps3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

20ml/ps注：柠檬酸和氢氧化钾混合时大量放热，需小心缓慢混合，冷却后定容。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

4ml/ps注：实际配比为：125g苯酚+4ml甲醇+37ml丙酮+25ml乙醇，混合溶解为A液。

54g氢氧化钠溶解为B液，冷却后备用。

A+B,定容至1000ml即得苯酚钠溶液。

苯酚有毒，常温下凝固，不宜称取，需小心。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

3ml/ps注:一般次氯酸钠溶液瓶上标注为活性≥5.5%，163.64ml次氯酸钠定容至1000ml。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至500ml，得到1ml含有0.2mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取5ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。

二、器材50ml三角瓶，50ml容量瓶，漏斗，25ml试管，定量滤纸，振荡器，分光光度器四、操作步骤1）称取5g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，盖好；注：实际称取2g土。

一、脲酶活性测定方法（苯酚钠-次氯酸钠比色法）1.称取5g过100目筛的风干土样于50ml容量瓶中，加入1ml甲苯使其与土样充分混匀静置15min，使土壤中微生物被完全杀死；2.往瓶中加入10ml 100g/L的尿素溶液和20ml柠檬酸盐缓冲液，仔细混匀后置于37℃恒温下培养24h；3.用加热至38℃的蒸馏水稀释至刻度线（甲苯应浮在刻度线之上），摇匀，过滤；4.每一土样都设置用水代替基质的对照；对整个实验，设置无土壤的对照，以检验试剂的纯度；5.吸取3ml滤液到50ml容量瓶中，用水稀释至15ml，然后加入4ml苯酚钠溶液，并加入3ml次氯酸钠溶液，每次加完试剂都要摇匀；6.静置20min后，使其充分显色，定容显色液，于分光光度计578nm处比色，脲酶活性以24h后1g土壤中铵态氮的mg数表示。

1.取25ml酪氨酸基质溶液于100ml三角瓶中，于30℃水浴保温；2.加入5g鲜土，1ml甲苯，混匀后，30℃恒温箱中培养48h；3.取出三角瓶，加入25ml蛋白质沉淀剂，静置30min，待蛋白质沉淀后用干滤纸过滤；4.取2ml滤液于试管中，加入0.55mol/L Na2CO35ml，33% Folin试剂1ml，立即振荡；5.将试管放入30℃恒温水浴中，显色30min；6.用分光光度计在波长680nm处测定光密度，由标准曲线查出酪氨酸含量。

1.称取5g鲜土（过10目）于50ml刻度试管中，加0.2ml甲苯和9ml Tris缓冲液，混匀后加入1ml 0.05mol/L L-天冬酰胺溶液，混匀，37℃下培养2h后，加入35ml KCl-Ag2SO4混合溶液，混合均匀，静置冷却至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4混合溶液定容，混匀；2.吸取20ml L-天冬酰胺溶液前，加入KCl-Ag2SO4混合溶液。

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。

（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。

3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到1mL含有0.1mg氮的标准液。

（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了10倍，吸取1，3，5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。

将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g土壤置于100mL容量瓶中。

用2mL甲苯处理15分钟。

往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。

仔细混合后，将瓶放在37℃恒温箱中，放置3 h。

与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定。

培养结束后，用热至38℃的水稀释至刻度。

摇匀，将悬液过滤。

吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。

然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。