碱性磷酸酶染色

干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶之一。

1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。

自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2 偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）【步骤】（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。

（2）蒸馏水冲洗。

（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。

（4）流水冲洗，晾干。

（5）甘油明胶封固。

【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。

3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。

【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。

【步骤】（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。

碱性磷酸酶中性粒细胞碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。

但它不是单一的酶，而是一组同功酶。

目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。

其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。

血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。

生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。

目录生物化学特征碱性磷酸酶偏高的原因碱性磷酸酶高对身体有何影响人体内的来源测定方法正常范围临床意义抑制作用•肝胆疾病引起的ALP升高•碱性磷酸酶偏低的原因生物化学特征碱性磷酸酶名字alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)，现多用ALP细菌ALP二级结构(蓝色为N末端红色为C末端)骨软化症。

佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时，血清碱性磷酸酶亦可升高，应加以鉴别。

研究应用碱性磷酸酶也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。

与辣根过氧化物酶（HRP)相比，ALP用作标记酶的优点是，稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高，标记困难。

在研究中最常用的ALP如下：◇细菌碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase (BAP), 来源：Escherichia coli C4 ；◇ Shrimp alkaline phosphatase (SAP), 来源：一种北极虾 (Pandalus borealis) ;◇ 小牛肠碱性磷酸酶Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP);◇ 胎盘碱性磷酸酶Placental alkaline phosphatase (PALP)和分泌性碱性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP)，后者是前者的C末端短缺版——与PALP相比，SEAP没有PALP的C末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域) ALP主要应用于分子生物学和酶免分析中：★分子生物学中主要用作核酸的去磷酸化。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液（NAP）预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查检验原理：本染色方法为偶氮偶联法，在PH9.2-9.8的碱性环境下，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚AS-BI水解，生成α-萘酚，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中主要组成成分：储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。

样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血）检验方法：一、工作液配制（一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是43ml,至少可同时放置8-10张涂片）1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；2、染缸（自备染液缸）内加入蒸馏水40ml；3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀4、再加D液1ml入染缸内，轻轻混匀（二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是2.15ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。

操作：取B液50μl,C液50μL混匀，静置2分钟，再加蒸馏水2ml，D液50μl,混匀，二、染色步骤1、干燥涂片，滴加A液固定剂（用前恢复室温，并充分摇匀）固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，甩干；2、滴加或浸入工作液15分钟，蒸馏水冲洗2-3分钟，甩干3、E液(使用前务必摇匀！)复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检4、计算积分：反应结果以积分值报告，油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，所有阳性细胞积分相加即为积分。

如：参考范围：阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶核粒细胞）中，健康成人一般的中性粒细胞碱性磷酸酶积分值为13-130，但各个实验室条件各异，实验室应有自己的参考值。

检验结果的解释NAP阳性颗粒为蓝色检验方法的局限性仅限于形态学染色观察使用注意事项1、5Tests只限滴染使用2、使用前应恢复室温，用前请摇匀试剂；B,C液请充分混匀，所用容器必须洁净，工作液颜色为金黄色3、应采用新鲜涂片作NAP染色,放置过久则酶的活性会降低；使用抗凝血涂片染色阳性结果不稳定4、工作液配制以后应在十分钟以内使用5、需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照6、每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果7、本品应由专业人士使用及进行结果的判读7、使用前应详细阅读使用说明书及产品包装标识，在有效期内使用，并做好个人卫生防护8、生产批号、效期见外包装9、用后应按医院或环保部门要求处置废弃物。

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT (四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下,BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应,形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

使用方法1. 在膜或组织切片,最后一次洗涤完毕后,加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时),直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存;组织切片或细胞样品,显色反应终止后,可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶,同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法:1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下,以镁离子作为激活剂,能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸,磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙,再与硝酸钴作用形成磷酸钴,经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】(1)将无菌的玻片放入培养皿中,传代时加入适量的细胞悬液,作细胞爬片,呆细胞长满玻片后取出。

(2)PBS冲洗后用冷丙醇固定10min,蒸馏水冲洗数次。

(3)入孵育液中,37℃孵育4-6h。

自来水冲洗数次。

(4)2%硝酸钴中浸3-5min,蒸馏水洗数次。

(5)1%的硫化铵中2min,自来水冲洗,自然干燥,封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2偶氮偶联法:【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液(PH 9.2)50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10,混合后过滤使用。

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510631201.6(22)申请日 2015.09.29G01N 1/30(2006.01)(71)申请人上海太阳生物技术有限公司地址201108 上海市闵行区金都路3419号(72)发明人谢永华 朱美萍 许付(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人赵青朵(54)发明名称碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)(57)摘要本发明涉及生物技术领域，公开了一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。

本发明所述试剂盒包括pH 值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。

本发明以碱性磷酸酶底物替代现有萘酚AS-BI 磷酸钠盐、萘酚AS-MX 磷酸钠盐等进行NAP染色，该底物化学结构中通过引入发色基团联苯基，增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度和阳性染色。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 105181423 A 2015.12.23C N 105181423A1.一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒，其特征在于，包括pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机盐。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述基质缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种。

4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠或氯化镁。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色实验条件探讨【摘要】目的探讨中性粒细胞碱性磷酸酶染色的实验条件。

方法用40%、60%、80%的丙酮-枸缘酸固定液对中性粒细胞碱性磷酸酶染色固定条件进行测定。

同时用2-氨基-2-甲基-1.3-丙二醇(pH9.4-9.6)缓冲液、巴比妥(pH9.2)缓冲液、Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液分别在10、15、20分钟的染色条件进行测定。

结果是选择60%的丙酮-枸缘酸固定30秒染色结果最好。

三种不同的缓冲液和三个不同的孵育时间的染色结果经多因素方差分析，P<0.05，结果有统计学意义。

结论最佳染色条件为60%的丙酮-枸缘酸固定30秒，用Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液，孵育时间为15分钟。

本方法帮助鉴别慢性粒细胞性白血病和类白血病有较大的实用价值。

【关键词】中性粒细胞;碱性磷酸酶;白血病;类白血病ABSTRACT Objective To discuss the experimental conditions of neutrophil alkaline phosphatase staining. Methods The immobilizing conditions of neutrophil alkaline phosphatase staining were detected by the stationary liquid of 40%， 60% and 80% acetone-citric acid， and at the same time， the staining conditions were detected at 10， 15 and 20 minutes in the matrix liquid prepared respectively with 2-amino-2-methyl-1.3-propylene glycol (PH9.4-9.6) buffer， barbital (PH9.2) buffer and Tris (PH9.2) buffer. Results Fixing in 60% acetone-citric acid for 30 seconds gave out the best staining results; the staining results of the three different buffers and the three different incubating times received the multiple factor variance analysis， the differences among them was of statistical significance (P<0.05). Conclusions The best staining conditions include fixing in 60% acetone-citric acid for 30 seconds， the matrix liquid prepared with Tris (PH9.2) buffer and incubation for 15 minutes; this method is of practical value in helping identify chronic myeloid leukemia and leukemoid reaction.KEYWORDS neutrophil alkaline phosphatase leukemia leukemoid reaction中性粒细胞碱性磷酸酶主要存在于中性成熟粒细胞，在pH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸奈酚钠底物，释放出奈酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。

碱性磷酸酶染色
1.量45毫升去离子水，调节温度至18–26°C
2.重氮盐溶液的制备：添加1毫升的亚硝酸钠溶液，在碱性溶液 1 mL FBB。

混匀2分钟。

3.添加制备步骤2到步骤1去离子水中的溶液.
4.添加1毫升萘酚AS-BI碱性溶液，稀释的重氮盐溶液（步骤3）。

拌匀后倒入一个染色缸。

5.把柠檬酸盐- 丙酮甲醛固定液至室温（18-26℃）。

样品浸入固定液30秒。

去离子水轻轻冲洗45秒。

不要让样品干燥。

6.添加碱性染料混合物（步骤4）和孵育18–26°C ,15分钟；避光；使用后丢弃碱性染料混合物
7.孵育箱温育15分钟后，取出去离子水冲洗2分钟。

不要让切片干燥。

8.中性红溶液染色2分钟。

9.自来水冲洗和自然彻底，镜下观察。

实验十二常用血细胞化学染色Cytochemistry stain for blood cells一、过氧化物酶染色染色原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。

联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。

试剂器材1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。

2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。

3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。

4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。

5．瑞氏(Wright)染色液。

6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。

操作步骤1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。

2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。

3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。

4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。

注意事顶1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。

2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。

3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。

涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。

若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。

4．染色液pH应为5.5。