碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)使用说明自备材料：1、载玻片、湿盒2、普通光学显微镜产品简介：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。

此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸不萘酚，后者不偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。

该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。

操作步骤(仅供参考)：一、涂片或切片1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蜡切片无需固定)，水洗。

2、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，水洗。

3、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。

4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。

二、贴壁培养细胞1、取6孔板或其他容器培养的细胞，弃液，PBS清洗干净。

2、加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。

3、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，PBS清洗。

4、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。

5、PBS清洗、镜检。

注意事项：1、血液或骨髓细胞涂片或其他样本均应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。

2、培养细胞染色操作过程中，清洗、染色等步骤都应轻微，以免损伤或丢失细胞。

碱性磷酸酶一、钙-钴法光镜显示方法（1）孵育液的配制：3％β-甘油磷酸钠 10ml （底物）2％巴比妥钠 10ml （缓冲液）2％氯化钙 20ml （捕获剂）5％硫酸镁 5ml （激活剂）双蒸水（D.W） 5ml孵育液最终pH值9.4，置于冰箱保存。

（2）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片（可用10％福尔马林固定10min，或不固定）；②入孵育液，恒温37℃孵育 30～60min （磷酸钙沉淀形成）③流水冲洗 5min④置2％硝酸钴内 2min （磷酸钴形成）⑤蒸馏水冲洗；⑥置1％硫化铵溶液内 1min （硫化钴形成，脂溶性沉淀）⑦蒸馏水冲洗甘油明胶封固。

（3）结果与评价:碱性磷酸酶活性产物为棕黑色硫化钴沉淀。

（4）对照：从孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制剂的方法，则酶活性反应为阴性。

二、偶氮-偶联法光镜显示方法（1）孵育液的配制：萘酚AS（或萘酚AS-MX） 10～25mg（底物）溶于N，N-二甲基甲酰胺液 0.5ml（促溶剂）0.2mol/L Tris盐酸缓冲液（pH9.2） 50ml（缓冲液）坚牢蓝B（或BB，RR，或坚牢红TR或坚牢蓝VRT） 50mg（捕获剂）（以上尽可能混合和过滤，必要时可用氢氧化钠调整pH9.0～9.2值）。

（2）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片；②入孵育液，恒温37℃（或室温下）孵育5～60min （有色沉淀形成）③双蒸馏水冲洗 3～5min④4％甲醛，室温下固定 10～50min⑤蒸馏水冲洗 3～5min⑥甘油明胶封固。

（脂溶性沉淀）（3）结果与评价：采用不同的重氮盐，酶的活性显色也不同，用坚牢蓝B（或BB，RR）酶活性呈蓝色-紫色，用坚牢红TR (或坚牢紫B）酶活性呈红色。

中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色偶氮偶联法[原理]中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在碱性环境中，能水解磷酸萘酚钠，释放的萘酚与重氮盐作用生成不溶性有色的偶氮染料，定位于胞浆中。

[试剂](1)固定剂，为40％甲醛25m1，加无水乙醇至100m1。

(2)丙二醇缓冲液。

①贮备液(0．2mol/L 2—氨基-2-甲基-1，3-丙二醇液)为2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇10．5g，蒸馏水加至500ml。

②应用液(0.05mol/L pH9.75)，为0．2mol/L贮备液25m1， o.1mol/L盐酸 5m1，蒸馏水加至100m1。

(3)基质孵育液pH9.5-9．6(用前临时配制)，α—磷酸萘酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20m1，再加坚牢蓝RR(或坚牢紫酱)20mg，混合后用滤纸过滤，立即应用。

(4)10g/l亮绿。

[操作](1)新鲜血片或骨髓片用4-10℃的固定剂固定30秒。

(2)、在涂片上滴加新配过滤的孵育液，在室温下作用10-15分钟。

(3)水洗，10g/L亮绿复染2分钟。

(4)水洗，晾干镜检。

[结果观察](-)：阴性反应。

(+)：胞浆中含少量紫黑色，无紫黑色颗粒或红色物质。

(++)：胞浆中含有中等量紫黑色颗粒或呈弥漫红色。

(+++)：胞浆中有丰富的紫黑色颗粒或弥漫较深红色。

(++++)：有极丰富的大紫黑色颗粒或弥漫深红色。

[参考值]中性粒细胞碱性磷酸酶活性积分值为10—50分。

[临床意义]基本同改良Gomor；氏钙钻法。

编写：谢平制定日期：2011.12.1[附注](1)若涂片不能及时测定，可固定干燥后放冰箱4℃保存。

(2)在甘油磷酸钠和巴比妥钠应临用前称取，分别为0．38和0．28，再加蒸馏水20m1即配成。

配制后的β-甘油磷酸钠不宜久放。

(3)涂片从孵育液拿出可不用水洗，直接加硝酸钻，但与硝酸钴作用后，应反复水洗，以免残留的硝酸钻与硫化胺作用后使整个涂片变黑，造成假阳性。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液（NAP）预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查检验原理：本染色方法为偶氮偶联法，在PH9.2-9.8的碱性环境下，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚AS-BI水解，生成α-萘酚，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中主要组成成分：储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。

样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血）检验方法：一、工作液配制（一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是43ml,至少可同时放置8-10张涂片）1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；2、染缸（自备染液缸）内加入蒸馏水40ml；3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀4、再加D液1ml入染缸内，轻轻混匀（二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是2.15ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。

操作：取B液50μl,C液50μL混匀，静置2分钟，再加蒸馏水2ml，D液50μl,混匀，二、染色步骤1、干燥涂片，滴加A液固定剂（用前恢复室温，并充分摇匀）固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，甩干；2、滴加或浸入工作液15分钟，蒸馏水冲洗2-3分钟，甩干3、E液(使用前务必摇匀！)复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检4、计算积分：反应结果以积分值报告，油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，所有阳性细胞积分相加即为积分。

如：参考范围：阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶核粒细胞）中，健康成人一般的中性粒细胞碱性磷酸酶积分值为13-130，但各个实验室条件各异，实验室应有自己的参考值。

检验结果的解释NAP阳性颗粒为蓝色检验方法的局限性仅限于形态学染色观察使用注意事项1、5Tests只限滴染使用2、使用前应恢复室温，用前请摇匀试剂；B,C液请充分混匀，所用容器必须洁净，工作液颜色为金黄色3、应采用新鲜涂片作NAP染色,放置过久则酶的活性会降低；使用抗凝血涂片染色阳性结果不稳定4、工作液配制以后应在十分钟以内使用5、需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照6、每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果7、本品应由专业人士使用及进行结果的判读7、使用前应详细阅读使用说明书及产品包装标识，在有效期内使用，并做好个人卫生防护8、生产批号、效期见外包装9、用后应按医院或环保部门要求处置废弃物。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色偶氮偶联法1.实验原理在PH9.2-9.8的缓冲溶液中，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸苯酚钠水解，生成α-苯酚和磷酸钠，再以稳定的重氮盐与酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。

2.标本采集2.1病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史，凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠的妇女作骨穿时要慎重。

2.2标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液。

2.3标本采集要求：2.3.1高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

2.3.2临床上首选穿刺部位为髂后上棘，翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部位。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

3.标本储存：滴加95％乙醇盖满血膜10分钟，水洗待干，室温避光保存。

4.标本运输：室温运输。

5.标本拒收的标准：溶血，稀释标本不能作测定。

6.试剂：6.1试剂名称：中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂。

6.2试剂生产厂家：上海太阳生物技术公司6.3试剂组成：试剂1.固定剂：甲醛10ml加甲醇90ml混合，2℃~8℃避光保存，有效期6个月。

试剂2.贮存液：200mgα-磷酸苯酚钠(AS-BI)溶于1mlN-N二甲基甲酰胺+200mlTris-Hcl缓冲液，2℃~8℃避光保存。

试剂3.Tris-Hcl缓冲液，Tris4.85g溶于200ml蒸馏水，加浓Hcl1滴~2滴，PH固定为9.1。

试剂4.作用液：取贮存液2ml于温水中30℃预热5分钟加坚固蓝BB盐2mg，混合。

试剂5.中性红溶液：2℃~8℃避光保存。

7.操作步骤：7.1新鲜干燥涂片滴加固定剂作用2~5秒，水洗，待干。

7.2滴加作用液室温染色15~20分钟，水洗，待干。

7.3中性红复染3分钟，水洗，干后镜检。

8.结果判断：阳性反应，棕黑色颗粒定位于胞桨中。

在油镜下计数100个中性粒细胞，求出碱性磷酸酶阳性细胞百分比，并求出积分。

9.临床意义：NAP的积分，参考值为35-70分。

酶类染色液北京华越洋生物------------------------------------------------------碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。

二甲苯应采用AR以上级别。

碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法) 3×100ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色，适用于石蜡切片属于金属沉淀法,碱性磷酸酶活性出呈棕黑色,可能出现假阳性,采用阴性对照。

二甲苯应采用AR以上级别。

碱性磷酸酶-PAS联合染色液6×50ml 酶类染色40% 4℃,避光,3个月碱性磷酸酶染色与过碘酸雪夫试剂合用,同时显色碱性磷酸酶和PAS阳性物质。

适用于冰冻切片、石蜡切片,碱性磷酸酶活性部位呈黑色,PAS阳性物质呈紫红色。

染色过程中注意控制过碘酸处理的时间,否则容易褪色。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×2ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。

碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

油镜下计数100个中性粒细胞,求出百分比和积分。

非特异性反应少，结果可靠。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP) 4×10ml 酶类染色40% 4℃,避光,6个月专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法。

碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

油镜下计数101个中性粒细胞,求出百分比和积分。

非特异性反应少，结果可靠。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 4×2ml 酶类染色40% —20℃,避光,6个月用于石蜡切片、冰冻切片、骨髓细胞涂片、血液涂片等的碱性磷酸酶染色,又称同时偶联法碱性磷酸酶活性部位呈蓝色,位于胞桨中。

冰冻切片组织碱性磷酸酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途冰冻切片组织碱性磷酸酶活性染色试剂是一种旨在使用偶联偶氮技术，在底物存在的情况下，分析组织样本中碱性磷酸酶表达，而呈现亮红色沉淀现象的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心改良、成功实验证明的。

主要适用于动物组织冰冻切片，同时也适合原生代或培养细胞的酶活性检测。

尤其可用于骨组织病理生理的研究和干细胞分化能力的鉴定。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。

技术背景碱性磷酸酶（ALKALINE PHOSPHATASE）在碱性环境下催化各种醇和酚的磷酸酯水解，存在于活跃运输的膜上，如毛细血管及毛细血管的动脉部分的内皮，肾近曲小管壁边缘和小肠上皮的纹状缘，胎盘组织，未分化的干细胞等表达含量最为丰富。

它与骨质的形成，维持细胞内磷酸酶的浓度，以及与经膜吸收和转运过程有关。

偶联偶氮技术的基本原理为碱性磷酸酶水解底物（磷酸萘酯）释放出萘酚，立即为重氮盐所捕获而成为不溶性有色的偶氮染料。

实验最初（1944）应用β-萘磷酸盐作为底物，释放出的萘酚与重氮α-萘胺偶联，在酶的活动处形成有色沉淀。

Burstone （1962）推荐使用替代萘酚，如萘酚AS-MX磷酸盐。

重氮盐有很多种，但较适宜的有Fast blue RR，Fast red TR，Fast violet B，Fast blue VRT 和Fast black B。

偶联偶氮技术孵育时间短；稳定，灵敏；在正常组织中因无萘酚，故不需要对照；反应产物为偶氮染料难以溶解，不易弥散因而图象清晰。

产品内容清理液（Reagent A）120毫升固着液（Reagent B）10毫升反应液（Reagent C）10毫升染色液（Reagent D）5管产品说明书1份保存方式保存在4℃冰箱里，避免光照，有效保证6月用户自备甲基绿复染试剂盒（HL40010）或苏木素复染试剂盒（HL80050）：用于常规染色后复染小型染色缸：用于染色操作光学显微镜：用于组织细胞染色后观察分析实验步骤样本染色操作开始前，将试剂盒里的反应液（Reagent C）和染色液（Reagent D）置于室温下预热，并避光。