基因操作实验讲义
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硕士研究生基因操作实验技术实验讲义实验简介：本实验的目的是将嗜热脂肪芽孢杆菌AS 1411的淀粉酶结构基因（全长1.4kb）采用PCR方法扩增后接入大肠杆菌表达载体pLac18，构建成重组载体pLac18-amy，重组载体再转化大肠杆菌JM109，重组大肠杆菌可以在IPTG 的诱导下表达出耐热α-淀粉酶活性。
通过本实验的训练使学生在DNA重组，基因高表达方面得到全面的训练并加深对lac操纵子的理解。
实验一质粒DNA的提取、酶切、电泳鉴定1.1 实验材料LB培养基：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/LLB培养基II ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L，Glucose 5 g/L质粒小量快速提取试剂盒（由北京博大泰克公司赞助）含质粒pLac18的大肠杆菌JM109台式高速离心机‘水浴锅1.2 用硅胶膜分离法小量提取质粒这一方法的基本原理是在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。
用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，这时染色体和其他成分形成的复合物是比较脆弱的，如动作过于剧烈或处理时间过长则会有较多的染色体释放到清夜中在随后用溶液III处理时这部分染色体依然和质粒混在一起，由于质粒和染色体均属于DNA因此两者很难再被分开。
硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。
质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。
所有试剂均由试剂盒配套①接种重组大肠杆菌一环于含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
②取1.5 ml离心管，倒入约1.5 ml菌液。
8,000 r/m离心30 s。
弃尽上清。
③加入100 L溶液1，彻底悬浮菌体。
④加入150 L溶液2，颠倒离心管数次，使细菌完全裂解，溶液透明。
⑤加入150 l溶液3，颠倒离心管6-8次，可见白色絮状物产生，室温放置10 min，8,000 r/m离心3 min。
⑥在离心吸附柱中加入结合缓冲液（质粒提取专用）400 l，再将上清液加入离心吸附柱中，混匀，8,000 r/m离心30 s。
⑦倒弃收集管内液体，在吸附柱内加入500 l漂洗液，8,000 r/m离心30 s，洗去杂质。
⑧倒弃收集管内液体，8,000 r/m离心30 s，除去残留液体。
⑨将质粒纯化柱放在一干净的1.5 mL离心管中，加入75 l 洗脱缓冲液（elution buffer）至管内柱面上，放置10 min。
⑩8,000 r/m离心30 s，所得液体就是立即可用的超纯质粒。
1.3 质粒的酶切与电泳鉴定质粒的酶切实验材料质粒pLac18，上述实验提取限制性内切酶Eco R I、Hin d III：宝生物工程（大连）有限公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助，包括酶20 U/L，酶反应缓冲液等实验步骤1．取已灭菌的500L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12L，质粒5 L，缓冲液M 2 L，限制性内切酶1 L，混匀。
2．将上述溶液于37 ℃水浴30 min。
酶切产物的电泳实验材料和仪器50×TAE缓冲液：Tris 242 g，冰醋酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 100 mL，定容至1 LTAE缓冲液：取50×TAE缓冲液10mL，加入纯水至500 mL溴化乙锭溶液：10 mg，加水至1 mL，充分溶解琼脂糖：华美公司分装Amresco产品电泳槽：迷你-31B型，北京六一仪器厂（含电泳槽，制胶槽）电泳仪：DYY-6B 稳压稳流电泳仪凝胶成像仪：美国alpha22001．取50 mL小烧杯一个，加入琼脂糖0.14 g，加入TAE缓冲液20 mL，在电炉上煮沸。
2．放置到约50 ℃时，加入溴化乙锭溶液1 L，混匀，倒入制胶槽中，插上制胶梳子。
3．待凝胶凝固后，将凝胶放入电泳槽内，拔取制胶梳子。
4．取待检测DNA 4 L，加入0.5 L加样缓冲液，混匀。
5．将加入了加样缓冲液的待测样品加入加样孔中。
6．打开电泳仪，调节电压至50 V，保持稳压。
7．电泳约50min～，关闭电泳仪，小心取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，观察电泳结果。
实验二嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因的PCR扩增以及PCR产物的纯化2.1 实验材料：Taq DNA聚合酶（含Taq酶Buffer，dNTP）（注：本实验中PCR反应试剂用上海赛百盛公司TaqPremix代替，该产品已经预先加入了水，Taq DNA聚合酶，酶反应缓冲液和dNTP，做PCR反应时只要加入特异性的模板DNA和引物即可），内切酶Bam H I均为大连TaKaRa公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助。
小量PCR产物纯化试剂盒为上海生工生物技术公司产品。
2.2 实验步骤A 淀粉酶基因的PCR扩增与鉴定1．取200 µL PCR管一支按顺序加入：TaqPremix 反应液47µL引物: 2 µL嗜热脂肪芽孢杆菌染色体DNA 1 µL94℃变性10 min,加入Taq DNA聚合酶5个单位。
2．混合后进行PCR反应(94℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 120 s)，经过20个循环后在72℃延伸10 min。
电泳鉴定PCR结果B 用硅胶柱纯化PCR产物1. 取PCR产物（50 L），转移到一干净的1.5 mL离心管中，加入5倍体积的Binding Buffer（PB），混匀。
2. 将硅胶柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，室温放置2分钟；8,000 r/m 离心30 s。
3. 倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，加入500 L 漂洗液（Wash Solution），8,000 r/m离心30 s。
4. 重复步骤4。
5. 倒掉收集管中的废液，将硅胶柱放入同一根收集管中，8,000 r/m离心30 s。
6. 将硅胶柱放入一干净的1.5 mL离心管中，在硅胶柱的膜中央加入50 L TE Buffer，室温10 min。
7. 8,000 r/m离心30 s，离心管中的液体即为回收的DNA片段。
C. PCR产物的酶切鉴定1.取已灭菌的500L离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入双蒸水12L，质粒5 L，缓冲液K 2 L，限制性内切酶Bam H I 1 L，混匀。
2.将上述溶液于37 ℃水浴60 min，50V电泳60 min电泳鉴定酶切结果。
实验三感受态大肠杆菌JM109制备3.1 实验材料0.1mol/L CaCl2，纯水配制，过虑灭菌3.2 实验步骤1．挑取E.coli JM109单菌落于2ml液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
2．取0.2ml培养液于20mlLB培养基中，剧烈振荡培养约1小时。
3．取1.5ml离心管，加入培养液1.5ml，冰浴15分钟，4℃，8,000R/M离心1分钟，弃尽上清液。
用预冷的0.1mol/L氯化钙溶液悬浮菌体，于冰水中放置15分钟。
4．8,000 R/M离心1分钟，弃尽上清液，用预冷的100µl 0.1mol/L氯化钙悬浮菌体。
5．冰水中或4℃放置12-24小时，用于转化。
实验四PCR产物和载体的酶切，纯化和连接4.1 实验材料：核酸内切酶Eco R I、Hin d III，试剂盒高效连接液（mighty），均为TaKaRa 公司产品，由上海浩嘉生物技术公司赞助。
小量DNA胶回收试剂盒为上海华舜公司产品。
连接试剂盒为TaKaRa公司产品。
4.2 实验步骤A．PCR产物酶切取0.5mL离心管一支按顺序加入超纯水7µL经PCR纯化柱纯化的PCR产物：10µL缓冲液M：2.0µL核酸内切酶Eco R I、Hin d III（混合物）1L混匀，8,000 r/m离心30 s37℃酶切3 hＢ．载体酶切取0.5mL离心管一支按顺序加入超纯水14µL载体：3µLBuffer M：2µL核酸内切酶Eco R I、Hin d III（混合物）：1 µL混匀，8,000 r/m离心30 s37℃酶切3 hC．用硅胶柱纯化酶切载体及PCR产物同实验2D．PCR产物与载体的连接取经酶切纯化的PCR产物4µL，载体1 L混合加入连接试剂盒高效连接液5µL，混合。
16℃反应过夜实验五连接产物的转化与转化子鉴定5.1 实验材料：感受态大肠杆菌5.2 实验步骤1．取感受态细胞1支（大肠杆菌JM109），加入连接产物1µL。
2．于冰水中放置20-30分钟，42℃水浴准确计时90秒，冰浴5分钟。
3．各管加入LB培养基II 0.5ml，37℃水浴45-60分钟，涂布氨苄青霉素平板（固体LB培养基II中加入氨苄青霉素至100µg/ml），37℃培养16小时。
实验六连接转化子的鉴定6.1 实验材料6.2 转化子的鉴定1．挑取连接物转化子2个，在固体LB培养基II上划线分离，37℃培养过夜，各区一个菌落，分别接入10mL 液体LB培养基II（氨苄青霉素100g/mL）中，37℃振荡培养过夜。
2．取菌液于1.5 ml离心管，8,000 r/m，1分钟离心收集菌体。
3. 提取质粒（同实验1）4．取10 L 质粒加入2L buffer M，1L Eco R I、Hin d III酶混合液，混匀37℃反应30 min。
12．酶切产物电泳，凡能产生一条两个片段，分别为2.4kb和1.4kb为所需重组质粒（pLac18-amy），划线分离并保藏转化子。
实验七重组大肠杆菌转化子酶活鉴定7．1 实验材料：2％淀粉溶液碘液：2g KI ，1g I2，加水致100mL100 mg/mL IPTG为Pharmacia公司产品7．2 实验步骤1．挑取E.coli JM109（pLac18-amy ）单菌落于10 ml 液体LB 培养基II （氨苄青霉素100g/mL ）中，37℃振荡培养过夜。
2. 取100 mL 菌液于10 ml 液体LB 培养基II （氨苄青霉素100g/mL ）中，培养至对数后期，离心收集细胞。
分别以2 mL 下列液体培养基悬浮细胞： A ：液体LB 培养基 B ：液体LB 培养基II 振荡培养4h 。
2．培养液用超声波破碎（一秒隔一秒，30分钟）。
3．细胞破碎液分别与1%的淀粉溶液混合，于65℃保温1h ，加入碘液检测淀粉酶活力。
