利用酵母细胞生物催化合成2_苯乙醇_梅建凤

酿酒酵母CWY132以糖蜜为碳源生产2-苯乙醇的培养条件崔志峰;沈情佳;汪琨;朱廷恒【摘要】对酿酒酵母CWYl32利用糖蜜为碳源,生物转化L-苯丙氨酸(L-Phe)生成2-苯乙醇的液-液两相分批补料培养工艺进行了研究.发现在以聚丙二醇(PPG1500)作为抽提剂的液-液两相培养中,采用分批补料方式添加糖蜜和L-Phe使2-苯乙醇产量明显提高.在0、4、8、12、24 h分别添加40 g/L糖蜜,4、8 h分别添加12g/L、3g/L L-Phe的液-液两相分批补料培养中,2-苯乙醇产量最高达到9.03 g/L,其中抽提相中2-苯乙醇浓度22.5 g/L,比优化前的液-液两相单批培养中的产量4.82 g/L提高了87%.底物L-Phe的摩尔转化率达到0.82 mol/mol.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)011【总页数】4页(P10-13)【关键词】酿酒酵母;2-苯乙醇;糖蜜;分批补料【作者】崔志峰;沈情佳;汪琨;朱廷恒【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江,杭州,310032【正文语种】中文2-苯乙醇(2-phenylethanol，PEA) 是一种具有柔和细腻玫瑰气味的芳香醇，大量应用于玫瑰型及其他类型的香精配方中，在食品和日化用品等领域中也有广泛应用。

天然2-苯乙醇一般从玫瑰等植物精油中提取，但由于原料来源和提取成本等原因而难以满足市场需求。

生物技术的发展为天然2-苯乙醇的生产提供了新的途径，用酵母生物转化生产天然2-苯乙醇周期短、原料便宜，具有大规模生产的潜在能力。

Etschmann等首次报道了酵母用糖蜜作为碳源产2-苯乙醇，并利用油醇(oleyl alcohol)/水两相体系使2-苯乙醇产量大幅提高［1－2］。

专利名称：一种酿酒酵母中2-苯乙醇的制备方法专利类型：发明专利
发明人：王肇悦,姜明月,杜正达,郭雪娜,何秀萍申请号：CN201910303156.X
申请日：20190416
公开号：CN111826404A
公开日：
20201027
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种酿酒酵母中2‑苯乙醇的制备方法。

本发明保护一种提高酿酒酵母生产
2‑苯乙醇的产量的方法，包括如下步骤：提高酿酒酵母中转录因子Cat8p的表达量和/或活性，从而提高酿酒酵母生产2‑苯乙醇的产量。

本发明还保护将转录因子Cat8p的编码基因导入酿酒酵母后得到的重组菌株。

本发明提供的产2‑苯乙醇的酿酒酵母菌株与宿主菌相比，艾氏途径关键调控因子及关键酶基因表达水平增强，细胞的2‑苯乙醇合成能力显著提高，且该酵母菌株发酵条件简单，发酵周期短，有利于该菌株工业化生产2‑苯乙醇。

申请人：中国科学院微生物研究所
地址：100101 北京市朝阳区北辰西路1号院3号
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：秦梦楠
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应用与环境生物学报　2006,12(1):140～144 Chi n J A pp lEnvi ron B i o l=I SSN1006-687X　2006-02-25酵母生物转化生产2-苯乙醇的研究进展杨霄 崔志峰*(浙江工业大学生物与环境工程学院　杭州　310014)摘　要　主要论述了利用酵母菌生物转化合成天然2-苯乙醇的研究进展,从应用微生物学的角度介绍了2-苯乙醇生产菌株的筛选,分析了2-苯乙醇合成过程中几方面因素的影响和培养条件的选择,并对产物原位转移技术作了简要说明.并从分子生物学的角度出发,对生物转化的重点途径———艾利希途径在基因水平上作了诠释,且例举了利用从头合成途径进行的基因工程育种,旨在为利用微生物生产2-苯乙醇的研究开发提供参考.图1参40关键词　2-苯乙醇;酵母菌;艾利希途径;产物原位转移CLC　TQ923Progress i n2-phenylethanol Producti on by B iotransfor mati on w ith YeastYANG X iao＆CU I Zhifeng*(Co ll ege o fB iol ogica land E nvir onm en t a lEng i neering,Zhej iang Un i versit y o f Technol ogy,H angz hou　310014,Ch i n a) Abstract　Since2-pheny l e t hano l is an i m po rt ant flavo r and frag rance co m pound w it h a rose li ke s m e ll,it is w ide l y used i n m any industries,such as frag rance industry and food i ndustry.I t occurs na t urall y in e ssentia l o ils of many fl ow ers and plan ts, espec iall y i n rose o i.l2-pheny le t hano l can a lso be s yn t hesized by chem ica lm ethods,bu t the chem ica lm eans a re giv i ng w ay t ob i o s yn t hesis path w ay s due to increasing l y de m and for na t ural produc.t This rev i ew desc ri bes t he prog re ss i n its producti on of2-pheny le t hano lw it h yeast,inc l udi ng strain sc reen i ng,cult ure conditi ons and aff ec ting factors i nvo l ved i n its produc tion.In situ p roduct re m ova l is a lso m entioned because it is conside red nece ssa ry fo r high y i e ld o f2-pheny le t hano l in yeast by re m oving t he p roduct i nh i b ition.Be cause Ehrlich m etabo lis m is one of t he m ost i mportant pa t h w ay s f o r t he synthe sis o f2-pheny l e t hano l,g enes invo l ved in this path w ay and transcriptional regulati on a re also rev ie w ed.F i na ll y,de novo s yn t hesis o f2-pheny lethanoland yea st breeding by gene tic eng i neering a re s umm arized.F i g1,Re f40K eyword s　2-pheny lethano l;yeast;Ehrlich path w ay;in sit u p roduct re m ova lCLC　TQ923 2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇,由于它对碱和空气中的氧作用都很稳定,所以大量应用于日用化学和食品工业中玫瑰香型和其他类型的香精配方,尤其在化妆品中用量最大.由它作为原料合成的许多衍生物也具有不容忽视的应用价值,比如它的酯类衍生物乙酸苯乙酯就是一种重要的芳香物质.目前,绝大部分2-苯乙醇是用苯或苯乙烯通过化学途径合成的,这些原料都是致癌物质,对人体健康和环境都有巨大危害.此外,化学合成的2-苯乙醇中常含有一些难以除去的副产物[1],严重影响了产品质量,其弊端显而易见.值得重视的是从上世纪末以来,消费者对“天然”产品的要求在不断提升.就2-苯乙醇而言,在美国市场上,化学合成的市场售价为3.50＄/kg,而天然的2-苯乙醇售价则高达1000＄/kg[2].所谓“天然”,即此物质必须来源于自然,通过物理、酶或微生物途径产生[3].天然2-苯乙醇存在于很多花和植物的精炼油中,例如风信子、茉莉花、水仙、百合等,但多数情况下浓度太低,无法提取.唯一例外的是玫瑰精油,从某些种类的玫瑰精油中可以得到60%以上的2-苯乙醇.更高浓度的2-苯乙醇只能通过溶剂萃取的方法得到[1].但是,从玫瑰中提取天然2-苯乙醇生产周期长,花费昂贵,无法进行大规模的工业生产来满足市场的需收稿日期:2004-10-29 接受日期:2004-12-17*通讯作者　C orres pond i ng au t hor(E-m ail:zfcu i2001@yahoo.co )要.利用微生物作为生产菌株进行合成可以克服上述缺点,许多利用微生物发酵生产的食用品中都含有2-苯乙醇,如可可、咖啡、面包、啤酒、奶酪[4]等.特别是Eh rlich(艾利希)发现,在酵母培养物中添加L-苯丙氨酸(L-Phe)可以使2-苯乙醇的产量得到大幅提高[5],故可以利用酵母菌生物转化生产.必须说明的是,欧洲的相关法令规定,如果通过微生物代谢途径得到的产物需要定义为天然产物,那么参与代谢的前体物质必须是天然物质,如天然氨基酸.目前我国已有较多关于L-P he生物合成的研究报告,但对于2-苯乙醇生物合成的研究尚处于起步阶段,有关的文献报道也甚少[6].国外对于2-苯乙醇生物合成的研究已达到较高水平.本文对2-苯乙醇生产菌株的筛选、培养条件的影响、生化合成途径以及相关基因的研究进展等作一综述,旨在为利用微生物生产2-苯乙醇的研究开发提供参考.1　生物转化机理与菌种筛选大多数微生物,特别是酵母菌,都能通过正常的代谢途径产生2-苯乙醇,但产量一般都很低,若向培养基中加入前体物质L-P he,2-苯乙醇的产量能得到大幅提高.这条途径早在1907年就被艾利希发现并加以阐述,之后由他的名字命名[5].L-Phe 通过转氨酶作用形成苯丙酮酸,苯丙酮酸在苯丙酮酸脱羧酶作用下脱羧形成苯乙醛,苯乙醛再通过醇脱氢酶催化生成2-苯乙醇.艾利希在描述这条途径时同时指出,加入的L-P he的量与最终得到的2-苯乙醇的产量之间存在紧密联系.这条途径是目前利用微生物转化生产2-苯乙醇的主要途径.2-苯乙醇还可以通过莽草酸途径从头合成.葡萄糖通过糖酵解途径(E M P)产生磷酸烯醇式丙酮酸,通过磷酸戊糖途径(HM P)产生4-磷酸赤藓糖,两者在2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAH P合酶)作用下通过中间体DAHP形成莽草酸.莽草酸再经中间体分支酸和预苯酸在分支酸变位酶和预苯酸脱水酶的作用下形成苯丙酮酸,苯丙酮酸一方面可通过苯乙醛生成2-苯乙醇,另一方面,也可通过与L-谷氨酸的转氨作用形成L-Phe[2,7].代谢途径中DAHP合酶及预苯酸脱水酶受到L-Phe的反馈抑制[8].这条途径在微生物体内广泛存在,但由于代谢途径太长,支路太多,存在多种抑制作用,故最终得到的2-苯乙醇产量很低,但是通过基因工程或传统诱变的手段定向增强关键酶的活性可使产量得到提高.生物体内通过何种途径合成2-苯乙醇取决于培养基中的氮源状况.谷氨酸、铵盐等一般作为优质的、较易利用的氮源使用,而氨基酸、尿素等只作为贫瘠的次级氮源使用.只有当L-Phe作为唯一氮源时艾利希途径才占主导地位.如果有更易利用的氮源存在,L-Phe则将通过其它途径代谢.酵母中L-Phe的代谢有很多种可能性,对相当一部分酵母而言,L-Phe可通过肉桂酸途径代谢[9].在酿酒酵母中这条途径尚未得到证实,除艾利希途径之外的L-Phe的其它代谢途径还有待考证.哺乳动物中的代谢途径与酵母中的又有不同[9](图1).图1　L-苯丙氨酸代谢途径[2]F i g.1　L-phenylal anine(L-Phe)m et abolis m[2] 2-苯乙醇的产生具有菌株特异性,不同的产生菌产2-苯乙醇的能力也不相同,因此,在对生物转化途径进行细致的研究之前,稳定高产菌的筛选必须事先完成.F abre等通过一个半合成培养基(葡萄糖80g/L,DL-Phe2g/L,(NH4)2SO42g/L,KH2PO45g/L,M gSO47H2O0.4g/L,酵母提取物1g/L,p H3.8)对21种酵母菌进行筛选,采用高效液相色谱(HPLC)法进行检测:RP-C18柱(220mm×4.6mm),流动相乙腈∶水=40∶60(V/V),检测波长216n m,苯丙氨酸在4m i n出峰, 2-苯乙醇在8m in出峰.选出一株K luyvero m yces marxianus为高产菌,在30℃、125r/m in条件下培养192h后2-苯乙醇产量达1.85g/L[10].Etsch m ann等以工业废料糖蜜作为碳源,利用糖蜜培养基(甜菜糖蜜形式的蔗糖60g/L,L-Phe7g/L,N a2HPO42H2O22.8g/L,柠檬酸10.3g/L,M gSO47H2O0.5g/L,无氨基酸无硫酸铵的酵母氮碱0.17g/L,p H5)从14株酵母菌菌株筛选出K.marxianus CBS600和CBS397两株高产菌,培养过程中通过产物原位转移技术用油醇作为提取剂消除终产物2-苯乙醇对细胞生长的毒性,可使两株菌的2-苯乙醇产量提高到3g/L.2-苯乙醇在水相中的含量用HPLC法测定:RP-C18柱(250mm×4.6mm,10μm,A llt ech),流动相甲醇∶水=60∶40(V/V),流速2mL/m i n;检测波长216nm.2-苯乙醇的总浓度通过它在油醇和水相中的分配系数K计算出,通过实验测定K值为13.5∶1[11].需要指出的是,此结果与其它在合成培养基中研究所得的结果彼此间缺乏可比性,由于培养条件有差异,此处的两株高产菌也许在合成培养基中并不高产.但此实验中用糖蜜作为碳源,具有巨大的经济和环境上的优势,这种培养方式值得进行更深一步的研究.141　1期杨霄等:酵母生物转化生产2-苯乙醇的研究进展 2　酵母菌对2-苯乙醇的耐受性和产物原位转移技术2-苯乙醇作为杀菌剂已在医药行业中应用多年了.浓度介于2～3g/L的2-苯乙醇能完全抑制多种细菌和真菌的生长.关于抑制作用的具体机理存在多种看法,但普遍认为,细胞膜是一个重要的作用位点,因为芳香醇能增加细胞膜的流动性,影响细胞质膜上糖和氨基酸的转运体系,加速粒子和小分子代谢产物的过膜积极扩散,导致跨膜质子动势被扰乱[12,13],从而引起胞内离子的渗漏和氨基酸、葡萄糖摄入量的降低.2-苯乙醇也被认为是细菌细胞内大分子物质合成的抑制剂[14],它通过特殊的作用机制抑制了大肠杆菌中蛋白质和RNA的合成[15].W ilkie和M a roudas研究发现,2-苯乙醇抑制酿酒酵母的生长是通过诱导出一种呼吸缺陷型菌株,这种缺陷型菌株一方面是由于诱导发生小菌落突变,细胞合成了无功能的线粒体,另一方面是通过线粒体通透性的增加,直接抑制了呼吸,导致胞内P/O比降低,代谢解偶联[16].试验表明,当2-苯乙醇的浓度低于0.6g/L时,它对酿酒酵母的生长不产生抑制作用,当浓度达到4g/L时,酿酒酵母停止生长.由于2-苯乙醇能自由扩散出入质膜,故酵母细胞内代谢产生的2-苯乙醇对细胞同样有毒害作用,这使得胞内合成的2-苯乙醇达到一定浓度时,细胞受其毒性影响,生长延缓,代谢受阻,无法得到更高的浓度.产物原位转移技术是指在液体培养基中加入另一有机溶剂相例如油酸,共同培养(有机溶剂需对细胞的生长不产生抑制作用).水相中合成的2-苯乙醇将通过液液抽提进入有机相之中,从而保证水相中的2-苯乙醇浓度始终处在对酵母细胞的抑制浓度之下,避免酵母细胞受到高浓度2-苯乙醇的毒害,使细胞正常生长代谢,不断合成2-苯乙醇[17].Sta rk等利用酿酒酵母在含有6g/L L-Phe和其他氮源条件下培养所得的2-苯乙醇浓度为2.35g/L,同一菌株用油酸进行产物原位转移,通过补料分批培养所得的2-苯乙醇浓度达到了12.6g/L[18].3　影响酵母菌合成2-苯乙醇的其它因素和培养方式的选择2-苯乙醇的产率还与酵母细胞的生长速率、培养基中L-Phe的浓度和溶氧等因素密切相关.在高氧浓度下,酵母细胞保持高生长速率,代谢旺盛,培养基中如果存在高浓度的L-Phe,就可以形成一种浓度势能,推动其中一部分L-Phe通过艾利希途径高效率转化成为2-苯乙醇,S tark等在L-Phe18.3g/L 高浓度条件下有氧转化,通过测定消耗的L-P he量和得到的2-苯乙醇量比较得出,2-苯乙醇相对于消耗的L-Phe的摩尔产率达到0.93mo l/mo l[19].但由于培养基中仍残留高浓度的L-Phe,因此不宜采取通气连续培养的方式浪费大量的L-Phe.若培养基中L-Phe的浓度较低(小于1.5g/L),即使在有氧环境下,转化率也很低,只能得到微量的2-苯乙醇,当环境氧容量逐渐降低时,转化率逐渐回升,直至无氧条件下,摩尔产率又高达0.93m ol/m o l[19].但当环境氧容量降低时,培养基中乙醇的含量会上升,乙醇是细胞生长的又一抑制剂,虽然其毒性比2-苯乙醇低约20倍,但当乙醇和2-苯乙醇同时存在时,所产生的毒性比两者单独存在时所具有的毒性之和大得多[20],这样将会导致细胞生长缓慢甚至死亡.大部分酵母还具有限制自身呼吸容量的C rabtree效应(酵解抑制有氧氧化),因此即使发酵过程在氧充足的条件下进行,还是会产生乙醇.采用补料分批培养体系,既可将乙醇的产生量控制在毒性范围以下,又可避免L-Phe不必要的浪费.结合使用产物原位转移技术,能使酵母细胞合成2-苯乙醇的能力达到最大,获得高浓度的2-苯乙醇.为了减少培养基中乙醇的生成,还可以选用C rabtree效应阴性菌株例如K.marx i anus、Hansenu l a ano m ala等合成2-苯乙醇[19],这些菌株极有可能在高生长速率下或高氧浓度环境下进行分批培养而不产生乙醇.或是可以用甘油代替葡萄糖作为碳源和能源以避免糖酵解产生乙醇[19].4　生化合成途径的研究与基因工程育种作为利用微生物合成2-苯乙醇的首选途径,艾利希途径在近几年里已在基因水平上得到了广泛而深入的研究,研究的重点在于编码艾利希途径3个步骤中3种酶活性的结构基因及其转录和调控.第一步反应的转氨酶被认为是与菌体的生理生长密切相关[21],它通过与α-酮戊二酸之间的转氨作用与TCA循环紧密联系.而目前吸引绝大多数研究者注意的是第二步反应中苯丙酮酸脱羧酶的基因本质,它是艾利希途径中的关键酶.第三步反应一直被认为是醇脱氢酶催化的步骤,但直到最近,编码这种脱氢酶的结构基因才得到严格的证明.4.1　转氨酶及其基因本质目前已知有两种转氨酶参与了艾利希途径的第一步反应:芳香族氨基转氨酶Ⅰ和芳香族氨基转氨酶Ⅱ,分别由基因ARO8和ARO9编码.芳香族氨基转氨酶Ⅰ能够催化与苯丙氨酸相关的绝大部分转氨反应,它在细胞内普遍存在,是主要的芳香族转氨酶[22].芳香族氨基转氨酶Ⅱ在正常的生长过程中不存在,当细胞缺失aro8基因的情况下,它通过苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸诱导产生,参与转氨反应.诱导作用主要涉及两个因素:基因ARO9的一组上游激活序列和A ro80p蛋白.A RO80基因编码一条950个残基组成的多肽链,通过序列分析表明,此蛋白属于与G a l4p、P rp1p高度相似的Zn2Cys6家族[23],它的N末端是与DNA结合的区域,C末端富含天冬氨酸,大量负电荷构成多个绕线式α-螺旋,此区域介导蛋白质间的相互作用,并赋予此蛋白激活转录的能力.芳香族诱导物通过定位在质膜上的通透酶G ap1p和W ap1p[24]进入细胞,通过与A ro80p的C末端相结合将诱导信号传递至A ro80p.接受了诱导信号的A ro80p通过与A RO9基因上游36 bp序列的结合,激活ARO9表达成为芳香族氨基转氨酶Ⅱ.Ira-qu i等通过试验还证明,A RO9基因上游的36bp序列,含有4个重复的CCG组合,互相间隔7bp,除去此36bp序列后,诱导作用完全消失[25].说明此36bp序列对A RO9诱导表达是必需的,称为上游激活序列.4.2　苯丙酮酸脱羧酶的基因本质酿酒酵母基因组中含有5个可能编码苯丙酮酸脱羧酶活性的基因,包括3个丙酮酸脱羧酶基因PDC1、PDC5、PDC6,以及另外两个认为同样是编码以焦磷酸硫胺素为辅酶的脱羧酶142 应用与环境生物学报 Chi n J App lEnvi ron B i o l 12卷活性的可读框ARO10/YDR380w、TH I3/YDL080c[26].V ura l han 等对苯丙酮酸脱羧酶基因进行了比较详细的研究,他们比较了以L-Phe为氮源和以铵盐为氮源条件下酵母细胞内各基因的转录水平,发现在以L-Phe为氮源条件下,AR O10转录水平比其余4个基因的转录水平高出30倍,而其余4个基因的转录水平之间相差不大.作者进一步通过构建aro10缺陷型菌株,再进行同样的摇瓶培养试验,发现其余4个基因在此条件下并不表现出编码苯丙酮酸脱羧酶活性的能力,证明苯丙酮酸脱羧酶活性主要是由A RO10基因决定的[27].然而,将此缺陷型菌株在限量葡萄糖的恒化器中有氧培养时,表现出另一种苯丙酮酸脱羧酶活性,分析表明,此活性由TH I3和3个PDC基因中任意一个共同编码,且当3个PDC基因同时存在时,PDC5的转录水平最高[27].比较两种苯丙酮酸脱羧酶活性的Km和Vm ax,发现由ARO10编码的酶活符合标准米氏方程曲线,另一酶活表现为一条S形曲线,其Km值比A RO10编码的酶活高出5～8倍[27],故在反应时苯丙酮酸将优先被A RO10编码的酶催化.Iraqu i等研究发现,ARO10基因的上游调节序列与A RO9基因非常相似,也具有36bp的上游激活序列,受A ro80p诱导调控[25].两者的诱导表达还受制于一种铵盐效应,当向生长在次级氮源条件下的细胞加入铵盐时,诱导作用受阻.分析表明,加入的铵盐离子会激发定位于质膜上的通透酶G ap1p和W ap1p快速失活并降解[28],这个过程要求具备N pi1p泛素连接酶以及通透酶C末端的完整性[28,29],通透酶在N pi1p泛素连接酶作用下发生遍在蛋白化作用进而内吞并降解[30].通透酶的失活使芳香族诱导物被隔离在细胞外,无法进入细胞发生诱导作用,从而阻止AR O9、ARO10表达.4.3　醇脱氢酶的基因本质酵母中共含有20个可能具备编码醇脱氢酶活性的基因,包括7个推定的芳香醇脱氢酶基因(A A D基因)[31,32]以及其余13种醇脱氢酶基因:A DH1、A DH2、A DH3、A DH4、A DH5、SFA1、BDH1/Y AL060w、BDH2/Y AL061w、SOR1/Y JR159w、S OR2/ YDL246c、XDH1/Y LR070c、肉桂醇脱氢酶基因C DH1/Y CR105w 以及最近才提出的A DH6/Y MR318c.其中BDH1最近被证明在2,3-丁二醇的合成中起作用[33],BDH2和BDH1具有很大的相似性,而SOR1、SOR2、XDH1编码糖醇脱氢酶活性[34,35], CDH1和A DH6则编码以NADPH为辅酶的酶活[36].因此,可以认为,上述这些基因与2-苯乙醇的合成无关.D ick i nson等对剩余13种基因进行了比较深入的研究,他们采用突变和基因敲除的方法构建出缺失其中一种或多种基因的缺陷型菌株,并对包括2-苯乙醇、异戊醇在内的长链复合醇终产物进行了测试.结果表明:AA D基因在合成过程中不起作用,其功能有待于进一步考证.剩余的6个基因A DH1、A DH2、A DH3、A DH4、A DH5和SFA1,无论是用传统的杂交方法或是从缺陷其中5个基因的缺陷型菌株转化,都无法获得同时缺失这6个基因的单倍体突变株.而其余各种组合方式显示都具有长链复合醇脱氢酶活性[37].因此,只要酵母菌含有A dh1p～A dh5p和S fa1p中的任何一种酶,且此酶能正常工作,就可由此得到长链复合醇.4.4　基因工程育种在对酿酒酵母K-9进行的底物类似物敏感性试验中,Fukuda等对酵母的从头合成途径进行考察,发现1m g/m L对氟苯丙氨酸(PFP)、2m g/m L邻氟苯丙氨酸(O FP)和5mg/mL 间氟苯丙氨酸(M FP)能完全抑制它在YNB琼脂培养基(0.67%无氨基酸的酵母氮碱,2%葡萄糖,2%琼脂)中的生长,向其中加入1m g/m L L-Phe后,抑制解除,说明氟苯丙氨酸和苯丙氨酸在细胞内是一种竞争性抑制的关系.在此基础上,使用乙基甲磺酸作为诱变剂,诱变得到氟苯丙氨酸抗性菌株,这些菌株经过YN B液体培养基培养后对其2-苯乙醇产量进行测定,结果表明,PFP抗性菌株的2-苯乙醇产量提高了近6倍, O FP抗性菌株的2-苯乙醇产量提高了3倍左右,M FP抗性菌株的2-苯乙醇产量无太大变化.通过对突变株稳定性的测试表明,无回复突变现象发生[38].A oki等用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍作为诱变剂处理Z ygos accharo myces roux ii,然后涂布于含2mm o l/L L-脯氨酸作为唯一氮源和100μg/mL对氟苯丙氨酸的培养基中,得到PFP 抗性菌株,此菌株产2-苯乙醇的能力得到大幅度提高.为了检测出突变位点,A oki等对从头合成途径中的4种酶:DAHP合酶、分支酸变位酶、预苯酸脱水酶和预苯酸脱氢酶的酶活进行测定,结果表明,预苯酸脱氢酶被破坏[39].预苯酸脱氢酶是预苯酸转化成为酪氨酸的途径所必须,此酶的破坏导致胞内酪氨酸合成途径终止,酪氨酸浓度降低,解除了它对DAH P合酶和分支酸变位酶的反馈抑制,使预苯酸的浓度增大,同时使大部分预苯酸能转化成为苯丙酮酸,加强了合成2-苯乙醇的途径.Fukuda等通过诱变得到邻氟苯丙氨酸抗性菌株,该菌株解除了酪氨酸对DAHP合酶的反馈抑制.从该菌株的基因组中取得编码DAHP合酶的基因A RO4,通过YCp载体转化进入另一酿酒酵母中,受体酵母也表现出DAHP合酶活性对反馈抑制的不敏感性,同时获得了邻氟苯丙氨酸抗性,提高了2-苯乙醇和酪氨酸的产量[40].5　结语与展望对天然产品需求的激增和由此所带来的可观经济收益使得利用微生物合成天然产品成为重要的研究课题之一.酵母生物转化合成2-苯乙醇具有生产成本低、周期短、污染少、对环境温和等优点,最终必将成为2-苯乙醇生产的主流.特别是我国L-Phe产业已进入年产千吨级水平,使得酵母生物转化合成2-苯乙醇更具有开发价值.国外在对酵母中L-Phe代谢途径的研究,或是对艾利希途径相关基因本质的追寻,以及对2-苯乙醇生物合成产量的研究方面都有很多报道.但目前国内关于这方面的研究还较少,可以预见,该方面的开发研究在我国将会有广阔的前景.R eferences1　C lark GS.Phenethy l alcoho.l P erf um F l avor,1990,15:37～442　E tsc hm ann MMW,B l ue m ke W,S ell D,Sch rader J.B i otec hnological producti on of2-ph eny l et hano.l ApplM icr obi o lB i o t echno l,2002,59:1～83　US Food and D rug Ad m i nistrati on.Code of federal regu l ations of 21CFR101.22,20014　Jolli vetN,Bezenger M C,Vayssier Y,Belin J M.P rodu ction of vol atile co m pounds i n liqu i d cu lt ures by si x s trains of corynef or m bacteria.Appl M i cr obi ol B i otec hnol,1992,36:790～7945　Eh rlich F.Über die Bed i ngungen der Fuselölbil dung undüber i h ren143　1期杨霄等:酵母生物转化生产2-苯乙醇的研究进展 Zusa mm enhang m it de m E i w eiβaufbau 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两相体系中菌体转化法制备2-苯乙醇的研究刘国;陆军;张伟国【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2009(19)3【摘要】目的:利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICIMY0086)菌体在油酸-水两相体系中转化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇,以期解除产物抑制的同时降低萃取相油酸对转化的不利影响,提高2-苯乙醇产量。

方法:对2-苯乙醇的生成与菌体生长的关系进行考察,以确定菌体转化法的可行性;通过单因素试验和正交设计试验获得转化培养基最佳配方;对菌体转化条件进行优化。

结果:向装液量为25mL/250mL转化培养基中加入0.6g酵母湿菌体,30℃、100r/min条件下转化,9h加入等体积油酸,催化27h,产物浓度达4.55g/L。

结论:2-苯乙醇的制备可以使用菌体转化法,该法可在一定程度上克服两相转化体系中油酸的毒性影响。

【总页数】4页(P67-70)【关键词】酿酒酵母;2-苯乙醇;L-苯丙氨酸;两相体系;菌体转化【作者】刘国;陆军;张伟国【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室;江南大学生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】TQ65【相关文献】1.两相体系生物转化L-苯丙氨酸生成2-苯乙醇 [J], 陆军;张伟国2.水/有机溶剂两相体系中生物转化合成2-苯乙醇 [J], 梅建凤;陈虹;王鸿;应国清;易喻3.酵母细胞转化液中乙醇、2-苯乙醇的气相色谱法分析 [J], 刘兰;黄筱萍;金丹凤;熊大维;黄国昌4.水/有机相两相体系中Saccharomyces cerevisiae B5不对称还原制备手性药物中间体R-2′-氯-1-苯乙醇的研究 [J], 欧志敏;吴坚平;杨立荣;岑沛霖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生物转化法生产2-苯乙醇动力学研究
梅建凤;王鸿;易喻;陈建澍;应国清
【期刊名称】《化学工程》
【年(卷),期】2010(38)5
【摘要】考察了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在5 L发酵罐中转化生成2-苯乙醇过程中的菌体生长、产物生成和基质消耗的变化规律,并基于得到的实验数据,建立了转化过程中菌体生长的Logistic模型、2-苯乙醇生成的Luedeking-Piret模型和蔗糖消耗的Luedeking-Piret相似模型.将3个动力学模型的理论值和实验值进行了比较,表明模型具有较高的拟合精度,能准确反映2-苯乙醇生物转化过程及其动力学特征,可用于酿酒酵母转化生产2-苯乙醇过程的预测.
【总页数】4页(P72-75)
【作者】梅建凤;王鸿;易喻;陈建澍;应国清
【作者单位】浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032;浙江工业大学,药学院,浙江,杭州,310032
【正文语种】中文
【中图分类】TQ920.6
【相关文献】
1.生物转化法合成2-苯乙醇菌种的诱变选育 [J], 梅建凤;闵航
2.溶剂萃取法分离生物转化法合成的2-苯乙醇 [J], 梅建凤;易喻;范师;王鸿;应国清
3.微生物转化法生产β-苯乙醇的研究进展 [J], 荣绍丰;付艳丽
4.生物转化法生产β-苯乙醇的中试研究 [J], 卢少明;马集锋;卢健
5.生物转化法合成2-苯乙醇的研究进展 [J], 丁东栋;崔志峰;徐翔;汪琨;朱廷恒因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Bioprocess 生物过程, 2012, 2, 89-97doi:10.4236/bp.2012.22015 Published Online June 2012 (/journal/bp)The Study of Biotechnological Production of 2-Phenylethanol*Mingle Cao2, Xinglin Jiang1, Haibo Zhang1, Mo Xian1, Feng Huang21Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao2State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Ji’nanEmail: zhanghb@Received: Feb. 21st, 2012; revised: Mar. 14th, 2012; accepted: Mar. 24th, 2012Abstract: 2-Phenylethanol (β-Phenylethanol) is aromatic flavour and fragrance compound with an elegant, fine, endure, rose-like odour. It can be used as additives in perfume, cosmetic, food industries. It also can be used as pharmaceutical intermediates and fine chemicals. So far, 2-PE is mainly produced chemically. The biosynthesis of 2-PE is receiving more attentions, because of its low energy consumption, environmentally friendly, and the demand for the “natural” 2-PE. This review introduces the production of 2-PE especially the biosynthesis method, metabolic pathway, and fer-mentation method.Keywords: 2-Phenylethanol; Spices; Bio-Catalytic; Ehrlich Pathway; ISPR生物催化法生产2-苯乙醇的研究现状*曹明乐2，姜兴林1，张海波1，咸漠1，黄峰21中国科学院青岛生物能源与过程研究所，青岛2山东大学，微生物技术国家重点实验室，济南Email: zhanghb@收稿日期：2012年2月21日；修回日期：2012年3月14日；录用日期：2012年3月24日摘要：2-苯乙醇(2-Phenylethanol)也叫β-苯乙醇，英文简称2-PE，具有淡雅、细腻、持久、玫瑰香味的芳香族香气物质。

科研成果——酵母生物转化生产天然2-苯乙醇一、 2-苯乙醇的用途β-苯乙醇，又名2-苯乙醇(2-phenylethanol，β-phenylethanol，PEA)，分子式为C8H10，其分子结构如下图。

2-苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰香味的芳香醇，存在于很多花和植物的精油中，如玫瑰、风信子、茉莉、水仙、百合等，其它含有天然2-苯乙醇的产品是那些生产中涉及发酵的食品，如茶叶、可乐、咖啡、面包、白酒、苹果酒、奶酪以及酱油等。

由于玫瑰芳香气味颇受人们欢迎，2-苯乙醇在食品、药品、化妆品、烟草和日化用品中得到广泛的应用。

它不仅是玫瑰香型香气的基本组分，有协合及增效作用，而且是丁香、橙花、依兰、风信子、铃兰等多种香型配方的基底成分。

2-苯乙醇可用于配制玫瑰、覆盆子、草莓、焦糖、甜瓜、蜂蜜和其他果香型香精；也可用于配制白兰地、威士忌和各种曲酒、白酒等酒用香精；还可用于烟用香精，这些产品中2-苯乙醇含量为0.1~20 mg/kg。

苯乙醇有一个令调香师喜爱的特性：对各种香料有良好的互溶性。

当调香师发现调好的香精出现浑浊、分层或沉淀时，加入适量的苯乙醇就可以使其变得澄清透明。

另外，苯乙醇在常温时香气淡弱，随着温度升高香气渐浓，这个特性可用于熏香香精的配制。

其次，以苯乙醇为原料合成的衍生物也有着不容忽视的应用价值，例如2-苯乙醇的酯类衍生物——乙酸苯乙酯，是一种芳香物质，主要用作日化香精和食用香精。

二、天然2-苯乙醇2-苯乙醇少部分是从天然的玫瑰花中提取的，绝大部分是采用廉价的化工原料苯或苯乙烯通过化学途径合成的，即苯-环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢法。

在国际市场上，苯-环氧乙烷合成的产品占40%，氧化苯乙烯加氢法合成的产品占60%。

然而化学合成的2-苯乙醇中含有一些难以除去的副产物，例如具有不良气味的联二苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，严重影响了2-苯乙醇的产品质量，难以达到食用和日用香料的质量标准，对人体健康和环境有着巨大危害。

专利名称：利用混菌发酵生产2-苯乙醇的方法
专利类型：发明专利
发明人：信丰学,姜岷,严伟,章文明,蒋羽佳,周杰,董维亮申请号：CN202011268975.4
申请日：20201113
公开号：CN112538504A
公开日：
20210323
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了利用混菌发酵生产2‑苯乙醇的方法，将活化大肠杆菌接种至含葡萄糖发酵培养基中发酵后，将活化的季也蒙毕赤酵母接种至大肠杆菌发酵体系，发酵生产2‑苯乙醇；所述大肠杆菌为引入苯丙氨酸合成中关键抗反馈抑制基因的重组菌。

该方法是目前首次使用多细胞共培养的方式合成2‑苯乙醇，降低了工业生产2‑苯乙醇的底物成本，具有重要的应用价值。

申请人：南京工业大学
地址：211816 江苏省南京市浦口区浦珠南路30号
国籍：CN
代理机构：江苏致邦律师事务所
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