高效液相色谱法同时测定血清中的犬尿氨酸和色氨酸

化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE第29卷，第4期2020年7月V ol. 29，No. 4Jul. 202067doi ：10.3969／j.issn.1008–6145.2020.04.015液相色谱–质谱联用法同时测定大鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸周资凯1，2，郑柳2，鲍益帆2，杨丽2，章志远2（1.南昌大学环境资源与化工学院，南昌　330031；　2.台州市台环环境检测科技有限公司，浙江台州　318020）摘要　建立液相色谱–质谱联用法同时测定大鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸的方法。

先利用活性碳吸附去除复杂基质，再以高氯酸、甲酸酸化沉淀，简单快速去除大量蛋白，然后以液相色谱–质谱联用法进行测定。

总分析时间小于4.00 min ，色氨酸和犬尿氨酸的质量浓度在0.500~1.000×104 μg ／L 范围内与色谱峰面积线性关系良好，检出限分别为0.147，0.148 μg ／L ，测定结果的相对标准偏差不大于4.7%（n =5），方样品加标回收率为99.2%～102.0%。

样品经–80℃冻融循环和室温放置120 h 内稳定性良好。

该方法优化了净化提纯前处理方式，与已报道的方法相比更加灵敏，绿色环保，可保持样本稳定，为需分析高通量生物基质样本的药物动力学相关工作提供一参考。

关键词　色氨酸；犬尿氨酸；代谢途径；液相色谱–质谱联用法；活性碳中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1008–6145(2020)04–0067–05Determination of tryptophan and kynurenine in rat plasma by liquid chromatography-mass spectrometryZHOU Zikai 1，2，ZHENG Liu 2，BAO Yifan 2，YANG Li 2，ZHANG Zhiyuan 2(1. School of resources environmental & chemical engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China ；2. Taizhou TaiHuan Environmental detection technology Co., Ltd., Taizhou 318020, China ）Abstract A method for simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in rat plasma by liquid chromatography mass spectrometry was established. Firstly, the complex matrix was removed by activated carbon adsorption, then precipitated by perchloric acid and formic acid, then a large number of proteins were simply and rapidly removed, and then determined by liquid chromatography–mass spectrometry. The total analysis time was less than 4.00 min. The mass concentration of tryptophan and kynurenine was in the range of 0.500–1.000×104 μg ／L, which had a good linear relationship with the peak area, and the detection limits were 0.147, 0.148 μg ／L, respectively. The relative standard deviation was not more than 4.7% (n =5), the absolute recoveries were 99.2%–102.0%, The sample had good stability in –80℃ freeze–thaw cycle and room temperature for 120 h. Compared with the reported methods, this method is more sensitive, green and environmental friendly, and can keep the sample stable ，which provides a reference for the pharmacokinetics related to the analysis of a large number of biological matrix samples.Keywords tryptophan; kynurenine; metabolic pathway; liquid chromatography–mass spectrometry; activated charcoal通讯作者　周资凯，硕士，工程师，从事环境化学、分析化学、药物化学和纯化分离技术工作，E–mail:*****************收稿日期　2020–04–13引用格式　周资凯，郑柳，鲍益帆，等.液相色谱–质谱联用法同时测定大鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸［J ］.化学分析计量，2020，29(4): 67–71.ZHOU Z K ，ZHENG L ，BAO Y F, et al. Determination of tryptophan and kynurenine in rat plasma by liquid chromatography-mass spectrometry ［J ］. Chemical analysis and meterage ，2020，29(4): 67–71.人体中的色氨酸和犬尿氨酸代谢途径已被证实与许多疾病和失调有相关联性，如人类免疫缺陷病毒的感染、亨廷顿病、阿尔茨海默病和精神分裂症［1–2］。

高效液相色谱-串联质谱法同时测定人体尿液中的酪氨酸和色氨酸支小平;崔盼盼;柳英霞【摘要】建立了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS／MS）同时测定人体尿液中游离酪氨酸和色氨酸分析新方法。

采用乙腈－0．1％甲酸溶液（10：90，V：V）为流动相，流速为0．3 mL·min－1。

在全扫描模式下，将m／z为182．2、205．2的离子分别确定为酪氨酸和色氨酸的母离子，m／z136．1与188．0分别为定量子离子。

在质谱的多反应监测正离子模式下进行分析，酪氨酸和色氨酸的检测限分别为0．10和0．25 ng·mL－1。

在已优化的色谱和质谱条件下，待测样品经过简单的离心、过滤后即可直接进样检测。

在3个不同添加水平的回收实验中，酪氨酸和色氨酸的平均回收率为74．0％～124．0％，RSD值小于7．97％，表明该方法可满足实际样品检测要求。

该方法操作简单、快速、灵敏度高，可用于人体尿液中游离酪氨酸和色氨酸的同时测定。

%A new method for the simultaneous determination of free tyrosine and tryptophan in human urine samples by HPLC-MS/MS was developed.The chromatographic separation was achieved on an Agilent XDB-C18 column(4.6×50mm,1.8μm),the column temperature was 25 ℃,the mobile phase wasCH3CN-0.1%HCOOH(10:90,v/v),the flow rate was 0.3 mL·min-1 .In the full scan mode,the m/z 182.2 and m/z 205.2 were identified as the precursor ions of tyrosine and tryptophan,the m/z 136.1 and m/z 188 were quantitative product ion,respectively.The analysis was realized by multiple reaction-monitoring modes.Under optimal conditions,the linear ranges of tyrosine and tryptophan were 0.001-2.00μg · mL-1 ,and the limits ofdetection were 0.10 and 0.25 ng·mL-1 ,respectively.The average recoveries for tyrosine and tryptophan(spiked at three different levels)ranged from 74.0 to 124.0%,the RSD was below 7.97%.The method is simple,rapid and sensitive,and suitable for the simultaneous determination of free tyrosine and tryptophan in human urine.【期刊名称】《南昌大学学报（理科版）》【年(卷),期】2016(040)004【总页数】5页(P341-345)【关键词】高效液相色谱-串联质谱;人体尿液;酪氨酸;色氨酸【作者】支小平;崔盼盼;柳英霞【作者单位】南昌师范高等专科学校，江西南昌330103;南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047;南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047【正文语种】中文【中图分类】O657氨基酸不但是构建生物体的基本物质，而且在生物机体的生命活动中扮演着重要角色，它是生物化学、蛋白质组学、临床医学等领域的重要研究内容[1-2]。

专利名称：一种用高效液相色谱-荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法
专利类型：发明专利
发明人：唐爱国,项忠元,罗昔波,肖乐东,皮兰敢,周前选,任亚萍
申请号：CN201010300361.X
申请日：20100115
公开号：CN101776662A
公开日：
20100714
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种用高效液相色谱-荧光法同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸的方法。

步骤包括：a、采用Hypersil C18 250mm×4.6mm i.d，7μm色谱柱；b、每升流动相中含醋酸锌0.2mol、醋酸8.3mmol和2.5v/v％的乙腈；c、流速为1.5ml/min，进样量：20μl，柱温25℃；d、可调波长的设定为：0-11min激发光波长365nm，发射光波长为480nm；11-15.5min激发光波长344nm，发射光波长为404nm；15.5-20min激发光波长254nm，发射光波长为404nm条件下检测。

方法操作简单，分离快速，无需柱前柱后衍生，灵敏度高，结果真实准确，能同时测定色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸。

申请人：中南大学湘雅二医院
地址：410011 湖南省长沙市人民中路139号
国籍：CN
代理机构：长沙市融智专利事务所
代理人：颜勇
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高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液中的酪氨酸和色氨酸含量【摘要】本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量，固定相为：安捷伦Cl8（4.6mm×250mm，5um），甲醇-乙腈-0.1%醋酸钠水溶液（3：5：92）为流动相，检测波长为280nm；色氨酸在50～150μg·mL-1范围内呈良好的线性关系；酪氨酸在100～900μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

色氨酸和酪氨酸的平均回收率分别为99.5%、99.5%，RSD为0.63%（n=6）、0.56%（n=6）；此方法简便、准确、重现性好，可用于复方氨基酸注射液中色氨酸和酪氨酸的含量测定。

【关键词】复方氨基酸注射液；色氨酸；酪氨酸复方氨基酸注射液是一种透明、无色或微黄色的澄明液体，可提供完全、平衡的18种必需和非必需氨基酸，改善氮平衡。

复方氨基酸注射液具有促进人体蛋白质代谢正常，纠正负氮平衡，补充蛋白质，加快伤口愈合的作用。

复方氨基酸注射液用于大面积烧伤、创伤及严重感染等应激状态下肌肉分解代谢亢进、消化系统功能障碍、营养恶化及免疫功能下降的病人的营养支持。

复方氨基酸注射液含有L-脯氨酸（C5H9NO2）、L-组氨酸（C6H9N3O2）、L-色氨酸（C11H12N2O2）、L-丝氨酸（C3H7NO3）、L-丙氨酸（C3H7NO2）、L-精氨酸（C6H14N4O2）、L-缬氨酸等。

本文采用高校液相测定了复方氨基酸注射液中酪氨酸和色氨酸的含量。

1.仪器与试药WP-UP-Ⅱ-30分析型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；FL2200-2高效液相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司）；CO-1000型色谱柱温箱（武汉恒信世纪科技有限公司）；B8510E-DTH超声波清洗机（必能信超声（上海）有限公司）；320 XT 电子分析天平（上海精科天美贸易有限公司）；U-1901 双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

收稿日期:2016⁃07⁃10。

基金项目:国家自然科学基金资助项目(21465017)。

作者简介:支小平(1964-),男,副教授。

E -mail:1750811204@。

文章编号:1006⁃0464(2016)04⁃0341⁃05高效液相色谱⁃串联质谱法同时测定人体尿液中的酪氨酸和色氨酸支小平1,崔盼盼2,柳英霞2(1.南昌师范高等专科学校,江西南昌　330103;2.南昌大学分析测试中心,江西南昌　330047)摘　要:建立了高效液相色谱⁃串联质谱法(HPLC⁃MS /MS)同时测定人体尿液中游离酪氨酸和色氨酸分析新方法。

采用乙腈-0.1%甲酸溶液(10︓90,V︓V)为流动相,流速为0.3mL·min -1。

在全扫描模式下,将m /z 为182.2、205.2的离子分别确定为酪氨酸和色氨酸的母离子,m /z 136.1与188.0分别为定量子离子。

在质谱的多反应监测正离子模式下进行分析,酪氨酸和色氨酸的检测限分别为0.10和0.25ng·mL -1。

在已优化的色谱和质谱条件下,待测样品经过简单的离心、过滤后即可直接进样检测。

在3个不同添加水平的回收实验中,酪氨酸和色氨酸的平均回收率为74.0%~124.0%,RSD 值小于7.97%,表明该方法可满足实际样品检测要求。

该方法操作简单、快速、灵敏度高,可用于人体尿液中游离酪氨酸和色氨酸的同时测定。

关键词:高效液相色谱⁃串联质谱;人体尿液;酪氨酸;色氨酸中图分类号:O657 文献标志码:ASimultaneous determination of tyrosine and tryptophanin human urine by HPLC⁃MS /MSZHI Xiaoping 1,CUI Panpan 2,LIU Yingxia 2(1.Nanchang Teachers College,Nanchang 330103,China;2.Center of Analysis and Testing,Nanchang University,Nanchang 330047,China)Abstract :A new method for the simultaneous determination of free tyrosine and tryptophan in human urine samples by HPLC⁃MS /MS was developed.The chromatographic separation was achieved on an Agilent XDB⁃C 18column(4.6×50mm,1.8μm),the column temperature was 25℃,the mobile phase was CH 3CN ⁃0.1%HCOOH(10︓90,v /v),the flow rate was 0.3mL·min -1.In the full scan mode,the m /z 182.2and m /z 205.2were identified as the precursor ions of tyrosine and tryptophan,the m /z 136.1and m /z 188were quantitative product ion,respective⁃ly.The analysis was realized by multiple reaction⁃monitoring modes.Under optimal conditions,the linear ranges of tyrosine and tryptophan were 0.001-2.00μg·mL -1,and the limits of detection were 0.10and 0.25ng·mL -1,respectively.The average recoveries for tyrosine and tryptophan(spiked at three different levels)ranged from 74.0to 124.0%,the RSD was below 7.97%.The method is simple,rapid and sensitive,and suitable for the simultane⁃ous determination of free tyrosine and tryptophan in human urine.Key words :HPLC⁃MS /MS;Urine samples;Tyrosine;Tryptophan 氨基酸不但是构建生物体的基本物质,而且在生物机体的生命活动中扮演着重要角色,它是生物化学、蛋白质组学、临床医学等领域的重要研究内容[1-2]。

高效液相色谱—荧光法同时测定肺癌患者血清色氨酸和酪氨酸的开题报告一、研究背景和意义肺癌是全球范围内最常见的致死性癌症之一，严重威胁人类健康。

目前，肺癌的诊断和治疗仍存在一定的局限性，因此，开发一些新的方法和手段具有十分重要的意义。

血清中的各种代谢产物可以反映人体内的生理和病理状态，如能够找到一种方法准确、敏感地检测肺癌患者血清中的代谢产物，对于肺癌的早期检测和治疗具有重要的指导和参考价值。

色氨酸和酪氨酸是人体内两种重要的氨基酸，对于肺癌的诊断和治疗具有重要的生化基础。

已有文献报道，肺癌患者血清中色氨酸和酪氨酸含量明显高于正常人群，因此，检测血清中色氨酸和酪氨酸水平，可以成为肺癌的辅助诊断指标。

高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和检测技术，具有分离效率高、灵敏度高、选择性好等优点，已被广泛应用于生物医学研究中。

此外，荧光检测方法灵敏度高、准确性好、可选择性强，用荧光检测HPLC分离的代谢产物具有较好的适应性和应用潜力。

因此，本研究拟采用HPLC-荧光检测法，建立一种同时测定肺癌患者血清中色氨酸和酪氨酸含量的分析方法，为肺癌的早期诊断和治疗提供科学依据。

二、研究内容和方法本研究的主要内容是建立HPLC-荧光检测法，同时测定肺癌患者血清中色氨酸和酪氨酸的含量。

具体方法如下：1. 样品收集和制备收集50例肺癌患者和50例健康人群的血清样品，血清中的色氨酸和酪氨酸含量用固相萃取进行制备。

2. 色氨酸和酪氨酸的HPLC-荧光检测采用C18反相柱，以水和甲醇为流动相进行线性梯度洗脱，荧光检测器检测。

3. 方法优化和验证优化HPLC分离条件和荧光检测参数，确定色氨酸和酪氨酸的定量范围和线性范围，比较不同批次和不同操作人员的结果差异，验证方法的可行性和可靠性。

三、预期结果和意义本研究预期建立一种同时测定肺癌患者血清中色氨酸和酪氨酸含量的HPLC-荧光检测方法，具有以下特点：1. 灵敏度高：荧光探测器可以提高检测的灵敏度，有利于低浓度色氨酸和酪氨酸的检测。

基于HPLC的标准加入法同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸陈月;康宏艳;胡楠;杨青;郁韵秋【摘要】目的建立一种同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸浓度的高效液相色谱(HPLC)法,用于评价小鼠给予IDO抑制剂后体内IDO活性.方法血清用6％高氯酸沉淀蛋白法处理,离心后取上清进样,采用标准加入法定量.选用ThermoHypersil GOLD色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,流动相为乙腈-醋酸钠(15mmol/L,冰醋酸调pH至4.0),流速1.1 mL/min,柱温30℃,犬尿氨酸和色氨酸的紫外检测波长分别为360 nm和280 nm.结果犬尿氨酸保留时间为6.10 min,线性范围为0.25～10 μ mol/L,检测限为0.09 μmol/L;色氨酸保留时间10.12 min,线性范围为25～1 000 μmol/L,检测限为0.25μmol/L.精密度、回收率及稳定性等均符合生物样品定量分析方法验证指导原则的要求,并成功应用于62只小鼠血清犬尿氨酸和色氨酸浓度的测定.结论建立了一种简单、快速、准确的HPLC分析方法,采用标准加入定量方式,可同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸血药浓度,并成功应用于实际生物样本的测定.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2016(043)006【总页数】6页(P704-709)【关键词】犬尿氨酸;色氨酸;HPLC;血清;标准加入法;小鼠【作者】陈月;康宏艳;胡楠;杨青;郁韵秋【作者单位】复旦大学药学院药物分析教研室上海201203;复旦大学药学院药物分析教研室上海201203;复旦大学生命科学学院生物化学与分子生物学系上海200438;复旦大学生命科学学院生物化学与分子生物学系上海200438;复旦大学药学院药物分析教研室上海201203【正文语种】中文【中图分类】R917色氨酸(tryptophan,Trp)是哺乳类动物合成必需的氨基酸之一,也是构成蛋白质的重要成分,还可以在肝、肾等组织中代谢成为生物活性分子。

在线衍生—高效液相色谱法同时测定血浆色氨酸及其代谢物目的：1.建立一种在线衍生高效液相色谱紫外-荧光法同时测定血浆中色氨酸（tryptophan，Trp），犬尿氨酸（kynurenine，Kyn），5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid，5-Hiaa)和犬尿喹啉酸（kynurenic acid，Kyna)的浓度。

2.用所建立的方法测定正常孕妇，糖尿病患者，肝硬化患者和健康对照组血浆中Trp，Kyn，5-Hiaa和Kyna的含量，从而更全面地了解人体内不同生理和病理状态下Trp代谢情况。

方法：1.采用Hypersil C18柱（250mm×4.0mm；5μm）分离，以3-硝基酪氨酸（3-N-Tyr）为内标（IS）。

流动相为250mmol／L醋酸锌溶液（pH5.5）-乙腈（95:5，v／v）；流速0.8ml/min；柱温30℃；进样量：50μL；紫外检测波长程序：0.00~13.00min，360nm；13.01~17.00min，302nm。

荧光检测波长程序：0.00~10.00min，激发光波长（Ex）和发射光波长（Em）分别为278nm和343nm；10.01~14.00min，Ex和Em分别为244nm和400nm；14.01~17.00min，Ex和Em分别为302nm和400nm；分析时间18min。

2.利用该方法测定糖尿病患者（n=101），正常孕妇（n=70），肝硬化患者（n=68）和健康对照组血浆（n=54）中Trp，Kyn，5-Hiaa和Kyna的含量。

结果：1.5-Hiaa，Kyn，3-N-Tyr，Kyna和Trp保留时间分别为6.7，9.0，11.4，13.5，16.1min。

5-Hiaa，Kyn，Kyna和Trp线性范围分别为：3.27~104.60nmol ／L，0.32~15.36μmol／L，14.0~464.8nmol／L和2.5~320.0μmol／L，最低检测限分别为：1.22nmol／L，0.048μmol／L，1.29nmol／L和0.54μmol／L。

高效液相色谱法同时测定血清中的犬尿氨酸和色氨酸王瑞;唐爱国【期刊名称】《色谱》【年(卷),期】2006(24)2【摘要】建立了一种能同时检测血清中的犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)和色氨酸(tryptophan,Trp)的高效液相色谱-紫外检测法.采用的色谱柱为Symmetry Shield RP-C18柱(150 mm×3.9 mm i.d.,5 μm),流动相为15 mmol/L乙酸钠-乙酸溶液(含2.7%乙腈,pH 3.6),流速为1.0 mL/min,紫外检测波长为225 nm.血清标本经5.0% (体积分数)高氯酸溶液去除蛋白质后取上清液直接进样分析测定.研究结果表明,Kyn保留时间为3.5 min,线性范围为0.098～49 μmol/L,最低检出浓度为0.02 μmol/L,回收率为90.82% ～93.45% ;Trp保留时间为8.1 min,线性范围为4.9～490 μmol/L,最低检出浓度为0.20 μmol/L,回收率为95.51% ～98.67% .Kyn和Trp日内、日间测定的相对标准偏差均小于4% ,苯丙氨酸、酪氨酸、5-羟色胺和犬尿喹啉酸等物质对该法均无干扰.该方法简便、快速、稳定、可行,可应用于临床和科研工作.【总页数】4页(P140-143)【作者】王瑞;唐爱国【作者单位】中南大学湘雅二医院检验科,湖南,长沙,410011;中南大学湘雅二医院检验科,湖南,长沙,410011【正文语种】中文【中图分类】O658【相关文献】1.高效液相色谱法测定细胞培养液中色氨酸和犬尿氨酸含量研究报告 [J], 黄文娟;刁娟娟2.高效液相色谱法同时测定血清色氨酸和犬尿氨酸浓度的方法建立及应用 [J], 张晓清;王猛;丁敏3.帕金森病患者血清中犬尿氨酸、犬尿喹啉酸及色氨酸的测定及临床意义 [J], 唐亚梅;张付峰;刘勇;常丹丹;任亚萍4.基于HPLC的标准加入法同时测定小鼠血清中犬尿氨酸和色氨酸 [J], 陈月;康宏艳;胡楠;杨青;郁韵秋5.HPLC同时测定关节炎大鼠血清色氨酸和犬尿氨酸 [J], 韩萍; 杨雪枝; 赵英杰; 张冰洁; 李丝雨; 张斌斌; 常艳; 魏伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬尿氨酸（Kyn）检测
犬尿氨酸（Kynurenine, Kyn），古武弥四郎、岩尾次郎在饲以色氨酸的兔尿中
发现L-型犬尿氨酸，证明是色氨酸的代谢中间产物。

在动物体内变为犬尿喹啉酸，另外经过3-羟犬尿酸变为黄尼烯酸、烟酸等，还经过乙酰CoA而完全分解。

果蝇或蚕等昆虫的眼和卵的出现、色素作用物质（V+物质）与犬尿氨酸是同一
物质。

研究人员认为它与尿色素和尿色素原等动物的正常尿色素（黄色）的发
色团有密切的关系。

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1. 实验步骤（中英文）
2. 相关质谱参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. L-犬尿氨酸含量信息
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