纤维素降解菌的 筛选及其降解特性的研究
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(School of Science , Harbin Institue of Technology , Harbin 150001 , China)
Abstract : 3 species of f ungi were selected f rom t he nat ured enviroment and t he remains of degraded corn st raw . Different combinations of t hese 3 f ungi had different cellulase activities . It was found t hat t he cellu2 lase activity can be obviously increased when Trichoderma . sp was mixed wit h Penicillium. sp . It can reach t he peak after 72 hours cult uring ,t he amount is 3. 116u , and it can grow rapidly in solid medium wit h CMC - Na as t he sole carbon source , and t he utilization ratio of crude cellulose is 68 %. This result exceeds t he expression of t hese 2 f ungi t han t hat of t heir separate growt h. The cellulase activity of Trichoderma . sp mixed wit h Aspergillus. sp or wit h combination of Aspergillus. sp and Penicillium. sp . can also grow faster t han t he single cult ure of t he Aspergillus. sp and Penicillium. sp , but it is not significantly different f rom growt h of Trichoderma . sp . It is proved t hat when bombined t he st rains can increase t he degrading ability , offer a new way to deal wit h t he crops st raw. Key words : degrading cellulose ; activity of cellulase ; mixed cult ure ; utilization ratio of crude cellulose
2 结 果
2. 1 纤维素分解菌的分离筛选与纯化 按照“培养 →分离单菌落 →纯化 →初筛 →复
筛”的方法 ,在大兴安岭地区的土壤 、腐木及玉米 秸秆的降解物中分离到 3 种可对纤维素进行有效 降解的菌株. 经初步鉴定 ,该 3 种菌株分属于木 霉属 ( T richoderm a . sp ) 、曲 霉 属 ( Aspergill us . sp) 、青霉属 ( Penicilli u m . sp) . 2. 2 纤维素分解菌的单独或混合培养对纤维素
后 ,用 1 cm2 打孔器打孔转接在复筛培养基上生 长 ,每隔 24 h 测量其溶解圈的直径 ,取平均值计 算 CMC 酶相对活性 A [2 ] . A = 溶解圈的直径 (cm) / 菌体的培养时间 (d) 1. 2. 5 粗纤维利用率的测定 :用质量分数为 8 % 的甲酸溶液处理降解剩余物 ,然后用定性滤纸过 滤 ,过滤时用蒸馏水分数次冲洗 ,将滤纸置于 50 ℃下烘干至恒重[3 ] . 1. 2. 6 纤维素分解菌的单独或混合培养对玉米 秸秆降解的影响 :取玉米秸秆粉 100 g 装入 1 000 ml 烧杯中 ,将菌种按 1∶10 接入秸秆粉中 ,于 28 ℃观察其降解速度和表观变化 ,共观察 30 d.
第 3 4 卷 第 2 期 哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 Vol. 34 No. 2
2 0 0 2 年 4 月 Journal of Harbin Institute of Technology Apr. , 2 0 0 2
图 1 不同培养时间纤维素酶活力变化动态图 Fig. 1 Trend picture of cellulase activity at different culture
time
第 2 期 宋颖琦 , 等 :纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究
表 1 纤维素降解菌株( 群) 在不同培养时间的纤维素酶活力 Table 1 Cellulase activity of strains at different culture time
杨 谦 (1959 - ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师.
又污染环境 ,因此合理开发和科学利用这一丰厚 的天然资源是各国政府及科学家一直致力于且投 入大量资金及人力进行研究开发的重点领域. 目 前对农作物秸秆的利用还未达到令人满意的水 平 ,其主要原因是缺乏对农作物秸秆这种天然纤 维素完全降解的高活性菌株. 本文通过在自然环 境和秸秆降解物中大量采集和筛选后得出 3 种优 良菌株 ,并对其产酶特性进行初步研究 ,发现木霉 与青霉菌株混合培养后具有纤维素酶的高产协同
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哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 第 34 卷
作用 ,为玉米秸秆中纤维素的有效降解提供一条 新的途径.
1 材料与方法
1. 1 材 料 大兴安岭地区土壤及腐木 、玉米秸秆的降解
物 , 上海化学试剂公司生产的粘度为 800～1 200 的羧甲基纤维素钠 (CMC - Na) ,玉米秸秆粉碎成 锯末状.
2. 918
2. 917
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E
0. 901
1. 756
2. 177
2. 299
2. 327
2. 329
F
1. 266
2. 000
2. 300
2. 392
纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究
宋颖琦 , 刘睿倩 , 杨 谦 , 宋金柱 , 杜金哲
(哈尔滨工业大学 理学院 , 黑龙江 哈尔滨 150001)
摘 要 : 在自然环境和秸秆降解物中筛选出 3 种分解纤维素能力较强的木霉 、青霉和曲霉 ,将 3 种菌株以不 同的组合形式在羧甲基纤维素钠为唯一碳源的产酶培养基中进行产酶特性的研究 ,计算其对玉米秸秆粉中 粗纤维的利用率并观测玉米秸秆粉的降解状态. 其中木霉与青霉的混合培养在纤维素筛选培养基上培养 24 h 后即可生长 ,在发酵培养基中培养 72 h 后达到产酶高峰 ,酶活可达 3. 116 u ,对粗纤维的利用率为 68 % ,远 超过青霉和木霉的单独培养 ;木霉与曲霉二者混合 ,木霉与青霉 、曲霉三者混合培养的产酶效果也要超出青 霉和曲霉的单独培养 ,但与木霉相比无明显差异. 实验结果表明优良菌株的混合培养会增加其对纤维素的 降解能力 ,为实际生产中有效的处理农作物秸秆提供了理论依据. 关键词 : 纤维素降解 ;纤维素酶活 ;混合培养 ;粗纤维利用率 中图分类号 : X172 文献标识码 : A 文章编号 : 036726234 (2002) 0220197204
培养基 : 初筛培养基 : PDA 培养基 (马铃薯 200 g ,蔗 糖 20 g ,琼脂 15 ～18 g ,水 1 000 ml 、p H 值自然) . 复筛培养基 : CMC - Na 10 g , (NH4) 2SO4 4 g , KH2PO4 2 g , MgSO4·7H2O 0. 5 g , 蛋白胨 1 g , 琼脂 16 g , 蒸馏水 1000 ml. 发酵产酶培养基: CMC - Na 10 g ,(NH4)2SO4 4 g , KH2PO4 2 g ,MgSO4·7H2O 0. 5 g ,蛋白胨 10 g ,麦芽汁 10 ml ,水 1 000 ml. 1. 2 方法 1. 2. 1 纤维素分解菌的分离与纯化 :将采集样品 按照常规的稀释分离法分离真菌并纯化 ,接种于 以玉米秸秆粉为主要基质的固体培养基中 ,在 30 ～35 ℃条件下培养 15 d ,观察菌的生长状况及培 养基的变色程度 ,选取菌株生长快 、培养基变色程 度大的菌株作为纤维素分解菌 ,将该菌株接种于 以羧甲基纤维素钠 ( CMC - Na) 为唯一碳源的固 体培养基上进行复筛 ,根据菌丝的生长速度及 CMC - Na 的液化程度 ,选出纤维素降解菌的优 良菌株. 1. 2. 2 纤维素分解菌的单独与混合发酵培养 :取 250 ml 的锥形瓶 ,装入 100 ml 的培养基 ,并以体 积比为 15 %的接种量接种 ,使其活菌数达到 1 × 109/ ml ,于 30 ℃、200 r/ min 的摇床震荡培养 ,每 隔 24 h 测量 CMC 酶活. 1. 2. 3 β- 1 ,4 葡萄糖酶液 ( CMC 酶) 制备与酶 活力 测 定 方 法 : 培 养 液 经 3 000 r/ min 离 心 10 min ,上清液为粗酶液 ,取 0. 1 ml 上清液加入 1. 9 ml 质量分数为 1 % 的 CMC - Na 溶液 ,在 50 ℃ 下水解 20 min ,加入 1. 5 ml DNS 进行沸水浴 10 min ,定容至 25 ml ,在 520 nm 处比色. 在上述条 件下产生 1 μmol/ min 还原糖所需的酶量为一个 酶活单位 (u) [1 ] . 1. 2. 4 羧甲基纤维素酶相对活性测定 :将纤维素 分解菌株在 PDA 培养基上单独或混合培养 48 h
酶活力的影响 将纤维素分解菌进行单独或混合培养 ,其处 理组合如下所示 : A ———木霉 、B ———青霉 、C ——— 曲 霉 、D ———木 霉 + 青 霉 、E ———木 霉 + 曲 霉 、 F ———木霉 + 青霉 + 曲霉. 将 6 种处理组合分别 接入发酵产酶培养基中 ,每隔 24 h 测量 CMC 酶 活 ,结果如表 1 所示 ,72 h 时 CMC 酶活的差异显 著性分析如表 2 所示 / 群
Abstract : 3 species of f ungi were selected f rom t he nat ured enviroment and t he remains of degraded corn st raw . Different combinations of t hese 3 f ungi had different cellulase activities . It was found t hat t he cellu2 lase activity can be obviously increased when Trichoderma . sp was mixed wit h Penicillium. sp . It can reach t he peak after 72 hours cult uring ,t he amount is 3. 116u , and it can grow rapidly in solid medium wit h CMC - Na as t he sole carbon source , and t he utilization ratio of crude cellulose is 68 %. This result exceeds t he expression of t hese 2 f ungi t han t hat of t heir separate growt h. The cellulase activity of Trichoderma . sp mixed wit h Aspergillus. sp or wit h combination of Aspergillus. sp and Penicillium. sp . can also grow faster t han t he single cult ure of t he Aspergillus. sp and Penicillium. sp , but it is not significantly different f rom growt h of Trichoderma . sp . It is proved t hat when bombined t he st rains can increase t he degrading ability , offer a new way to deal wit h t he crops st raw. Key words : degrading cellulose ; activity of cellulase ; mixed cult ure ; utilization ratio of crude cellulose
2 结 果
2. 1 纤维素分解菌的分离筛选与纯化 按照“培养 →分离单菌落 →纯化 →初筛 →复
筛”的方法 ,在大兴安岭地区的土壤 、腐木及玉米 秸秆的降解物中分离到 3 种可对纤维素进行有效 降解的菌株. 经初步鉴定 ,该 3 种菌株分属于木 霉属 ( T richoderm a . sp ) 、曲 霉 属 ( Aspergill us . sp) 、青霉属 ( Penicilli u m . sp) . 2. 2 纤维素分解菌的单独或混合培养对纤维素
后 ,用 1 cm2 打孔器打孔转接在复筛培养基上生 长 ,每隔 24 h 测量其溶解圈的直径 ,取平均值计 算 CMC 酶相对活性 A [2 ] . A = 溶解圈的直径 (cm) / 菌体的培养时间 (d) 1. 2. 5 粗纤维利用率的测定 :用质量分数为 8 % 的甲酸溶液处理降解剩余物 ,然后用定性滤纸过 滤 ,过滤时用蒸馏水分数次冲洗 ,将滤纸置于 50 ℃下烘干至恒重[3 ] . 1. 2. 6 纤维素分解菌的单独或混合培养对玉米 秸秆降解的影响 :取玉米秸秆粉 100 g 装入 1 000 ml 烧杯中 ,将菌种按 1∶10 接入秸秆粉中 ,于 28 ℃观察其降解速度和表观变化 ,共观察 30 d.
第 3 4 卷 第 2 期 哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 Vol. 34 No. 2
2 0 0 2 年 4 月 Journal of Harbin Institute of Technology Apr. , 2 0 0 2
图 1 不同培养时间纤维素酶活力变化动态图 Fig. 1 Trend picture of cellulase activity at different culture
time
第 2 期 宋颖琦 , 等 :纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究
表 1 纤维素降解菌株( 群) 在不同培养时间的纤维素酶活力 Table 1 Cellulase activity of strains at different culture time
杨 谦 (1959 - ) ,男 ,博士 ,教授 ,博士生导师.
又污染环境 ,因此合理开发和科学利用这一丰厚 的天然资源是各国政府及科学家一直致力于且投 入大量资金及人力进行研究开发的重点领域. 目 前对农作物秸秆的利用还未达到令人满意的水 平 ,其主要原因是缺乏对农作物秸秆这种天然纤 维素完全降解的高活性菌株. 本文通过在自然环 境和秸秆降解物中大量采集和筛选后得出 3 种优 良菌株 ,并对其产酶特性进行初步研究 ,发现木霉 与青霉菌株混合培养后具有纤维素酶的高产协同
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哈 尔 滨 工 业 大 学 学 报 第 34 卷
作用 ,为玉米秸秆中纤维素的有效降解提供一条 新的途径.
1 材料与方法
1. 1 材 料 大兴安岭地区土壤及腐木 、玉米秸秆的降解
物 , 上海化学试剂公司生产的粘度为 800～1 200 的羧甲基纤维素钠 (CMC - Na) ,玉米秸秆粉碎成 锯末状.
2. 918
2. 917
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纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究
宋颖琦 , 刘睿倩 , 杨 谦 , 宋金柱 , 杜金哲
(哈尔滨工业大学 理学院 , 黑龙江 哈尔滨 150001)
摘 要 : 在自然环境和秸秆降解物中筛选出 3 种分解纤维素能力较强的木霉 、青霉和曲霉 ,将 3 种菌株以不 同的组合形式在羧甲基纤维素钠为唯一碳源的产酶培养基中进行产酶特性的研究 ,计算其对玉米秸秆粉中 粗纤维的利用率并观测玉米秸秆粉的降解状态. 其中木霉与青霉的混合培养在纤维素筛选培养基上培养 24 h 后即可生长 ,在发酵培养基中培养 72 h 后达到产酶高峰 ,酶活可达 3. 116 u ,对粗纤维的利用率为 68 % ,远 超过青霉和木霉的单独培养 ;木霉与曲霉二者混合 ,木霉与青霉 、曲霉三者混合培养的产酶效果也要超出青 霉和曲霉的单独培养 ,但与木霉相比无明显差异. 实验结果表明优良菌株的混合培养会增加其对纤维素的 降解能力 ,为实际生产中有效的处理农作物秸秆提供了理论依据. 关键词 : 纤维素降解 ;纤维素酶活 ;混合培养 ;粗纤维利用率 中图分类号 : X172 文献标识码 : A 文章编号 : 036726234 (2002) 0220197204
培养基 : 初筛培养基 : PDA 培养基 (马铃薯 200 g ,蔗 糖 20 g ,琼脂 15 ～18 g ,水 1 000 ml 、p H 值自然) . 复筛培养基 : CMC - Na 10 g , (NH4) 2SO4 4 g , KH2PO4 2 g , MgSO4·7H2O 0. 5 g , 蛋白胨 1 g , 琼脂 16 g , 蒸馏水 1000 ml. 发酵产酶培养基: CMC - Na 10 g ,(NH4)2SO4 4 g , KH2PO4 2 g ,MgSO4·7H2O 0. 5 g ,蛋白胨 10 g ,麦芽汁 10 ml ,水 1 000 ml. 1. 2 方法 1. 2. 1 纤维素分解菌的分离与纯化 :将采集样品 按照常规的稀释分离法分离真菌并纯化 ,接种于 以玉米秸秆粉为主要基质的固体培养基中 ,在 30 ～35 ℃条件下培养 15 d ,观察菌的生长状况及培 养基的变色程度 ,选取菌株生长快 、培养基变色程 度大的菌株作为纤维素分解菌 ,将该菌株接种于 以羧甲基纤维素钠 ( CMC - Na) 为唯一碳源的固 体培养基上进行复筛 ,根据菌丝的生长速度及 CMC - Na 的液化程度 ,选出纤维素降解菌的优 良菌株. 1. 2. 2 纤维素分解菌的单独与混合发酵培养 :取 250 ml 的锥形瓶 ,装入 100 ml 的培养基 ,并以体 积比为 15 %的接种量接种 ,使其活菌数达到 1 × 109/ ml ,于 30 ℃、200 r/ min 的摇床震荡培养 ,每 隔 24 h 测量 CMC 酶活. 1. 2. 3 β- 1 ,4 葡萄糖酶液 ( CMC 酶) 制备与酶 活力 测 定 方 法 : 培 养 液 经 3 000 r/ min 离 心 10 min ,上清液为粗酶液 ,取 0. 1 ml 上清液加入 1. 9 ml 质量分数为 1 % 的 CMC - Na 溶液 ,在 50 ℃ 下水解 20 min ,加入 1. 5 ml DNS 进行沸水浴 10 min ,定容至 25 ml ,在 520 nm 处比色. 在上述条 件下产生 1 μmol/ min 还原糖所需的酶量为一个 酶活单位 (u) [1 ] . 1. 2. 4 羧甲基纤维素酶相对活性测定 :将纤维素 分解菌株在 PDA 培养基上单独或混合培养 48 h
酶活力的影响 将纤维素分解菌进行单独或混合培养 ,其处 理组合如下所示 : A ———木霉 、B ———青霉 、C ——— 曲 霉 、D ———木 霉 + 青 霉 、E ———木 霉 + 曲 霉 、 F ———木霉 + 青霉 + 曲霉. 将 6 种处理组合分别 接入发酵产酶培养基中 ,每隔 24 h 测量 CMC 酶 活 ,结果如表 1 所示 ,72 h 时 CMC 酶活的差异显 著性分析如表 2 所示 / 群
