分解纤维素微生物的分离与纯化实验操作与注意事项一、引言纤维素是一种重要的天然生物质，广泛存在于植被、农业废弃物和生活垃圾中。
分解纤维素的微生物对于生物能源转化、环境修复和生物材料制备具有重要意义。
本实验旨在介绍如何进行纤维素分解微生物的分离与纯化，以便更好地研究和利用这些微生物。
二、材料与设备1. 纤维素基质（例如木材粉末、花生壳碎屑等）2. 无菌培养基（适合目标微生物的培养基）3. 纤维素分解微生物样品4. 离心管、试管、平板培养基等常用实验室器材5. 灭菌器、微量移液器、孵化箱等实验设备三、实验步骤1. 样品处理a) 收集纤维素分解微生物样品，如土壤、水体或植物材料。
b) 将样品进行悬浮液处理，使用适当的稀释液（如生理盐水）或培养基进行悬浮液的制备。
c) 通过过滤或离心等操作，去除悬浮液中的大颗粒物质，得到较为均匀的样品。
2. 分离与纯化a) 取一定数量的样品悬液，分别均匀涂布在含有纤维素的固体培养基表面（例如含有纤维素的琼脂平板）。
b) 使用洁净的铁环或无菌塑料处理棒，在固体培养基表面进行菌落的划线、划圆或刺取等操作，以分离出单个微生物菌落。
c) 将分离得到的单个菌落转移到无菌富含纤维素的液体培养基中培养。
3. 筛选与纯化a) 从初步培养基中挑选出优良的单菌落，根据其特征进行初步筛选。
b) 针对初步筛选出的菌落，进行进一步鉴定和纯化，采用形态学、生理生化特性及分子生物学方法进行分析。
c) 辅助使用显微镜、PCR、基因测序等技术手段，确保所得微生物为纤维素分解菌。
四、注意事项1. 实验操作应在无菌环境下进行，避免外源污染。
2. 纤维素的质量和处理方式会影响微生物的分离，选择适当的纤维素基质、浓度和处理方法。
3. 注意培养基的配制和pH值的调节，确保适合目标微生物的生长需求。
4. 操作过程中要注意个人防护，避免对自身和他人造成伤害。
5. 实验后要及时清洗和消毒使用的设备和试剂，避免污染和交叉感染。
纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化李荣杰（安徽丰原集团有限公司，安徽蚌埠233010）摘要：以纤维素粉为惟一碳源，从取自某木材公司木材堆放处的土样中筛选出92株能够分解纤维素的菌株，采用刚果红鉴别培养基进行鉴定，选取透明圈较大的菌株10株进行液体培养，并测定它们的酶活，获得一株酶活高的里氏木霉FYFJ928，其发酵水平为8.3IU/mL 。
进一步研究培养基组分及培养条件对里氏木霉FYFJ928摇瓶发酵产纤维素酶的影响，在培养温度28℃，转速为200r/min 条件下进行培养，其最佳培养基组成：0.5%酵母粉，0.06%硫酸镁，0.5%磷酸二氢钠，2%葡萄糖，2%玉米浆，0.5%硫酸铵和8%纤维素粉，培养6d 后，其发酵水平可达到15.6IU/mL ，比优化前提高了近1倍。
关键词：里氏木霉；筛选；纤维素酶中图分类号：Q939.5文献标识码：A文章顺序编号：1672-5190（2009）06-0009-03Isolation of High Producing Cellulase Strain and Its Culture Medium OptimizationLI Rong-jie（Anhui Fengyuan Co.,Ltd.,Bengbu 233010,China ）Abstract ：The 92strains of cellulose-decomposing microorganisms were isolated from soil with timber plant stacked,ten colonies with distinct red zones were selected from them by congo red agar medium.By measuring the enzyme activity of liquid culture filtrates ，A strain （Trichoderma reesei FYFJ928）was obtained with higher cellulase activity ，and the filter paper enzyme （FPA ）was 8.3IU/mL.T.reesei was cultured in different medium to study the ability of producing cellulase at 28℃with rotate speed at 200r/min.The optimum medium was determined as follows:0.5%yeast extract,0.06%MgSO 4,0.5%NaH 2PO 4,2%glucose,2%corn steep liquor,0.5%（NH 4）2SO 4and 8%cellulose powder,the FPA was 15.8IU/mL under the optimized culture medium after cultured for 6days ．Key words ：Trichoderma reesei ;screening;Cellulase纤维素是自然界中含量最丰富的碳水化合物，是一类可再生的资源和能源。
纤维素分解菌筛选及保存一、采样到放牧或放养牲畜的草地上或者树林里，采集牲畜粪便周围的表皮土壤腐殖质多份，以不超过15cm深为宜。
二、样品预处理用无菌水将样品充分溶解，静置沉淀，取上清，再稀释到合适倍数。
三、初筛1、初筛培养基配备（g/L）Na2HPO4 4.0，KH2PO4 2.0，NaCl 0.5，NH4NO3 0.5，MgSO4·7H2O，酵母膏，FeS04，CaCl2，CuSO4少许。
2、在16mm×160mm试管中装初筛培养基5mL，再放入60mm×10mm的滤纸条一张，使其紧靠于试管内壁并靠近试管底部，上端露出10mm左右，将初筛培养基高压蒸气灭菌(115大气压)20分钟后取出，待降温至35℃左右无菌操作下接入lmL样品，置于30℃摇床里振荡培养，每个样品做3组。
观察滤纸崩溃情况，滤纸崩溃速度快、崩溃程度高的试管内含有降解纤维素的菌株多。
3、取含有纤维素分解菌多的样品继续做传代培养，即将上步中滤纸崩溃程度高的样品菌株作为样品，再重复2的实验步骤，观察是否传代稳定，选取其中传代稳定的菌株作为分离对象。
四、分离1、分离培养基配备(g/L)KH2PO4 2.0，(NH4)2SO4 1.4，MgSO·7H2O 0.3，CaC120.3，FeSO4·7H2O 0.005，MnSO40.0016，ZnSO4 0.0017，CoC12 0.002，琼脂20，纤维素粉10，蒸馏水1000ml，自然pH，压力1.05Kg/cm2，灭菌20min。
2、平板分离无菌条件下，使用上述培养基于培养皿中进行平板划线分离操作，来接种初筛中获得的传代稳定的纤维素分解菌株，获得一系列单个菌落，再挑取单菌落重复平板划线操作，直至获得纯培养。
纯培养的证实是将获得菌株作片在显微镜下观察，若菌株形态相同，则表明己分纯，否则仍为混菌，则需进一步分纯。
五、复筛1、复筛培养基配备（g/L）纤维素粉7.5，KH2PO4 2.0，(NH2)2S04 1.4，MgSO·7H2O 0.3，CaC12 0.3，尿素0.3，蛋白胨0.5，FeSO4·7H2O 0.005，MnSO4 0.0016，ZnSO4 0.0017，CoC12 0.002，蒸馏水1000ml，自然pH，压力1.05Kg/cm2，灭菌20min。
课题3 分解纤维素的微生物的分离课题背景纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。
植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。
地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。
对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。
而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类众多的微生物中分离出来。
在本课题中，我们将探讨如何分离土壤中能够分解纤维素的微生物。
基础知识（一）纤维素与纤维素酶棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物（图2-11），此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
许多商品纤维素都是由天然纤维素制得的，如水溶性的羧甲基纤维素钠（ CMC-Na ）、不溶于水的微晶纤维素（Avicel ）等。
纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。
下面我们通过一个小实验来体会纤维素酶的作用。
在2支20 mL的试管中，分别放入1 cm×6 cm的滤纸条，再分别加入pH为4.8、物质的量浓度为0.1 mol/L的醋酸—醋酸钠缓冲液10 mL、11mL。
在加入10 mL缓冲液的试管中加入 1 mL纤维素酶（70~80 U/mL ）。
将2支试管固定在50 mL的锥形瓶中，在摇床上以140 r/min的转速振荡反应1h，观察结果。
你也可以用报纸、复印纸做这个实验。
如果没有摇床，你可以采用定时人工振荡的方法。
时间足够长时，你会观察到滤纸被完全分解（图2-12）。
1U表示1个酶活力单位，是指在温度为25℃，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1 min内转化1 mmol的底物所需的酶量。
