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第二军医大学硕士学位论文利用毽行质谱整查丛塑墨蟹璺耋坐堕！塑垫壁墨塑竺塑堑查塑ｌＳＥＬＤＩ—ＴｏＦ蛋白质芯片仪的组成及工作原理美国ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ生物公司生产的ｓＥ∽Ｉ—ＴＯＦＭｓ（ｓｕｒｆａｃｅｅｎｈａｎｃｅｄｌａｓｅｒ（】ｅｓｏｒｐｒｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ—ｔｉｍｅｏｆｆ１ｉｇｈｔｍａｓｓ）主要包括三个基本部分。
１．１蛋自芯片阵列（ｐｒｏｔｅｉｎｃｈ．ｐａｒｍｙ）蛋白芯片阵列是特殊材料制成的固相载体，呈１０ｍｍ宽、８（）ｌＩｌｍ长的条索状外形，其中包含着８个～１６个直径为２咖的圆形孔斑，亦被称为芯池（图１）。
组成芯池的特殊材料是根据要捕获蛋白质的属性而设计地，概括起来可归纳为两大类型：①化学型材料；②生物化学型材料。
生物化学型材料表露被习惯陆地设置成开放性准活化平台，可以粘附预设计的诱饵分子；生物化学型平台根据特定的分子识别机制（如抗原一抗体、酶一酶作用物、受体～配体及蛋白质～ＤＮＡ等相互作用），亦可选择性地从样品中捕获目的蛋白。
化学型平台则是利用蛋白质的疏水性、亲水性、电荷特性及金属离子等普通属性设计而成，可分为疏水、亲水、阳离子、阴离子和金属离子螯和芯片及混合芯片６种，用于检测未知蛋白，并获取指纹图谱。
它可以使粗提液或样品中同一属性的蛋白质结合到芯池表面（图２）。
蛋白质芯片的制备：将ｌ¨ｌ左右生物样品（血清、血液、精液、尿液、细胞裂解液等）点到芯池中，经过一段时间，蛋白质通过亲合作用结合到芯片的化学或生物位点上。
用缓冲液梯度（调整ｐＨ或盐浓度）冲洗未结合或非特异结合蛋白质数次．在用弱缓冲液洗去残余盐离子及去污剂。
室温静置干燥后，加入能量吸收分子（ｅｎｅｒｇｙａｂｓｏｒｂｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＥＡＭ）溶液，目的蛋白便与能量吸收分子形成晶体。
以促进蛋白质在ｌｓ行时间质谱检测中的解吸附和离子化。
图ｌ蛋白芯片第二军医大学硕士学位论文利用飞行质谱技术从卵皋堡垒考堡煎生箜垄壁墨塑兰塑堡查塑化学表蔼图２芯片表面类型１．２蛋白质芯片解读仪（ｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｐ心ａｄｅｒ）蛋白质芯片解读仪是安装有脉冲式紫外线／氮激光光源的解析离子化（１ａｓｅｒｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＬＤＩ）时间一飞行质谱仪（ＴｏＦ嬲）。
乳腺癌紫杉醇耐药细胞中lncRNA和mRNA表达谱筛选陈天天;王文锐;陈素莲;陈昌杰;杨清玲【摘要】目的:分析紫杉醇诱导的乳腺癌MCF-7耐药细胞(MCF-7/PR)中长链非编码RNA(lncRNA)和信使RNA(mRNA)表达谱的变化,研究筛选出调控乳腺癌紫杉醇耐药的关键lncRNAs,为逆转紫杉醇耐药的分子靶点提供理论依据.方法:利用ArraystarlncRNA芯片技术检测MCF-7/PR细胞中lncRNAs和mRNAs的表达谱;使用Agilent GeneSpring GX v12.1软件筛选差异表达的lncRNAs和mRNAs,对差异mRNAs进行GO和KEGG通路分析,得到mRNA参与的生物学途径;并同时进行lncRNAs与相应mRNAs联合分析推断lncRNAs功能.结果:通过MCF-7/PR细胞和MCF-7亲本细胞相比,共有1 504个lncRNAs和2264个mRNAs 存在差异性表达(差异倍数＞2.0);通过GO聚类分析表明:上调的mRNAs和下调的mRNAs分别参与多种不同的生物过程;差异性lncRNAs可能通过影响相应mRNAs发挥其生物学功能.结论:乳腺癌紫杉醇耐药细胞中lncRNAs和mRNAs的表达存在差异,差异表达的基因可以为寻找新的化疗敏感靶点或生物标志物提供线索.【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2018(043)010【总页数】7页(P1322-1328)【关键词】乳腺肿瘤;紫杉醇耐药;长链非编码RNA;信使RNA【作者】陈天天;王文锐;陈素莲;陈昌杰;杨清玲【作者单位】蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院癌症转化医学安徽省重点实验室,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】R737.9乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，也是女性癌症死亡的第二大原因。
CCND2可能通过p53信号通路在顺铂耐药卵巢癌中起关键作用杨丹;解蓓蓓;刘文静;杨洁【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2022(30)7【摘要】目的:为了使接受顺铂药物治疗的卵巢癌患者获得更好的预后,本研究探讨了卵巢癌顺铂耐药的潜在分子机制。
方法:通过加权基因共表达网络分析挖掘GEO 数据中的GSE15372数据集得到A2780卵巢癌耐药细胞中与顺铂耐药相关的基因集;基于KEGG数据库进行通路富集分析获取卵巢癌中顺铂耐药的关键通路,并且在病人卵巢癌顺铂耐药数据集GSE23554中进行验证;结合关键信号通路和顺铂耐药相关基因筛选耐药相关的核心基因,并通过生存分析和Western blot实验进行验证。
结果:共筛选到1064个耐药相关的基因,其中623个基因属于差异表达基因。
通过KEGG over-represent test富集分析和基因集富集分析(GSEA)分析鉴定卵巢癌中顺铂耐药相关的关键信号通路是p53信号通路,耐药相关的核心基因是RRM2、CCND2和CCNE2。
通过生存分析得到CCND2高表达与卵巢癌的不良预后相关,并且Western blot证明CCND2在卵巢癌耐药细胞中高表达。
结论:CCND2可能通过p53信号通路在卵巢癌顺铂耐药中发挥重要作用,这些结果为卵巢癌顺铂耐药的分子机制研究提供了数据支持。
【总页数】5页(P1185-1189)【作者】杨丹;解蓓蓓;刘文静;杨洁【作者单位】烟台南山学院健康学院;郓城县人民医院【正文语种】中文【中图分类】R737.31【相关文献】1.顺铂耐药卵巢癌的差异表达基因和信号通路富集分析2.顺铂耐药卵巢癌的差异表达基因和信号通路富集分析3.外源性硫化氢通过EGFR/PI3K/Akt信号通路促进人卵巢癌细胞增殖、侵袭和顺铂耐药4.MEK/ERK信号通路在上皮性卵巢癌顺铂耐药中的参与作用5.黄腐酚类似物通过cAMP/Wnt/β-catenin信号通路抑制卵巢癌细胞增殖降低对顺铂的耐药性因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
卵巢癌耐药细胞株A2780-CP的建立及CD44+肿瘤干细胞功能验证目录第一章前言 (1)第二章材料与方法 (3)2.1实验材料 (3)2.2培养基及主要试剂 (3)2.3实验所用设备 (4)2.4主要试剂的配制 (4)2.5实验方法 (5)第三章结果与分析 (11)3.1 A2780-CP耐药细胞株和A2780普通细胞株生物学特性差别 (11)3.2 A2780-CP与A2780肿瘤干细胞生物学特性验证 (13)第四章讨论 (19)第五章结论 (22)参考文献 (23)综述 (26)卵巢癌干细胞与多药耐药之间的关系 (26)参考文献 (35)中英文缩略词表 (41)致谢 (42)卵巢癌耐药细胞株A2780-CP的建立及CD44+肿瘤干细胞功能验证第一章前言第一章前言卵巢癌是妇科常见三大肿瘤之一，其发病率低于子宫内膜癌，然而死亡率却位居妇科肿瘤之首[1]，对妇女生命健康有的极大的威胁。
卵巢的胚胎发育，组织解剖及内分泌功能相对较复杂，从而导致卵巢癌在早期表现出不明显的症状，并缺乏行之有效的早期诊断方法。
而很多患者发现时已经处于中晚期，无法进行手术治疗，需要借助抗肿瘤药物进行治疗。
虽然近年来各种小分子药物、抗体药物、免疫疗法等层出不穷，但顺铂和紫杉醇依然是卵巢癌的一线用药方式，可是80%-85%的卵巢癌患者会产生药物耐性，导致治疗失败[2]。
现有多数研究认为细胞耐药的根源是肿瘤干细胞，一种肿瘤组织中存在的一小群自我更新并多向分化的细胞[3]。
这部分细胞高表达耐药相关基因，可以将药物泵出体外减少对自身的伤害；另一方面，化疗药物可明显杀伤快速分裂的细胞，而处于静止状态的肿瘤干细胞具有的这一独有特性使之有利于避免被肿瘤药物杀伤[4]。
关于肿瘤干细胞的起源有多种学说，国内外学说现普遍接受的是：肿瘤干细胞很有可能来自突变了的成体干细胞。
肿瘤的产生是由于突变长期累积的结果，因而这一过程相当漫长。
而已经失去继续分裂能力的分化的体细胞，其生命周期短，无法完成多个基因突变的累积。
p38MAPK信号传导通路与卵巢癌关系研究进展龙玲;周琦;张笠【摘要】丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,这个级联反应几乎存在于所有生物细胞内,其亚族主要包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶(JNK)和p38MAPK.它们主要是作为细胞外信号转入细胞核内的重要信号通路,在细胞生长和细胞增殖过程有着重要的作用.近年研究发现,p38MAPK可介导应激、炎性细胞因子及细菌产物等多种刺激引起细胞反应,也可以通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平,对细胞的功能调节具有重要作用,参与卵巢癌细胞的凋亡、侵袭、转移和耐药等过程,故阐明p38MAPK通路的作用机制,将为卵巢癌的诊治提供新的思路和方法.综述p38MAPK信号通路在卵巢癌发展中的作用、卵巢癌相关p38MAPK耐药机制以及p38MAPK相关新药的研究进展.%Mitogen-activated protein kinases (MAPK) is a class ofserine/threonine protein kinase. This cascade existed broadly in mammalian cells. The subfamily includes extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38MAPK. It is a significant signaling pathway to deliver extracellular signals into nucleus, involved in the important mechanisms of cell growth and proliferation. Recently studies found that function of p38MAPK, mediating many cell reactions induced by stress, inflammatory cytokines or bacterial products and changing the level of gene expression through phosphorylation of transcription factor and play an important role in cell functions, involved in the process of oophoroma cells apoptosis, invasion, metastasis and drug resistance. Therefore, the clarification of mechanism of p38MAPK pathwaywill provide new thoughts and methods for diagnosis and treatment of ovarian cancer. This review summarizes the function of p38MAPK signal transduction pathway in ovarian cancer, and the p38MAPK related research progress of new drugs and drug resistance.【期刊名称】《国际妇产科学杂志》【年(卷),期】2017(044)005【总页数】5页(P494-498)【关键词】p38丝裂原活化蛋白激酶类;信号传导;信号通路;卵巢肿瘤;抗药性,肿瘤【作者】龙玲;周琦;张笠【作者单位】550025 贵阳,贵州医科大学;贵州医科大学附属医院;550025 贵阳,贵州医科大学【正文语种】中文卵巢癌致死率居妇科肿瘤的首位，原因在于其活性强，转移速度快并且在检测过程中不易被发现[1]。
基于气相色谱-质谱的拟靶向代谢组学方法分析大米中脂肪酸王希越; 明明; 连丽丽; 张浩; 娄大伟【期刊名称】《《色谱》》【年(卷),期】2020(038)002【总页数】5页(P250-254)【关键词】气相色谱-质谱; 拟靶向代谢组学; 脂肪酸; 大米【作者】王希越; 明明; 连丽丽; 张浩; 娄大伟【作者单位】化学与制药工程学院吉林化工学院吉林吉林 132022【正文语种】中文【中图分类】O658水稻是世界最主要的粮食作物之一,在我国种植面积广泛,而且我国有一半以上的人口都是以大米作为主食。
大米具有较高的营养价值,其含有丰富的碳水化合物、维生素及少量蛋白质、脂肪等[1]。
大米中脂肪含量虽然不多,但其是影响大米营养价值及品质的重要因素。
有研究发现,脂类氧化造成游离脂肪酸含量增加,进而导致大米陈化、变质[2,3]。
另外大米中含有人体所必需的几种脂肪酸,包括亚油酸、亚麻酸、油酸等,这些物质不仅是种子的营养物质,而且具有重要的医疗价值。
研究发现,亚油酸、亚麻酸对防治动脉硬化、糖尿病及心脑血管疾病的发生具有重要作用[4-6],而且不饱和脂肪酸含量有助于提高大米的香味,改善其整体质量[7],因此大米中脂肪酸的分析对其品质和营养价值研究有重要作用。
脂肪酸分析一般通过Folch方法、索氏萃取法、蒸馏萃取法等提取后甲酯化衍生,再用气相色谱-质谱进行检测分析[8-10]。
Folch方法中氯仿毒性大,对环境及人体有较大危害,另外索氏萃取法、蒸馏萃取法也需消耗大量有机溶剂。
近年来有研究[11-13]提出原位转酯化方法,可同时实现脂肪酸提取及甲酯化衍生。
该方法操作简单省时,有较好的提取效率及准确性,且消耗有机溶剂少,不需要使用氯仿等。
詹汉英等[13]建立了一步提取衍生方法对猫爪草中的脂肪酸进行分析,以正己烷做提取溶剂,提取衍生8 min,得到脂肪酸总量明显高于传统方法。
气相色谱-质谱是目前常用的脂肪酸检测方法,通过选择离子监测(SIM)的靶向分析方法可提高定量检测的灵敏度和准确性,但是方法的建立需要标准物质[14]。
基于生物信息学方法筛选卵巢癌铂类化疗耐药相关基因的研究韦仕洋;张明铭;黄晶;林丽娜;徐红【摘要】目的：从分子水平揭示卵巢癌化疗耐药的发病机制，为进一步的临床研究提供参考。
方法在公共基因芯片数据库GEO中找到卵巢癌相关基因芯片数据，使用Bioconductor R 2．13．0软件包对其进行分析，找到卵巢癌化疗铂类化疗耐药相关基因；利用STRING 9．1、DAVID 6．7在线工具对这些基因进行生物学分析。
结果共获得283个差异表达基因，其中表达上调基因69个，下调表达基因214个。
62个基因的蛋白有相互关系，确定ESR1、IGF1、SDC2、ADCY2、ADCY8、PTHLH、BMP等为关键基因。
这些基因的功能主要涉及底物特异性通道活性、被动的跨膜转运活性，参与钙信号通路、MAPK 信号通路等。
结论利用生物信息学的方法分析基因芯片数据可有效筛选并确定其中的关键基因，卵巢癌铂类化疗耐药的发生与基因分子水平表达变化有关，确定复发性卵巢癌相关基因的功能及其参与通路为研究卵巢癌耐药的治疗靶点提供了新的思路。
%Objective To investigate the molecular pathogenesis in platinum-resistant ovarian cancer for further study.Methods The gene chip data were retrieval microarray ovarian cancer in Gene Expression Omnibus database and analyzed by Bioconductor R 2.13.0,and the related genes in platinum-resistant ovarian cancer were screened out .The genes were analyzed with on-line bioinformatics tools STRING 9.1 and DAVID 6.7.Results A total of 283 differentially expressed genes were screened out ,with 69 up-regulated genes and 214 down-regulated genes .62 proteins/genes existed interaction between each other .ESR1,IGF1,SDC2,ADCY2,ADCY8,PTHLH and BMP were identified as key genes in the pathogenesis of platinum-resistant ovarian cancer .The main biological processes might involve in substrate-specific channel activity , passive transmembrane transport activity , calcium signaling pathway and MAPK signaling pathway . Conclusion Bioinformatics methods can be adopted to screen out gene chip data effectively and then identify key genes .The occurrence and development of chemo-resistant ovarian cancer involves in changes in molecular level ,and the investigations on these genes′function and their signaling pathway may provide valuable data and theory basis into the molecular mechanisms for the treatment of chemo-resistant ovarian cancer .【期刊名称】《广西医学》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】3页(P1692-1694)【关键词】卵巢癌;化学治疗;耐药;基因;生物信息学【作者】韦仕洋;张明铭;黄晶;林丽娜;徐红【作者单位】广西医科大学第一附属医院妇科，南宁市 530021;广西壮族自治区妇幼保健院，南宁市 530003;广西壮族自治区妇幼保健院，南宁市 530003;广西医科大学第一附属医院妇科，南宁市 530021;广西医科大学第一附属医院妇科，南宁市 530021【正文语种】中文【中图分类】R737.31卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，由于早期卵巢癌无特异的症状，多数初次就诊的卵巢癌患者已发展到晚期，目前晚期卵巢标准的治疗方法是肿瘤细胞减灭术辅以铂类药物、紫杉醇为基础的联合化疗方案［1］。
消癌平注射液调节核受体增强紫杉醇抑制卵巢癌A2780细胞增殖的机制张湘奇;陈君君;杨姣;石美智;祁美娟;肖霄;王洪斌;韩永龙【摘要】目的探讨消癌平注射液通过调节核受体PXR/CAR增强紫杉醇抑制卵巢癌A2780细胞增殖的作用机制.方法分别将20,40,80,160 mg·mL-1消癌平注射液,10,40,80,160 nmol·L-1紫杉醇单用,或两药联用于人卵巢癌细胞A2780细胞株,采用噻唑蓝(MTT)法检测药物对细胞的抑制率,倒置相差显微镜观察药物对细胞形态的影响,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测药物对PXR、CAR及下游药物代谢酶CYP2C8、CYP3A4、CYP3A5和转运体P-gp的mRNA表达的影响,Western blotting法检测药物对PXR、CYP2C8蛋白表达的影响.结果消癌平注射液处理卵巢癌A2780细胞后,细胞增殖受到抑制,且随药物浓度增加、作用时间延长,抑制率显著增加;与紫杉醇单用组比较,消癌平注射液联用紫杉醇后对细胞增殖的抑制作用更为显著;RT-PCR和Western blotting结果显示消癌平注射液可抑制紫杉醇激活的PXR及下游代谢酶CYP2C8的mRNA和蛋白的表达.结论消癌平注射液与紫杉醇联用能够增强紫杉醇对卵巢癌A2780细胞增殖的抑制作用,其机制可能与消癌平注射液抑制与药物代谢相关的核受体PXR和下游药物代谢酶CYP2C8表达有关.【期刊名称】《医药导报》【年(卷),期】2019(038)006【总页数】8页(P693-700)【关键词】消癌平注射液;紫杉醇;孕烷X受体;药物代谢;CYP2C8酶【作者】张湘奇;陈君君;杨姣;石美智;祁美娟;肖霄;王洪斌;韩永龙【作者单位】上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海 200233;上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科,上海 201306;上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海 200233;上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科,上海 201306;上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科,上海 201306;上海海洋大学食品学院,上海 201306;上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科,上海 201306;北加州大学药学院,美国加利福尼亚 CA95757;上海交通大学附属第六人民医院药剂科,上海 200233;上海健康医学院附属第六人民医院东院药剂科,上海 201306【正文语种】中文【中图分类】R969.2;R737.31消癌平注射液(xiaoaiping injection，XAP)是由通关藤药材精制提取而成的中药抗肿瘤单方制剂，在临床上常与紫杉醇[1]、吉非替尼[2]、多柔比星[3]等化学治疗(化疗)药物联合应用治疗肺癌、肝癌、胃肠肿瘤等，对化疗药物具有增效减毒作用，可以提高化疗药物的疗效。
基于气相色谱-质谱的代谢组学技术研究紫杉醇诱导的卵巢癌A2780耐药株的生物标志物崔广波;刘晓昕【摘要】采用气相色谱-质谱(GC-MS)的代谢组学技术研究人卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol与敏感细胞之间内源性代谢物的差异,初步探讨A2780/Taxol细胞生物学特性和耐药机制.使用浓度梯度法建立A2780/Taxol细胞,并通过细胞形态观察,生长曲线测定,药物敏感试验,细胞内多药耐药相关蛋白(MRP1)、P-糖蛋白(p-gp)和肺耐药蛋白(LRP)的水平测定,评价A2780/Taxol细胞的生物学特性.同时,采用GC-MS的代谢组学方法分别对卵巢癌敏感细胞株与紫杉醇耐药细胞株的代谢物指纹图谱进行分析,并通过偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)对代谢组学数据进行多元处理.结果表明:人卵巢癌细胞敏感细胞与耐药细胞相比,其中琥珀酸、天冬氨酸、果糖、肌醇等13种内源性代谢物存在显著性差异.糖降解、三羧酸(TCA)循环、肌苷代谢途径发生了异常改变,这些差异改变可能与卵巢癌细胞的耐药机制有关.【期刊名称】《南京工业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(038)001【总页数】6页(P111-116)【关键词】卵巢癌;紫杉醇;耐药蛋白;代谢组学【作者】崔广波;刘晓昕【作者单位】南京工业大学药学院,江苏南京210009;南京工业大学药学院,江苏南京210009【正文语种】中文【中图分类】R979.1卵巢癌是现今女性生殖器官常见恶性肿瘤之一,其发病率虽次于子宫颈癌和子宫体癌,死亡率却高居各类妇科肿瘤的首位,对妇女生命健康造成严重威胁[1]。
目前,卵巢癌的规范性治疗一般是肿瘤细胞减灭术并辅以术后化疗。
紫杉醇是20世纪90年代问世的抗微管类抗癌药,是目前临床治疗卵巢癌中最常用的化疗药之一[2]。
但不幸的是,超过80%的病人会因为肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药性而使得化疗失败,肿瘤复发[3]。
因此,研究肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药的发生机制,对临床探索预防和逆转卵巢癌耐药性,具有十分重要的意义。
近年来,随着系统生物学的飞速发展,生物标志物的识别在癌症研究中发挥着重要作用[4]。
已有报道显示,代谢组学在卵巢癌生物标志物研究方面有重要作用,通过代谢物谱分析得到的相关标志物是肿瘤分型、诊断、治疗的基础[5]。
借此,笔者采用代谢组学的方法研究卵巢癌多药耐药机制,希望能为研究人员进一步揭示卵巢癌的耐药机制提供新的理论依据。
本研究采用气相色谱-质谱(GC-MS)的代谢组学方法对人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol和人卵巢癌敏感细胞株A2780的代谢产物进行定性和定量分析,以期从整体、多靶点等层面,深入阐释卵巢癌细胞的紫杉醇耐药作用机制,为卵巢癌多药耐药的研究提供新的思路。
1.1 试剂与药品Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640)培养基，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Hyclone公司；P-糖蛋白(P-gp)抗体，英国Abcam公司；多药耐药相关蛋白(MRP1)抗体，美国Santa Cruz公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、肺耐药蛋白(LRP)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)化学发光底物液，美国Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量分析试剂盒，美国Thermo Scientific公司。
紫杉醇(99.6%),中国药品生物制品检定所；四甲基偶氮唑盐(MTT),合肥Biosharp生物科技有限公司；1,2-13C2肉蔻豆酸、肉豆蔻酸甲酯、二甲基亚砜(DMSO)、甲氧胺、吡啶(纯度≥99.8%)、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)，美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、正庚烷，德国Merck公司。
1.2 主要仪器多功能酶标仪，美国BioTek公司；CO2培养箱，美国Nuair公司；普通倒置显微镜，日本Nikon公司；水平电泳槽，美国BIO-RAD公司；5975C质谱仪(MS)、7890A型色谱仪(GC),美国安捷伦科技公司；SPD2010型真空浓缩仪，美国Thermo公司；5810R型冷冻离心机，德国Eppendorf公司。
1.3 实验方法1.3.1 细胞株培养方法人卵巢癌细胞敏感株A2780(武汉普诺赛生命科技有限公司),在RPMI-1640培养基中(含10%的胎牛血清和1%的双抗)生长,置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养,实验时取处于对数生长期的细胞。
1.3.2 耐药细胞株的建立本实验采用紫杉醇浓度梯度递增法来逐步诱导建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞。
取处于对数生长期的人卵巢癌细胞株A2780,初始诱导浓度为0.001 μg/mL的含紫衫醇培养基,观察培养,待细胞生长状态趋于稳定后,逐步增加紫杉醇浓度,如此反复,历时约8个月,最终获得可以在含0.1 μg/mL的培养基中稳定生长的细胞株,命名为A2780/Taxol。
将细胞冻存3个月后复苏,在不含紫杉醇的培养基中培养多代,仍基本保持原来的耐药性。
1.3.3 细胞形态学观察取处于正常生长状态下的细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态。
1.3.4 细胞生长曲线绘制取生长良好的A2780和A2780/Taxol细胞,以每孔1 mL、浓度为3×104个/mL 的细胞接种于24孔培养板中,于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱里培养。
次日起,每天计数3孔细胞,连续7 d,根据计数结果绘制细胞生长曲线,按Patterson公式计算群体倍增时间[6]。
1.3.5 耐药指数检测取对数生长期的A2780和A2780/Taxol细胞,以每孔100 μL、浓度为8×103个/mL的细胞接种于96孔培养板,次日细胞贴壁后,弃培养基,每孔加入含有10倍浓度梯度的紫杉醇药物的培养基100 μL,每一浓度的紫杉醇各设5个复孔,同时设空白对照组。
培养48 h后,药物敏感(MTT)实验法检测计算细胞存活率(实验孔吸光度(OD值)/对照组OD值×100%),绘制浓度-生存曲线,计算半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(RI)。
1.3.6 Western blotting技术检测离心收集A2780细胞和A2780/Taxol细胞,加入适量裂解液,每1 mL裂解液加10 μL蛋白酶抑制剂,冰上放置30 min,每隔10 min震荡1次。
4 ℃,16 000 r/min离心20 min取上清液,BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。
取80 μg蛋白样品用蛋白上样缓冲液按比例稀释后,100 ℃煮沸5 min。
将制好的样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜,5%的脱脂奶粉封闭2 h,三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(TBST)洗膜3次,用MRP1、P-gp、LRP、GAPDH抗体分别在4 ℃孵育膜过夜,TBST洗膜3次,室温孵育二抗2 h,TBST洗膜3次,用HRP化学发光底物液曝光显影,Chemi Analysis软件扫描灰度值并分析结果。
1.3.7 细胞样品处理取对数生长期细胞,用磷酸缓冲液(PBS)清洗3遍,液N2猝灭。
每皿加1 mL甲醇-水(体积比为4∶1)溶液,将细胞刮刀刮下的细胞置于离心管中,在液N2、37 ℃水浴中反复冻融3次。
取50 μL细胞混悬液置于1.5 mL离心管,加入200 μL含内标1,2-13C2肉蔻豆酸(12.5 μg/mL)的甲醇,进行蛋白沉淀,涡旋震荡3 min,在4 ℃、16 000 r/min下离心10 min。
离心结束后取上清液180 μL真空干燥,加入40 μL 甲氧胺吡啶(10 mg/mL)溶液混匀,室温放置16 h后加30 μL衍生化试剂V(MSTFA)∶V(TMCS)=100∶1,衍生化反应结束后加入用庚烷溶解的外标肉豆蔻酸甲酯(30 μg/mL)30 μL,混匀取80 μL上清液置于微量进样管,供GC-MS分析。
1.3.8 GC-MS分析条件HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),不分流进样,进样量2 μL,载气为He,载气流速1.0 mL/min。
进样口温度250 ℃,接口温度250 ℃,离子源温度230 ℃。
程序升温:初始温度70 ℃,维持2 min,然后以20 ℃/min速率升温,至310 ℃,维持5 min。
电离电压70 eV,扫描方式为全扫描(m/z=50～600),溶剂延迟时间为4.5 min。
1.3.9 GC-MS数据采集和处理所有GC-MS原始数据采用GC/MSD化学工作站软件(安捷伦科技(上海)有限公司)进行色谱数据处理,自动检测积分的峰宽和质谱解卷积均设置在2 s,信噪比不低于30。
得到的纯物质质谱在NIST library 2.0 (2008)标准质谱库中进行检索与匹配,进行物质结构定性。
将各个代谢物的色谱峰面积与内标峰面积的比值作为数据矩阵导入SIMCA-P 11.5软件(瑞典Umetrics AB公司)进行多元统计分析[7]。
结果用±s表示，其中为均值，s为方差。
数据均采用SPSS 16.0软件进行统计分析,2组间差异比较采用独立样本t检验(P<0.05具有显著性差异)。
3.1 细胞形态图1为A2780和A2780/Taxol细胞形态光学显微镜观察照片。
由图1可见:A2780细胞边界清晰,多为多角形,形态扁平,较为规整;A2780/Taxol细胞较亲代细胞边界不清,细胞异形明显,呈不规则形,部分细胞变形。
3.2 细胞生长曲线以培养时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线,结果见图2。
由图2可知:2种细胞均在6～7 d后达到生长峰值。
A2780细胞和A2780/Taxol细胞的群体倍增时间分别为(40.3±0.38)和(49.7±0.42) h,耐药细胞生长增值减慢,倍增时间明显延长(P<0.01)。
3.3 耐药指数测定结果MTT实验法测定结果显示,紫杉醇对A2780和A2780/Taxol细胞的半数抑制浓度分别为(0.012±0.001 3)和(1±0.025)μg/mL,A2780/Taxol对紫杉醇具有显著耐药性,RI达83.3,属于高度耐药。
A2780/Taxol细胞冻存3个月后,在不含紫杉醇的培养基中培养多代后,其对紫杉醇的RI达79.23,仍基本保持原有的耐药性,耐药性稳定。
3.4 Western blotting分析结果Western blotting结果见图3。
A2780/Taxol细胞相比于A2780细胞,P-gp、MRP1、LRP蛋白表达量均显著性提高(图4)。
3.5 GC-MS分析图5为典型GC-MS检测分析A2780/Taxol细胞的总离子流色谱图(图5标出了响应较高的一些代谢物),内标和外标的相对标准偏差(RSD)分别为7.2%和6.5%,偏差均小于15%,满足代谢组学生物样品分析实验要求。
