真菌漆酶的研究进展及其应用前景周雪婷,张跃华＊,罗志文,潘亭如,缪天琳(佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007)摘 要:漆酶生产菌株多为白腐真菌,常用的漆酶活性测定方法有分光光度法、ABTS 法、微量热法等,其降解工业“三废”中的有毒有害物质被认为是一种效率较高,成本较低的且最有前途的方法,其对环境保护的研究以逐渐成为国内外研究的热点,本文阐述漆酶的性质、活性中心、结构特点以及其在环境治理方面的应用。
关键词:漆酶;结构;活性中心;环境修复 中图分类号:X592文献标识码:A 基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助(项目编号:12521573) ＊为本文通讯作者 漆酶最早由Yoshi 从日本紫胶漆树(Rhus vernicifera )漆液中发现。
19世纪末,G .Betranel 首次将能够使生漆固化的活性物质进行分离,命名为“Laccuse ”,即漆酶。
漆酶属蓝色多铜氧化酶家族[1,2],与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆中铜蛋白同源。
人们将自然界中得到的漆酶分为漆树漆酶和真菌漆酶,其中真菌漆酶极具研究价值。
漆酶在生物制浆、污水处理、防腐剂、杀虫剂等化工产品的降解效果显著,用于环境保护、环境监测等领域,在食品工业等方面也有应用[3],已逐渐成为自然科学的研究热点之一。
漆酶催化氧化不同种类型的底物已达200余种,广泛用于食品、废水处理、造纸等领域。
国内外真菌漆酶研究主要是以担子菌、子囊菌、脉孢霉、柄孢壳菌和曲霉等真菌来研究漆酶的生物学活性,细菌和放线菌的研究较少,现已在细菌生脂固氮螺菌(Azospirillum lipofer -um )中发现了漆酶的存在。
而高等担子菌中的研究对象包括白腐真菌、杂色云芝、平菇、变色栓菌,其中白腐真菌所产的漆酶为胞外酶,可作为主要的产酶者和研究对象。
1 漆酶的性质1.1 理化性质漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,不同来源的漆酶铜含量也有所不同,多含有4个铜原子[4]。
漆酶多为1条多肽链组成的单聚体,由500～550个氨基酸分子所组成,相对分子质量主要集中在50～80kD ,其碳水化合物约占15%～20%,等电点pI 为3～6,反应温度为30～60℃,pH 低的环境,漆酶的生物活性较高[5-7]。
1.2 活性中心漆酶催化中心根据其光谱性质,存在3种不同的功能:1.2.1 Ⅰ型铜含铜的蓝色蛋白质,Ⅰ型铜与2个组氨酸和1个半胱氨酸配位,紫外可见光谱λ=600nm 时出现峰值,在EPR (电子顺磁共振)谱上有1个平行超精细耦合结构,Ⅰ型铜参与分子内的电子传递,将电子从底物传递到其它铜原子上。
1.2.2 Ⅱ型铜II 型铜与2个组氨酸和1个水分子配位,形成T 型几何结构,没有明显的可见吸收光谱,但有EPR (电子顺磁共振)信号。
1.2.3 Ⅲ型铜与漆酶的催化作用密切相关,经实验研究其为活性中心,由2个铜原子通过1个-OH 桥配位连接起来组成四面扭曲的四方立体双核铜区结构,铜原子之间具有抗磁性,其距离是0.38n m 。
在紫外可见光谱λ=330nm 处有最大吸收峰,在EPR 上无谱带[8～14];为了测定漆酶活性中心,将其经过抑制剂处理后,Ⅲ型铜在EPR 上出现有裂分峰,表明外源性配体与Ⅲ型铜发生了配位,1个Ⅱ型铜和2个Ⅲ型铜形成三核铜簇,双氧还原的反应位置在三核铜簇,此时Ⅲ型铜已结合5个配体,使其氧化性降低,限制了还原,同时也抑制O 进入三核中心区。
另有实验表明,将漆酶晶型结构被完全还原,Ⅰ和Ⅱ型铜的配位环境不变,Ⅲ型铜的-OH 桥配体则在反应中消耗,2个Ⅲ型铜之间距离亦增加[15]。
1.3 检测方法检测漆酶活性方法有分光光度法[16]、ABTS 法、微量热法、测O 2法、高效液相色谱法[17]、极谱法[18]等。
AB TS 法测定漆酶,常用醋酸钠溶液作为缓冲溶液,反应体系内ABTS 的浓度为0.5mmol /L 。
漆酶对不同种底物的亲和力也有显著地差异,但其对ABTS 的亲和力和催化能力普遍很高,测得的酶活性值也高,此方法反应条件不高,使用安全,常温下性质稳定,测定的OD 值相对稳定而准确[19]。
微量热法测定漆酶的活性,利用LKB -2107Batch 型微量热系统,将其温度调至298K ,pH 调至7.4,此方法漆酶的提取物样品用量较少,可直接对酶的悬浮液进行测定,其对反应体系没有任何限制或干扰,适合研究酶促反应中的酶活。
分光光度法测定漆酶酶活的基本原理是选定某种漆酶作用的底物,底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基,底物自由基浓度与吸光值成正相关,其在一定的光波波长下存在吸光系数的最大值,依据吸光值随时间变化的关系计算出酶活。
分光光度法因其操作简单、快速、较准确、无需配备昂贵仪器设备等特点,得以在漆酶测定实验中广泛应用[20]。
2 漆酶的应用2.1 工业污水治理真菌降解木质素目前主要集中于生物制浆方面。
传统的氯法漂白,在去除纤维原料中木质素的过程中,仍有3%～12%的残留。
在漂白废水中会产生大量有毒、有害物质,严重污染农业与技术 第32卷 第9期 2012年9月2 AG RIC ULTURE AND LTECHNOLOG Y环境,而且纸浆中残留的木质素会造成纸张质量下降。
与化学漂白相比,生物制浆利用真菌脱木素的原理能够高效的提高纸浆中残留木质素的降解率,其卡伯值降低了19%,且漂白的纸张不易返黄,漂白后纸浆的白度可达到52.4%ISO,其物理性质也有所改善,裂断长和撕裂指数分别提高了20%和13%。
在技术推广方面,少量改进设备和工艺即可实现。
用固定化漆酶的方法处理纸厂废水,真菌漆酶能降解色素和木质素类物质[21～24],对去除废水中的木质素及其衍生物、单宁和酚醛化合物等有毒物也有良好效果[25],有助于造纸业最终实现清洁生产;在实际应用方面,白腐真菌的产物漆酶等木质素降解酶类可用于治理污水,制成生物反应器,用于降解工业染料。
白腐真菌学应用于工业染料废水的脱色,单独用漆酶对桉木硫酸盐浆CE H漂白废水进行脱色,脱色率为24%左右,可以脱其中40%以上的有机氯化物等有毒物质[26～28]。
将培养液中粗抽提液进行了分析,表明只有漆酶活力和染料的脱色效果呈正相关,说明漆酶在其中起到重要的作用。
2.2 环境激素降解2.2.1 对致癌多环芳香族化合物(PAHs)的降解生产生活中产生的PAHs,由于生物难降解性以及高度亲脂性导致在环境中高度富集,然而漆酶对PAHs类化合物降解效果是相当可观的,如粗酶液对苯并[a]芘和二苯并[a,h]蒽的降解率分别达80%和30.2%。
白腐真菌分泌的漆酶和过氧化酶经过加工纯化后可氧化大多数种类的PAHs,如作用于硝基苯和蒽醌混合物,12～24d后去除率将不小于90%。
对于漆酶氧化相对分子质量较大的PAHs类物质,采用的方法是间接氧化反应,即底物与酶不直接接触,而通过酶介体系统(L MS)来实现的,通常最常用的介体是ABTS和HBT,使降解效果明显提高,提高比率与介体浓度呈正比。
在无介体存在的情况下,用纯漆酶的处理72h后,苊,蒽被氧化35%和18%,而二氢苊、荧蒽、芘、苯并a蒽、屈、苯并b荧蒽及苯并k荧蒽的氧化率仅为10%[29]。
2.2.2 降解苯酚在工业“三废”、化学农药中多含有毒物酚或芳胺,实验证明真菌产生的漆酶能够有效降解石油精炼厂废水中的邻苯二酚、甲基-邻苯二酚、羟基脲等污染物。
漆酶对苯酚类混合物的去除速率与污染物化学结构的复杂性有直接的关系[30]。
2.2.3 污染物的降解氯酚类有机化合物是重要的工业原料,用于生产染料、防腐剂、杀虫剂等化工产品。
漆酶能氧化蒽和致癌物质苯并芘,在降解相对分子质量较大的氯酚及其衍生物时,运用介体ABTS可明显增强这种作用,蒽被氧化的终产物为蒽醌[31]。
另外漆酶对氯酚及其衍生物的转化能力与芳环上氯的取代位置和数量有关,其邻位和对位的氯酚较易去除。
2.3 生物传感器生物传感器的特点就是定性定量测量被分析物质。
在生物检测方面,运用纤维素固定漆酶,可检测茶叶加工过程中茶酚的变化情况,每个酶元件可作500次以上检测,在常温下可保存2个月。
生物传感器还可以用于检测来自煤炭、石油、天然气、造纸等工业污水中的木素、酚类等物质;在选择性检测方面,在短时间内就可以迅速检测和辨别吗啡,且非常灵敏,其原理为以漆酶为基础,将葡萄糖脱氢酶固定在Clark氧电极上,漆酶通过消耗氧气可以氧化吗啡,产生葡萄糖脱氢酶,但不能氧化可卡因,因此可选择性检测吗啡[32]。
在环境监测方面,以邻苯二酚为检测目标,研究了一种基于磁性纳米粒子固定漆酶的邻苯二酚生物传感器制备方法及其在城市生活垃圾堆肥中的应用,制备Fe3O4磁性纳米颗粒,将其转化为戊二醛将漆酶共价固定,借助磁场吸附在磁性电极上,检测垃圾堆肥中的邻二苯酚[34]。
漆酶作为生物传感器的特点是专一性强、速度快、可连续操作、简便、测定结果直观并有数据记录储存,需要不断对漆酶的生理性质做更深入研究。
3 应用前景真菌漆酶的作用底物广泛,可增加饮料的稳定性,又参与降解木质素,与有毒的酚类物质、苯氧基类除草剂、石油工业废水作用而降解毒性,在食品工业、环境保护等方面得到广泛的研究与应用。
漆酶的研究有很多问题函待解决,如影响漆酶的分子结构、作用机理及其相应微生物分泌漆酶等方面的研究,如何保持或延长漆酶活性等方面;国内外学者还在不断开发和完善漆酶在各领域中的应用。
鉴于大多数微生物分泌漆酶的量仍然非常有限,而漆酶应用越来越广泛的情况,研究如何增加真菌漆酶的产量,利用发酵条件较易实现,生产周期较短且酶活性保持较稳定的漆酶会更有现实价值;而白腐菌以其作为最主要的分泌漆酶的产生者,将会得到更多的关注与更深层次的研究。
参考文献[1]王光辉,季立才.中国漆树漆酶的底物专一性[J].武汉大学学报(化学专刊),1989:65.[2]Nina H,Laura-Leena K,et al.Crys tal structure of a l accase fromMel anocarpus albomyces with an intact trinucl ear coper site[J].Nat Struct Biol,2002,9(08):601-605.[3]雷福厚,蓝虹云.漆树漆酶和真菌漆酶的异同研究[J].中国生漆,2003,(01):4-8.[4]李慧蓉.白腐真菌生物学和生物技术[M].北京:化学工业出版社,2005.[5]Harald ccases:s truct ure.reactions,distrihution[J].Micron,2004(35):93-96.[6]张丽.白腐真菌产漆酶对染料废水降解的研究[D].南京理工大学,2004.[7]张敏,肖亚中,龚为民.真菌漆酶的结构与功能[J].生物学杂志,2003,5(20):6-8.[8]Gimifreda L,X u F,Bollag ccases:a useful group of oxido re-ductive enz ymes[J].Bioremediation Journal,1999(03):1-25. [9]X u F,Kul ys J J,D uke K.Redox Che mistry in Laccase-Catalyzed Oxida-tion of N-Hydroxy Compounds[J].Appl Environ M icrohiol,2000(66): 2052-2056.[10]堵国成,赵政,陈坚.真菌漆酶的酶活测定及其在织物染料生物脱色中的应用[J].江南大学学报(自然科学版),2003,1(02): 83-90.[11]缪静,姜竹茂.漆酶的最新研究进展[J].烟台师范学院学报(自然科学版),2001,2(17):146-150.[12]刘尚旭,赖寒.木质素降解酶的分子生物学研究进展[J].重庆教育学院学报,2001,14(14):64-67.[13]何为,詹怀宇,王习文,伍红.一种改进的漆酶酶活检测方法[J].华南理工大学学报(自然科学版),2003,12(31):46-50.[14]季立才,胡培植.漆酶结构,功能及应用[J].氨基酸和生物资源,1996(18):25-29.[15]侯红漫.白腐菌Pleurotus os treatus漆酶及对蒽醌染料和碱木素脱色的研究[D].大连理工大学,2004.[16]Huang Z Y,Huang H P,CaiR X,et anic solvent enhanced spec-trofluorin etric method for determition of laccase activity[J].Analytica Chinica Acta,1998,374(01):99-103.真菌漆酶的研究进展及其应用前景 周雪婷 张跃华 罗志文 潘亭如AG RIC ULTURE AND LTECHNOLOG Y3[17]Badiani M,Fel ici M,Luna M,et ccase ass ay by means of high-perfomance liquid chromatography[J].Anal Bioch,1983,133(02): 275-276.[18]Wood D.A.Production,Purification and Properties of Extracelluar l ac-case of Agaricus bisporus[J].Soc Gen Microbiol,1980(17):327-338.[19]林俊芳,刘志明,陈晓阳等.真菌漆酶的酶活测定方法评价[J].生物加工过程,2009,7(04):8.[20]望天志,李卫莲,万洪文.微量热法测定漆酶的活性[J].自然杂志,1997,19(06):361.[21]Kirk T K,Farrell R L.Enz ymatic“combus tion”:The microbial degrada-tion of lignin[J].Annu R ev Microbiol,1987,41(10):465-505. [22]张爱萍,秦梦华,徐清华.漆酶在制浆造纸中的应用研究进展[J].中国造纸学报,2004,19(02):114.[23]Reid I D,Biological pul ping in paper manufacture[J].Trends Biotech-nol,1991,9(08):262-265.[24]Bergbauer M,Eggert C,Kraepelin G.Degradati on of c hlorinated l ignincompounds in a bleach plant effl uent by the white-rot fungus Trametes Ver-s ic olor[J].App Environ Microbiol,1991(35):105-109.[25]林建城等.酶在食品工业,轻工业和环境保护上的应用分析[J].莆田学院学报,2005,12(02):17-20.[26]林鹿,陈嘉翔,等.白腐菌对纸浆CEH漂白废水的脱色、消除毒性和芳香化合物的降解[J].中国造纸学报,1996(11):69-70.[27]E R odriguez,MA.Pickard,R Vazquez-Duhalt.Indus tial dye decol-orization by laccases from ligninolytic fungi[J].Current Microbiology,1999(38):27-32.[28]Bollag J M,Myers C.Detoxi fication of aquatic and terrestrial sites throughbinding of poll utants to humic substances[J].Sci Total Environ,1992 (117-118):357-366.[29]Majchercz y A,et al.Oxidation of pl oycycl ic aromatic hydrocarbons(PAH)by l accase of Trametes versicolor[J].Enzyme and Microbial Tec hnology, 1998(22).[30]刘涛,曹瑞饪.漆酶在环境保护领域中的研究及应用进展[J].云南环境科学,2005(03):12-14.[31]Coll ins P J,Kotterman M J J,Fiel d J A,Dobs on A.Oxidation of An-thracene and Benzo[a]pyrene by Laccase from Trametes vers icolor[J].Appl Environ Microbiol,1996,62(12):4563-4567.[32]Ghindilis A L,Gavrilova V P,Y aropolov ccas e-based bios ensorfor determination of polyphenols:determination of catechols in tea[J].Biosens Bioelectron,1992,7(02):127-131.[33]Bauer C G,Kuehn A,Gajovic N,Skorobogatko O,Hol t P J,Bruce NC,et al.New enz yme sensors for morphine and c odeine based on morphine dehydrogenas e and laccas e[J].Fresenius J Anal Chem,1999(364):179 -183.作者简介:周雪婷(1992-),女,学士,研究方向:应用微生物。
