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嗜酸乳杆菌的检测1、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。
1.1恒温厌氧培养箱：37℃士1℃。
1.2冰箱：2℃～5℃。
1.3天平：感量为0.1g。
1.4均质器及无菌均质袋、均质杯。
1.5振荡器。
1.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
1.7无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。
1.8无菌培养皿：直径90mm。
1.9显微镜：10倍～100倍。
1.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2、培养基和试剂2.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基2.1.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏10.0g 酵母浸膏5.0g 葡萄糖20.0g吐温-80 1.0g 柠檬酸铵2.0g 乙酸钠5.0g 硫酸镁0.1g硫酸锰0.05g 磷酸氢二钾2.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL2.1.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH 至7.3±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。
2.2 MRS肉汤培养基2.2.1 MRS肉汤培养基成分蛋白胨10.0g 牛肉膏10.0g 酵母浸膏5.0g 葡萄糖20.0g吐温-80 1.0g 柠檬酸铵2.0g 乙酸钠5.0g 硫酸镁0.1g硫酸锰0.05g 磷酸氢二钾2.0g 蒸馏水1000mL2.2.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，补足蒸馏水至1000mL，于25℃时调节pH 至7.3±0.2，分装于适宜容器中，121℃灭菌30min。
2.3无菌生理盐水2.3.1成分氯化钠8.5g 蒸馏水1000mL2.3.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2.4 革兰氏染色2.4.1结晶紫染色液2.4.1.1 成分结晶紫1g 95%乙醇20 mL 1%草酸铵水溶液80 mL2.4.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
果汁中的嗜酸耐热菌李静媛(国家食品质量监督检验中心,北京,100027)摘 要 嗜酸耐热菌可污染浓缩果汁和果汁饮料,本文对该菌的来源、生长特点、危害、耐热性进行了分析,阐述了嗜酸耐热菌的分离计数方法,并提出了防止其污染的措施。
关键词 果汁,嗜酸耐热菌,特点,分离和计数,控制作者:学士,高级工程师。
收稿时间:2002-12-16目前,我国的果汁生产行业发展迅速,浓缩苹果汁大量出口。
随着生活水平的提高,体现天然、营养的纯果汁及果汁饮料受到人们青睐。
果汁中的一种新型污染菌)))脂环嗜酸耐热菌在国外屡有报道,该菌污染苹果汁,橙汁等浓缩果汁及果汁饮料,产生不良风味,使企业蒙受经济损失。
由于国际市场对浓缩果汁的质量要求越来越高,耐热菌的指标亦有严格规定,致使我国果汁出口受到影响。
因此,了解这一菌属的特点,建立相应的检测方法,有效的控制其含量成为当务之急。
1 嗜酸耐热菌的来源脂环嗜酸耐热菌是耐热芽孢菌,可经受巴氏灭菌,能在pH 值低于410的环境中存活。
果汁为酸性产品,加热灭菌可杀死不耐热的微生物,还可抑制果胶酯酶的活性。
普遍认为,造成果汁腐败的微生物有耐热霉菌孢子,酵母菌和耐热乳酸菌。
一般细菌,在果汁的加热和杀菌中被杀死,某些耐热芽孢,如芽孢杆菌属(Ba cillus)及梭状芽孢杆菌属(Clostr idium)的耐热芽孢,可存在于巴氏杀菌后的果汁中,但大部分细菌芽孢在果汁的正常酸度下已不能生长繁殖。
因此在正常的果汁中可分离到芽孢杆菌,但不会造成产品腐败[1~2]。
1984年德国Cerny 等人从腐败的苹果汁中分离出一种芽孢杆菌,此菌种耐酸耐热,pH 315~410下萌芽生长良好,芽孢在苹果汁中的耐热性是D 90e 为15min,果汁若污染此菌,以目前杀菌条件,难以消除。
1981年,人们从花园、树木和沼泽的土壤中分离到相似的菌株[3]。
1992年,脂环酸杆菌属(Alic yc lobacillus)作为新的菌属被提出,酸土脂环酸杆菌(Alic ycloba cillus acidoter 2restris)是其中一种,为果汁污染的主要嗜酸耐热菌。
《浓缩果汁中嗜酸耐热菌和耐热霉菌的检测与研究》一、引言果汁产业近年来蓬勃发展，尤其在果汁浓缩液方面取得了显著成就。
由于浓缩果汁需要经历多道工序处理和长时间的储存，其中涉及的微生物问题成为了一个重要的研究课题。
嗜酸耐热菌和耐热霉菌是浓缩果汁中常见的微生物，它们不仅影响果汁的口感和品质，还可能对食品安全造成威胁。
因此，本文旨在研究浓缩果汁中嗜酸耐热菌和耐热霉菌的检测方法，并探讨其与果汁质量之间的关系。
二、研究方法（一）材料准备本实验采用多种品牌和类型的浓缩果汁作为样本。
实验试剂包括营养琼脂、肉汤等，用于微生物的分离培养和检测。
（二）样品处理将浓缩果汁样品进行适当的稀释，以减少微生物的浓度，便于后续的检测。
（三）嗜酸耐热菌和耐热霉菌的检测采用选择性培养基进行微生物的分离培养，通过观察菌落形态、颜色等特征进行初步鉴别。
随后进行分子生物学实验，通过PCR等技术进一步鉴定和验证结果。
三、结果分析（一）嗜酸耐热菌的检测结果通过对浓缩果汁样品的检测，我们发现不同品牌和类型的样品中嗜酸耐热菌的数量存在差异。
其中，某些品牌的浓缩果汁中嗜酸耐热菌的数量明显高于其他品牌。
这些菌株在酸性环境下具有较强的生存能力，且在高温条件下仍能保持一定的活性。
（二）耐热霉菌的检测结果在浓缩果汁中，我们也检测到了多种耐热霉菌。
这些霉菌在高温条件下仍能生长繁殖，对果汁的品质产生不良影响。
不同品牌和类型的样品中耐热霉菌的数量也存在差异，部分品牌的果汁中耐热霉菌数量较高。
（三）微生物与果汁质量的关系通过对嗜酸耐热菌和耐热霉菌的检测结果进行分析，我们发现这些微生物的数量与果汁的质量密切相关。
高浓度的微生物可能导致果汁口感变差、品质下降，甚至引发食品安全问题。
因此，控制浓缩果汁中微生物的数量是保证产品质量的关键。
四、讨论与建议（一）讨论本实验结果表明，浓缩果汁中存在一定数量的嗜酸耐热菌和耐热霉菌。
这些微生物对果汁的品质和食品安全构成潜在威胁。
因此，需要采取有效的措施来控制这些微生物的数量。
果汁中嗜酸耐热菌的特性控制与检测
常玉华;仇农学
【期刊名称】《农产品加工·学刊》
【年(卷),期】2011(000)011
【摘要】嗜酸耐热菌,即环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus spp.),能够经受果汁加工中的高温瞬时灭菌过程,并能在酸性果汁中生长,从而导致果汁风味的劣变和腐败.嗜酸耐热菌是果汁加工中的主要目标控制微生物,为果汁的主要安全性指标之一.系统阐述了果汁中嗜酸耐热菌的生长与耐热特性,危害与污染途径；并在此基础上,全面介绍和分析了嗜酸耐热菌的各种控制与检测方法.其中,非热灭菌技术对嗜酸耐热菌的控制,以及嗜酸耐热菌的特异性快速检测技术,是当前工业界和学术界共同关注的热点.
【总页数】5页(P77-81)
【作者】常玉华;仇农学
【作者单位】陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710062;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安710062
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
【相关文献】
1.浓缩果汁生产厂中嗜酸耐热菌的跟踪检测 [J], 姚培鑫;马小魁
2.基于HACCP的浓缩苹果汁生产中嗜酸耐热菌的监测与控制 [J], 王军堂;王周利;
岳田利
3.利用顶空SPME-GC-MS联用技术检测苹果汁中嗜酸耐热菌代谢产物的研究 [J], 杨康;岳田利;袁亚宏;丰凡
4.浓缩苹果汁中嗜酸耐热菌的分离及检测条件探讨 [J], 薛晚利;周玲;李选社;石兴民
5.果汁中嗜酸耐热菌的检测及控制 [J], 丁辰
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不可过滤的果汁TAB的检测方法一、培养基YSG琼脂培养基A部分：酵母提取物2.0g葡萄糖 1.0g可溶性淀粉 2.0g蒸馏水500ml用1N硫酸或氢氧化钠调节PH3.7.B部分: 琼脂15.0g蒸馏水500ml把A部分和B部分分别在121℃灭菌15分钟。
冷却至50度时混合，然后倒入培养皿中。
二、不可过滤果汁TAB检测步骤每一块消毒设备都用这种方法检测：在每个器具进行彻底清洗、干燥、消毒后进行抽样，尽可能在接近无菌条件下打开集装箱。
单糖度浓缩汁样品在分析之前先用蒸馏水稀释。
1.用糖度测量仪测样品含糖量。
2.康科特德葡萄调整糖度到1.1，蔬菜汁调整糖度到6。
3.如果样品的PH为4.0或更高，用柠檬酸调整样品的PH道4.0以下。
把250g稀释后的样品放入密封聚乙烯袋中在70±2℃水浴锅中杀菌20分钟。
4.立即把样品放到冰水浴锅中冷却10-20分钟，然后在35℃条件下培养5天。
移取0.1ml培养后的样品到YSG琼脂平板上。
5.玻璃棒用酒精浸泡后在酒精灯火焰上灼烧后接种散布在整个琼脂表面的菌。
在一个密闭的胶袋中（保持水分）50℃培养3天。
数出在琼脂平板上形成的菌落数。
6.记录下水浴温度回到70±2℃的时间，大约需要5-10分钟。
7.至少做两个稀释度。
三、解释如果两个平板上都观察不到菌落，就记录样品的TAB-“Negative”当存在的菌落被确认为TAB菌落，就记录平板上数出的菌落平均值。
单位;每克浓缩汁的CFU.继续测试酸土环脂芽孢杆菌的构造。
四、酸土环脂芽孢杆菌构造的测试见附件！。
耐酸耐热菌的测定(企业内控法)(总4页)页内文档均可自由编辑，此页仅为封面耐酸耐热菌的测定（企业内控法）1、适用范围本方法仅适用于浓缩苹果清汁中耐酸耐热菌的测定。
2、设备和材料2．1、广口三角瓶，250mL、1000mL。
2．2水浴箱：80℃水浴。
2．3、冰箱。
2．4、量筒：50mL。
2．5、灭菌镊子。
2．6、酒精灯。
2．7、培养箱： 50±1℃。
2．8、玻璃铅笔。
2．9、溶剂过滤器。
2. 10、µm滤膜：Ø50mm。
2．11、真空泵。
2．12、温度计。
2．13、培养皿。
2．14、高压蒸汽灭菌锅。
3、培养基和试剂3．1、K氏培养基3．1．1、组成A：酵母浸膏 1.25g蛋白胨 2.50g葡萄糖 0.5g琼脂 7.5g吐温80将上述各种试剂放入1L的三角瓶中,加入500mL的蒸馏水,在电炉上加热溶解后,在121℃高压灭菌20分钟。
3．1．2、组成B：苹果酸 1.25g将苹果酸用10mL的蒸馏水溶解,通过一次性无菌注射器和针头式过滤器连接,将苹果酸溶液过滤到已灭菌的培养基中,混匀。
3．1．3、平板制作当已酸化的K氏培养基温度降至50℃左右时，将其分装倒入已灭菌的培养皿中，待培养基凝固后，用牛皮纸包扎好，放入冰箱中保存，一般可保存60天。
3．2、蒸馏水。
4、检验程序：检样适当稀释80℃水浴13分钟无菌水膜过滤检样膜过滤膜放入平板培养基培养50±1℃ 4天菌落计数报告5、操作步骤5．1、将装有150mL蒸馏水的三角瓶、µm的滤膜、50mL量筒、过滤装置于121℃灭菌15min。
5．2、用已灭菌的50mL量筒取待检浓缩果汁50mL，加入已灭菌的盛有150mL灭菌蒸馏水的三角瓶中，混匀。
5．3将稀释的样品放入80℃的水浴中，同时放置一个带有温度计的控制样，做为温度控制。
观察温度计，待温度升至80℃时开始计时，维持13min，将样品取出并迅速用自来水冷却。
5．4、用已灭菌的µm的滤膜及真空抽滤装置过滤热处理后的果汁,移取抽滤装置的上部,将镊子在酒精灯上灭菌后,用镊子将滤膜移置于预先准备好的K氏培养基上,轻敲滤膜几次,使其与滤膜充分接触。
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2012.8.23 DL-WI-LD-003 03 1of 4
1、目的Purpose:
本文件规定了微生物检测的方法.
2、适用范围Scope:
适应于果汁和果汁浓缩液、水等的微生物的检验。
3、职责Responsibility
1）微生物检验员按各产品规格书和检验方法的要求执行日常的检验工作；
2质量部经理负责日常检验工作的督导。
4.程序Procedure:
4.28 嗜酸耐热菌的测定方法.
4.28.1定量分析-涂布法（适用于浊汁类）
4.28.1.1 无菌吸取10ml样品加入90ml无菌水中。
4.28.1.2 放进80±1℃水浴锅里热激活样品10分钟。
4.28.1.3 冰水浴冷却样品至40℃～45℃
4.28.1.4 用无菌吸管吸取1ml样品分别移入2个做好的YSG或BAT平板
表面。
4.28.1.5用无菌涂布棒将样液在平板上涂抹均匀
4.28.1.6 将涂抹好的平板平放于桌上20—30min。
4.28.1.7 如果菌液不能很好地渗透入培养基里，则将平板平放在45℃培养
箱里培养一天，再倒过来放进塑料自封袋中。
4.28.1.8 放在45℃±1℃的培养箱中培养至少5天
4.28.1.9 观察并报告。
1）读取平板上的菌落数，结果以：菌落数*10/ml表示；
2）若平板没有任何菌落形成，记成：<10 cfu/ml.
4.28.2定量分析—膜片分析法（适用于清汁类）
4.28.2.1无菌吸取10ml样品加入装有50ml无菌水的灭菌瓶里。
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4.28.2.2 放在80±1℃水浴锅里热激活样品10分钟。
4.28.2.3 冰水浴冷却样品至40℃～45℃
4.28.2.4 组装已灭菌的抽滤装置，安上0.45微米的滤片，打开真空泵，将
灭菌瓶里的样液进行抽滤，再用30ml无菌水冲洗，取出滤片，
平放在做好的YSG或者BAT-平板上。
4.28.2.5 将平板倒着，放进塑料自封袋中，45℃±1℃的培养箱中培养至
少5天。
4.28.2.6 观察并报告。
1）读取平板上的菌落数，结果以：菌落数*/10ml表示；
2）若平板没有任何菌落形成，记成：<1 cfu/10ml.
4.28.3定性检测（适用于一切果汁）
4.28.3.1无菌吸取浓缩果汁10ml加入90ml BAT-Bouillon；RTD(糖度小于
15白利度的果汁，无菌吸取50ml加入50ml BAT-Bouillon (Doehler
2.04717.782)。
4.28.3.2 放在80±1℃水浴锅里热激活样品10分钟
4.28.3.3冰水浴冷却样品至40℃～45℃
4.28.3.4 放进45℃±1℃的培养箱中培养至少3天
4.28.3.5 然后用接种环吸取足够量的培养后的样品，在做好BAT平板中
划线；同时接种足够量的培养后的样品，在做好的PCA平板上
划线。
4.28.3.6 将划好线的BAT和PCA平板放在塑料自封袋中，倒放入45℃±
1℃的培养箱中培养至少5天
4.28.3.7观察并报告。
1）若PCA划线有菌落生长，则不管BAT板上划线有无菌落生长，
都判断无嗜酸耐热菌。
2）若PCA划线无菌落生长，而BAT板上划线有菌落生长，则判断有嗜酸耐热菌，并须做愈创木酚实验。
.
4.28.4 愈创木酚实验：
如果YSG/BAT琼脂平板上有菌落生长须做愈创木酚实验：
4.28.4.1愈创木酚测试盒（试剂盒存放于黑暗干燥处）
1)40个培养管（2mL 诱发培养液）
2)溶液1：50mL 缓冲液，pH 4.0
3)溶液2：900uL H2O2溶液（蓝色瓶盖）
4)溶液3：酶试剂（褐色小瓶褐色盖）。
在第一次使用前用900uL 蒸馏水均
匀溶解。
酶制剂制备后应当储存在2-8°C且在3-4个月必须用完。
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5)溶液4:2份愈创木酚标样（黄色瓶盖，1050ppm 愈创木酚）
4.28.4.2. 测试
4.28.4.2.1 样品：
1)将足够量的被检菌落用灭菌接种环接种到BAT-诱发培养液中，45±
1°C培养24小时。
2)将1mL 溶液1加入到培养管中，摇匀。
3)加入20uL 溶液2
4)加入20uL 溶液3(稀释后的)。
5)摇匀培养管中的溶液，室温下放置5-10分钟。
4.28.4.2.2阴性空白试验步骤同8.6.2.1，但不接种菌落。
4.28.4.2.3 阳性空白试验：
1)加入40uL 溶液4 到BAT-诱发培养液中。
2)加入1mL 溶液1
3)加入20uL 溶液2。
4)加入20uL 溶液3。
摇匀培养管中的溶液，室温下放置5-10分钟。
观察培养管内对照溶液颜色的变化。
4.28.4.3 分析:
4.28.4.3.1 如果样品颜色变化显著且褐色色泽深于阴性空白，表明检测到
饮料中有致败的嗜酸耐热菌，其产生使饮料变异味的物质（愈创木
酚）的风险很大。
4.28.4.3.2 如果培养管和阴性空白的颜色变化相同，则表明饮料中没有致
败嗜热耐酸菌存在或产生异味物质的风险很低。
4.28.4.3.3 如果颜色变化不明显，则建议增加培养时间到24小时。
附：愈创木酚测试颜色变化:
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2012.8.23 DL-WI-LD-003 03 4of 4 1, negative control阴性
2, positive control (guaiiacol)阳性
3, A. acidiphilus嗜酸乳杆菌
4, A. acidoterrestris酸土脂环酸杆菌
5, Alicyclobacillus sp.脂环酸芽孢杆菌
1 2 3 4 5。
