乳酸细菌分类鉴定及实验方法

取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。

纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。

用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。

１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。

１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。

以空白培养基为对照，扣除背景干扰。

’１．２。

６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。

１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。

乳酸菌抑菌鉴定研究乳酸菌是一类在发酵食品中常见的细菌，它们以乳酸为代谢产物进行糖的发酵，具有很高的抑菌活性，能够抑制一些致病菌的生长。

乳酸菌的抑菌活性与其菌种的多样性、代谢产物的组成和浓度有关，而这些又受到发酵条件的影响。

因此，对乳酸菌抑菌鉴定进行研究，可以为乳酸菌应用于食品工业等领域提供科学依据。

1.乳酸菌菌种多样性的研究乳酸菌存在于不同的食品发酵过程中，通过对各种食品样品进行分离培养，可以得到不同的乳酸菌菌株。

首先，需要对这些乳酸菌菌株进行形态学、生理生化及基因序列等方面的鉴定和分类，并构建乳酸菌菌株的系统发育树。

2.乳酸菌抑菌活性的测定乳酸菌的抑菌活性是评价其抑菌能力的重要指标。

可以利用不同的方法来测定乳酸菌对不同的致病菌的抑菌效果，如纸片扩散法、孔隙扩散法等。

同时，也可以比较不同菌株之间的抑菌活性差异，并找出具有较强抑菌活性的优良乳酸菌菌株。

3.乳酸菌代谢产物的鉴定乳酸菌通过发酵作用产生一系列代谢产物，如乳酸、醋酸、乙酸、乙醇等。

这些代谢产物对于乳酸菌的抑菌能力起到重要作用。

可以通过色谱-质谱等技术手段，对乳酸菌代谢产物进行分离鉴定，并量化其浓度，以了解乳酸菌抑菌活性的机制。

4.发酵条件对乳酸菌抑菌活性的影响乳酸菌的生长发酵条件对其抑菌活性产生重要影响。

如生长温度、pH 值、发酵时间等。

可以通过调整这些条件，研究其对乳酸菌生长和抑菌活性的影响，找出最佳的发酵条件，以提高乳酸菌的抑菌活性。

通过以上的乳酸菌抑菌鉴定研究，可以得出在不同发酵条件下具有较强抑菌活性的乳酸菌菌株，并进一步深入了解其抑菌机制，为乳酸菌在食品工业等领域的应用提供科学依据。

在未来的研究中，还可以进一步探索乳酸菌菌株与致病菌之间的相互作用，以及开发新型乳酸菌发酵产品，提高其抑菌效果。

乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究摘要:乳酸菌是一类具有多种生理功能的细菌，本文通过阐述乳酸菌不同来源的分离鉴定方式，探讨了乳酸菌的部分主要生理功能。

关键词:乳酸菌分离鉴定功能Abstract: Lactic acid bacteria are a kind of many physiological functions of bacteria, this paper explains the separated and identified from different sources of lactic acid bacteria, and probes into the way of its part main physiological function.Keywords: lactic acid bacteria separated and identified function乳酸菌是一类广泛分布于自然界、与人类生活密切相关、可发酵碳水化合物、产生乳酸的细菌，然而，乳酸菌的许多特性是由其基因编码决定的【1】，利用这一特性，人们可以用乳酸菌作为载体，在食品及医药领域中构建表达系统。

乳酸菌具有控制肠道感染，改善乳糖代谢，增加某些食物的营养价值，诱导体内特异性及非特异性免疫等作用。

乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状，生殖方式为裂殖，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸分解蛋白质，但不产生腐败产物，不形成内生孢子，无运动性或极少运动，目前己发现的乳酸菌在细菌分类学上有18个属【2】。

通过对乳酸菌分离鉴定，可测定其生理功能。

一、乳酸菌的分离鉴定乳酸菌的来源广泛，腌菜、发酵肉制品、腐乳、酱醅、牛乳等食物中乳酸菌的含量极其丰富。

（一）腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌广泛存在于泡菜和腌菜等食品中，此类乳酸菌较耐盐，因此，以腌菜为样品，分离优良乳酸菌株，将其应用到含盐量较大的食品中，可以改善食品的风味，提高食品的质量。

乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类重要的微生物，其活性与生物工程、食物保健、辅助治疗理疗有着密切关系。

乳酸细菌不仅仅可以帮助人们生产优质的乳制品和酒精，还可以作为工业微生物用于环境保护和环境污染控制。

为了深入了解这类细菌的系统发育、分类学特性和生物学特性，必须对其进行有效的分类鉴定和实验方法。

一、乳酸细菌分类鉴定1、形态特征乳酸细菌是一种椭圆形或球形的细菌，其长度介于0.3微米至1微米之间，它们呈卵形或椭圆形，直径约为0.5微米，有一个或多个鞭毛粒子，但不产生酸液，具有非常强的耐高温性能。

2、生理生化特征乳酸细菌具有显著的乳酸发酵能力，它们能够发酵果糖、葡萄糖、果糖醛和蔗糖，发酵乳酸的代谢产物主要有乳酸、乙醇、乙酸、乙酸乙酯和二氢乙酸等。

乳酸细菌还具有抗酸性和耐热性，在PH值约为4.5-5.5时，可抵抗3h50°C-5°C的热治疗，并能够在较低温度下(4°C-7°C)抑制有害细菌的生长。

二、乳酸细菌实验方法1、细菌生长试验乳酸细菌生长试验通常使用拉克特拉-培养基，以检测乳酸细菌的生长情况。

目的是检测体外细菌在拉克特拉培养基中的生长情况，以及其对不同pH和温度条件下的反应情况。

细菌生长曲线检测乳酸细菌的数量，可以从细菌在恒定温度和恒定pH条件下的生长趋势中获取信息。

2、基因鉴定基因鉴定是另外一种常见的乳酸细菌实验方法，其目的是利用PCR（聚合酶链反应）技术，通过测定乳酸细菌的基因组组成来识别和鉴定乳酸细菌的种类及特性。

聚合酶链反应可以获得细菌的基因组序列，从而判断其种类。

3、蛋白质分析乳酸细菌蛋白质分析通常采用SDS-PAGE方法，可用于分析细菌产生的蛋白质种类和浓度。

SDS-PAGE可用于对细菌的蛋白质进行鉴定，以及研究细菌的蛋白质组成的差异性。

经过上述实验，可以获得乳酸细菌的形态特征、生理生化特性、基因组特征以及蛋白质组成，进而分类鉴定乳酸细菌的种类及特性。

2021年5月第42卷第10期食品研究与开发专题论述~=~218DOI : 10.12161/j.issn.l005-6521.2021.10.034MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用赵尘培,姜琳琳* ，张建龙,陈国忠，于馨，朱洪伟,张兴晓*基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2020QC227)；烟台市重点研发计划(2020YT06000171)作者简介:赵尘培(1996-),女(汉)，硕士研究生,研究方向:乳酸菌筛选及鉴定。

*通信作者凄琳琳(1986-),女(汉)，讲师，博士，研究方向:益生菌功能研究;张兴晓(1973-)，男(汉)，教授，博士，研究方向:微生物 与免疫学研究。

(鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025)摘要:乳酸菌是健康人类及动物肠道中重要的益生菌群，在维持肠道微生态平衡方面发挥重要作用。

由于乳酸菌的益生功能具有菌株特异性，因此•准确、灵敏的分子鉴定技术对乳酸菌功能的研究十分重要。

多位点序列分型(multilocus sequence typing , MLST )是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法,能够准确地从亚种水平进行菌株分类，在鉴定物种的遗传多样性方面发挥重要作用。

该文概述MLST 技术的原理、方法、优缺点及其在乳酸菌分类鉴定及遗 传多样性方面的研究现状,为乳酸菌株的鉴定提供理论依据。

关键词：乳酸菌；多位点序列分型;鉴定;遗传多样性Application of MLST in Identification and Diversity Analysis of Lactic Acid BacteriaZHAO Chen-pei, JIANG Lin-lin *, ZHANG Jian-long, CHEN Guo-zhong, YU Xin, ZHU Hong-wei,ZHANG Xing-xiao *(School of Life Sciences , Ludong University , Yantai 264025, Shandong , China )Abstract : Lactic acid bacteria is a type of important probiotic bacteria found in the intestines of healthy humansand animals. It plays a crucial role in maintaining the dynamic equilibrium of the intestinal microecology. Because their functions are strain -specific , it is essential to develop a rapid and reliable molecular markertechnique for the identification of different species of lactic acid bacteria. Multilocus sequence typing (MLST) isa method employed for bacterial gene typing and is based on DNA sequencing. Moreover, MLST can simultaneously identify strains at the subspecies level and has been used for the analysis of the genetic diversityof lactic acid bacteria. The aim of the present study was to describe the basic principle , methods , advantagesand disadvantages of MLST, while highlighting the suitability of MLST for the identification and classification oflactic acid bacteria.Key words : lactic acid bacteria; multilocus sequence typing; identification; genetic diversity引文格式：赵尘培，姜琳琳，张建龙，等.MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用[J].食品研究与开发，2021, 42(10):218-224.ZHAO Chenpei , JIANG Linlin , ZHANG Jianlong , et al. Application of MLST in Identification and Diversity Analysis ofLactic Acid Bacteria[J]. Food Research and Development , 2021, 42( 10) ： 218—224.乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类能够发酵 糖类物质最终产物为乳酸的革兰氏阳性细菌。