乳酸细菌分类鉴定及实验方法

取１ｍＬ稀释样品，分别浇注于ＭＲＳ培养基、Ｅｌｌｉｋｅｒ培养基和Ｍ１７培养基，在适宜条件下培养，用于样品中乳酸菌的分离［１１．２．２分离菌株的分离和保存将１．２．１得到的菌落在相应的平板培养基上划线纯化得到纯培养物，进行革兰氏染色，接触酶实验。

纯化菌株在ＭＲＳ斜面上４℃短期保存，置于３０％（Ｗ／Ｗ）无菌甘油中在一７０℃超低温冰箱中长期保存‘１１．２．３利用茵落拉丝法初步筛选产胞外多糖的乳酸菌将分离纯化菌株在ＭＲｓ筛选培养基上进行划线分离，在２５℃厌氧培养４８ｈ，观察并记录菌落特征。

用无菌牙签接触菌落，轻轻地向外拉，然后在２ｓ内垂直离开以在培养基表面形成连续的拉丝，重复操作５—６个菌落，每个菌落平行做２次，测量菌落拉丝的最大长度（伽ｎ），结果以“平均值士标准方差”表示。

１．２．４乳酸茵胞外多糖的提取将１．２．３得到的菌株接种于筛选ＭＲＳ液体培养基中，３０℃发酵２４ｈ，取１０ｍＬ培养物，沸水浴１０ｍｉｎ，冷却至室温，加质量分数为８０％的三氯乙酸至终浓度为４％，４℃静置过夜，１２ｏｏｏｇ离心２０ｍｉｎ，轻倾上清液于透析袋中，对流水透析２４ｈ，再对双蒸水透析３６ｈ，４次换水，定容，待用。

１．２．５硫酸－苯酚法测定乳酸茵胞外多糖（ＥＰＳ）的含量将１．２．４得到的胞外多糖样品用Ｄｕｂｏｉｓ推荐的硫酸一苯酚法［１５］测定，用葡萄糖做标准曲线（如图１），从曲线上求得ＥＰＳ的含量。

以空白培养基为对照，扣除背景干扰。

’１．２。

６·显微镜观察产胞外多糖乳酸茵细茵形态对分离菌株进行革兰氏染色，用ＭｏｔｉｃＰＭＢ５—２２３２—５摄影显微镜观察细胞形态。

１．２．７产胞外多糖乳酸茵的鉴定产胞外多糖乳酸菌的鉴定采用法国梅里埃公司鲁奎、蠢棺益图１硫酸一苯酚法测定胞外多糖含量的标准曲线的ＡＰＩ细菌鉴定系统进行，将纯菌株在ＭＲＳ琼脂培养基上３７℃微厌氧培养４８ｈ，用无菌棉拭子收集细菌，在ＡＰＩ５０ＣＨ试剂条凹槽中加ＡＰＩ５０ＣＨＬ培养基并接种，用石蜡油封好，３７℃培养２４～２８ｈ，记录菌株对碳水化合物的发酵结果，将其输入梅里埃公司的鉴定软件ＡＰＩＬＡＢＰｌｕｓ进行鉴定。

乳酸菌抑菌鉴定研究乳酸菌是一类在发酵食品中常见的细菌，它们以乳酸为代谢产物进行糖的发酵，具有很高的抑菌活性，能够抑制一些致病菌的生长。

乳酸菌的抑菌活性与其菌种的多样性、代谢产物的组成和浓度有关，而这些又受到发酵条件的影响。

因此，对乳酸菌抑菌鉴定进行研究，可以为乳酸菌应用于食品工业等领域提供科学依据。

1.乳酸菌菌种多样性的研究乳酸菌存在于不同的食品发酵过程中，通过对各种食品样品进行分离培养，可以得到不同的乳酸菌菌株。

首先，需要对这些乳酸菌菌株进行形态学、生理生化及基因序列等方面的鉴定和分类，并构建乳酸菌菌株的系统发育树。

2.乳酸菌抑菌活性的测定乳酸菌的抑菌活性是评价其抑菌能力的重要指标。

可以利用不同的方法来测定乳酸菌对不同的致病菌的抑菌效果，如纸片扩散法、孔隙扩散法等。

同时，也可以比较不同菌株之间的抑菌活性差异，并找出具有较强抑菌活性的优良乳酸菌菌株。

3.乳酸菌代谢产物的鉴定乳酸菌通过发酵作用产生一系列代谢产物，如乳酸、醋酸、乙酸、乙醇等。

这些代谢产物对于乳酸菌的抑菌能力起到重要作用。

可以通过色谱-质谱等技术手段，对乳酸菌代谢产物进行分离鉴定，并量化其浓度，以了解乳酸菌抑菌活性的机制。

4.发酵条件对乳酸菌抑菌活性的影响乳酸菌的生长发酵条件对其抑菌活性产生重要影响。

如生长温度、pH 值、发酵时间等。

可以通过调整这些条件，研究其对乳酸菌生长和抑菌活性的影响，找出最佳的发酵条件，以提高乳酸菌的抑菌活性。

通过以上的乳酸菌抑菌鉴定研究，可以得出在不同发酵条件下具有较强抑菌活性的乳酸菌菌株，并进一步深入了解其抑菌机制，为乳酸菌在食品工业等领域的应用提供科学依据。

在未来的研究中，还可以进一步探索乳酸菌菌株与致病菌之间的相互作用，以及开发新型乳酸菌发酵产品，提高其抑菌效果。

玻 片上 ， 挑菌于溶液中， 用 环 将 其 混 合搅 匀 ， 短 时 间 内
ＫＯ Ｈ试 验 阳性 菌 会 越搅 越 稠 ，抬起 接 种 环 会产 生 拉 丝
入 菌株 各 １ 环， ３ ７ ℃培养 ２ ｄ 。取 未加 碳 水化 合物 的Ｐ Ｙ培 养 基作 为 对 照 。 使 用Ｂ Ｔ Ｂ ． ＭＲ 试 剂 比较颜 色 的变化 ， 记
ｗｅ ｒ ｅ Ｌａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｂ ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ， ２ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ Ｌａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｍｉ ｎ ｏ ｒ ａ ｎ ｄ １ ｓ ｒａ ｔ ｉ ｎ ｗａ ｓ Ｌａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｆ ｅ ｍ ｅ ｒ ｎｔ ｉ ｕ ｍ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： ｆ ｅ ｍ ｅ ｒ ｎ ｔ ｅ ｄ Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ ｃ ａ ｂ ｂ ａ ｇ ｅ ； Ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ； ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ； ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
Ｘ Ｉ ＡＯ Ｊ ｉ ｎ ｇ ， Ｓ Ｕ Ｎ Ｊ ｉ ａ ｎ — ｑ ｉ ｕ ， ＷＡ ＮＧ Ｘｉ ｕ ￣ ｉ ｎ ｇ ， Ｒ Ｅ Ｎ Ｊ ｉ ｎ ｇ — ｘ ｉ ｎ
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｎ ｎ ｇ ， Ｑ ｉ ｑ ｉ ｈ ａ ｒＵ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｑ ｉ ｑ ｉ ｈ ａ ｒ１ ６ １ ０ ０ ￣Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
２ ． １菌 落形 态和 细胞 形态检 测 结果 分离到的ｌ ３ 株菌 ， 菌 落 乳 白色 、 灰色或略显黄色 ；

近年来 ,限制性核酸内切酶分析已成功地应用 于病毒的鉴定分型 ,并已用于细菌的分型鉴定 ,它实 际上是对 DNA 序列分析的一种简化 。限制性核酸 内切酶能识别和切割双链 DNA 的特异部位 ,产生系 列 DNA 片段 ,这些 DNA 片段经电泳后形成独特的 DNA 片段带谱 , 这些带谱就构成了各个不同双链 DNA 的 特 征 性 指 纹 (finger print ) 。比 较 不 同 细 菌
中图分类号 :R15 ; TS20116 文献标识码 : E 文章编号 :1004 - 8456 (2002) 01 - 0047 - 07
乳酸菌检测方法 (综述)
张一凡 冉 陆 罗雪云 (卫生部食品卫生监督检验所 北京 100021)
乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的 细菌总称 ,这个名称就细菌分类学而言是一非正式 、 非规范的名称 。目前在自然界已发现的这类菌在细 菌分类学上划分出至少 23 个属 ,涉及到的有关属则 更多 ,包括乳杆菌属 、双歧杆菌属 、链球菌属 、肠球菌 属等 。而相当多的乳酸菌对人 、畜的健康起着有益 的作用 。近年来 ,随着微生态学研究的不断发展 ,越 来越多的实验证明有益细菌对人体健康的重要作 用 ,微生态制剂也因此应运而生 。目前我国微生态 制剂利用的益生菌近 10 种 ,其中除了乳杆菌和乳酸 链球菌有国家的标准检验方法外 ,大部分菌种均无 统一的标准方法 ,难于对该类产品进行质量控制 ,保 证其安全性 。故急需建立规范的标准检验方法 ,以 便对微生态制剂进行监督管理 ,保障其功能 、安全性 及质量 ,以保护消费者的健康和利益 。本文即对目 前国内外用于乳酸菌检测的方法做一综述 。
离子色谱法和气相色谱法从分析厌氧菌的代谢 产物结果来看 ,在总体上无明显差异 ,但离子色谱法 具有以下优点 :[4]

量为0.1g)、均质器、振荡器、吸管（1mL 和 10mL)、锥形瓶(容量250mL、500mL)、培 养皿(直径90mm)、试管（18mm × 180mm、15mm × 100mm)。
四、乳酸菌的检验
４ 检验程序
四、乳酸菌的检验
５ 操作步骤--样品制备 ➢ 样品制备无菌操作程序： ➢ 第一步：冷冻样品 可先使其在2~5℃条件下解冻，时间不超过18h,也可在温度不超 过45℃的条件下解冻，解冻时间不超过15min； ➢ 第二步：固体和半固体食品 以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的 无菌均质杯内，8000 ~ 10 000 r/min均质1 ~ 2min，制成1:10样品匀液； ➢ 第三步：液体样品 应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生 理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇,制成1:10的样 品匀液； ➢ 第四步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水 的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹 打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液； ➢ 第五步：另取1mL无菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次， 即换用1次1mL灭菌吸管。
➢ 双歧杆菌培养:根据待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度，每个稀
释度吸取0.1mL样品匀液于莫匹罗星锂盐改良 MRS琼脂平板，表面涂布，每稀释度做
两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h ±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释
到平板涂布要求在15min内完成；
➢ 嗜热链球菌培养:根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度,每
培养皿1 培养皿2 平均数

１ 材 料 与方 法 １１ 材料 ．
１ 实验仪器 培养皿 、 ～１ １ 移液管 、 牛津杯 、 微型 发酵 管（ 空管 ）针头 、 、 试管 、 蒸馏水 、 三角棒、 微量加样 枪枪 头、 注射器、 心管等器具 ， 已作高压湿热灭菌。 离 均
１１ 培养基 ．２ ． Ｌ Ｓ乳酸杆菌选择培养基 的制备 ： Ｂ 蛋
红、 美蓝混匀，２ 灭菌 １ ｍ ｎ １ １Ｃ ｏ ５ ｉ。
２１ 乳 酸杆 菌的分 离纯化结果 ．
在 Ｌ Ｓ划线培养的 Ｂ
菌株 中随机挑选 １ 菌株 ， 株 进行纯 化培养 ， 鸡粪菌株 代号为 Ｌ Ｊ Ｂ 、猪粪菌株代号 为 Ｌ Ｚ Ｂ 、牛粪菌株代号 为
Ｌ ＢＮ。
营养琼脂培养基 的制备 ： 牛肉膏 １ － 白胨 ２ 、 蛋 ｇ ｇ
前 为淡紫色 ， 阳性反应为黄色 ， 阴性反应为深红色。以
上微量 发酵 管除精氨酸外 ， 其余都为糖 、 醇发酵 ， 精氨
分别取猪粪 、牛粪、 鸡 酸发酵是为 了验证 有无氨气产生 ，接种前为绿色 ， 阳
１ ． 乳酸杆菌 的分离纯 化 ．１ ２
粪约 １ ， ９ ｍ 加 ９ Ｌ生理 盐水 ， ｇ 室温下 １０ ／ ｉ ５ ｒ ｎ摇床振 ｍ 摇 ｌ～ ０ ｉ。分别在 Ｌ Ｓ培养基上划线 ，将划线的 ５３ ｎ ｍ Ｂ
ｌ ｔ ａｉｕ ｙ ｓｓａｄ ｔｅＣＷ ｓｕ ｅ ｌ ｔ ａｉｕ ｒ ｈｃ ｓｈｄ ｎ ｉ ｏ ｃ ｔｇｎｓｃａｔｎ ｔ ａ ｏ ｃｌｓｘｌ ｕ ｎ ｈ Ｏ ｏｒ ａ ｏ ｃｌｓｔｃｏｔ ａ ｏｂｏ ｇ ａ ａ ａｏｉｉ ｃｏ ｏ ｃｂ ｌ ｏ ｃ ｃｂ ｌ ｉ ｅ ｌ ｌ ｎ ｉ ｔ ｉ
０ ｇ七水硫酸镁 ０ ４ 、 ．、 ４ ． ｇ 四水硫酸镁 ０ １ 、 ０ ． 琼脂粉 ０ｇ

乳酸菌的分离鉴定方法和功能研究摘要:乳酸菌是一类具有多种生理功能的细菌，本文通过阐述乳酸菌不同来源的分离鉴定方式，探讨了乳酸菌的部分主要生理功能。

关键词:乳酸菌分离鉴定功能Abstract: Lactic acid bacteria are a kind of many physiological functions of bacteria, this paper explains the separated and identified from different sources of lactic acid bacteria, and probes into the way of its part main physiological function.Keywords: lactic acid bacteria separated and identified function乳酸菌是一类广泛分布于自然界、与人类生活密切相关、可发酵碳水化合物、产生乳酸的细菌，然而，乳酸菌的许多特性是由其基因编码决定的【1】，利用这一特性，人们可以用乳酸菌作为载体，在食品及医药领域中构建表达系统。

乳酸菌具有控制肠道感染，改善乳糖代谢，增加某些食物的营养价值，诱导体内特异性及非特异性免疫等作用。

乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状或球状，生殖方式为裂殖，消耗葡萄糖50％以上，产生乳酸分解蛋白质，但不产生腐败产物，不形成内生孢子，无运动性或极少运动，目前己发现的乳酸菌在细菌分类学上有18个属【2】。

通过对乳酸菌分离鉴定，可测定其生理功能。

一、乳酸菌的分离鉴定乳酸菌的来源广泛，腌菜、发酵肉制品、腐乳、酱醅、牛乳等食物中乳酸菌的含量极其丰富。

（一）腌菜盐水中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌广泛存在于泡菜和腌菜等食品中，此类乳酸菌较耐盐，因此，以腌菜为样品，分离优良乳酸菌株，将其应用到含盐量较大的食品中，可以改善食品的风味，提高食品的质量。

表２结果表明，Ｌ７、Ｌ－８和Ｌ广６菌株的发酵液中均含有 乳酸，说明此３个菌株为产乳酸菌株。 ２．２．２形态学鉴定结果．
１，－７、Ｌ８和Ｌ广６菌株的形态学鉴定结果见表３。
表３ Ｌ－７、Ｌ＿．８和Ｌ＿６菌株的形态学特征鉴定结果 Ｔａｂｌｅ ３．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ Ｌ－－７．Ｌ＿名ａｎｄ Ｌ－６
材料：大白菜、食盐。 试剂：蛋白胨、酵母膏、吐温一８０，牛肉膏、琼脂、乳酸、
Ｋ２ＨＰ０４、柠檬酸三铵、乙酸钠、葡萄糖、ＭｇＳ０４·７Ｈ２０、 ＭｎＳＯ．Ｉ·４Ｈ２０、丁醇、甲酸等。
仪器：恒温培养箱，生化培养箱，奥林巴斯显微镜， ７３１分光光度计，超净工作台，电热手提式高压杀菌锅，酸 度计，电子天平。 １．１．１培养基
中图分类号：ＴＳ２０１．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５４－５０７１（２００９）０２－００６２稍
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｐｉｃｋｌｅｄ ｃａｂｂａｇｅ
ＬＩＵＸｉａｏｈｕｉｌ，ＣＨＥＮＳｈｕｎｌ，ＧＡＯＸｉａｏｍｅｉｌ，ＺＨＡＮＧＹａｈｌ，ＣＡＩＹｕｅ２
Ａｂｌ血ａｃｔ：Ｔｂ僦ｈｉｇｈ—ａｃｉｄ－ｙｉｅｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｊｕｉｃｅ ｏｆｐｉｃｋｌｅｄ ｃａｂｂａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｎｄ ｗ啪ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖ趣Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｅｔａｒｉｕｍ ａｎｄ Ｌｃｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｃｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ

乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类重要的微生物，其活性与生物工程、食物保健、辅助治疗理疗有着密切关系。

乳酸细菌不仅仅可以帮助人们生产优质的乳制品和酒精，还可以作为工业微生物用于环境保护和环境污染控制。

为了深入了解这类细菌的系统发育、分类学特性和生物学特性，必须对其进行有效的分类鉴定和实验方法。

一、乳酸细菌分类鉴定1、形态特征乳酸细菌是一种椭圆形或球形的细菌，其长度介于0.3微米至1微米之间，它们呈卵形或椭圆形，直径约为0.5微米，有一个或多个鞭毛粒子，但不产生酸液，具有非常强的耐高温性能。

2、生理生化特征乳酸细菌具有显著的乳酸发酵能力，它们能够发酵果糖、葡萄糖、果糖醛和蔗糖，发酵乳酸的代谢产物主要有乳酸、乙醇、乙酸、乙酸乙酯和二氢乙酸等。

乳酸细菌还具有抗酸性和耐热性，在PH值约为4.5-5.5时，可抵抗3h50°C-5°C的热治疗，并能够在较低温度下(4°C-7°C)抑制有害细菌的生长。

二、乳酸细菌实验方法1、细菌生长试验乳酸细菌生长试验通常使用拉克特拉-培养基，以检测乳酸细菌的生长情况。

目的是检测体外细菌在拉克特拉培养基中的生长情况，以及其对不同pH和温度条件下的反应情况。

细菌生长曲线检测乳酸细菌的数量，可以从细菌在恒定温度和恒定pH条件下的生长趋势中获取信息。

2、基因鉴定基因鉴定是另外一种常见的乳酸细菌实验方法，其目的是利用PCR（聚合酶链反应）技术，通过测定乳酸细菌的基因组组成来识别和鉴定乳酸细菌的种类及特性。

聚合酶链反应可以获得细菌的基因组序列，从而判断其种类。

3、蛋白质分析乳酸细菌蛋白质分析通常采用SDS-PAGE方法，可用于分析细菌产生的蛋白质种类和浓度。

SDS-PAGE可用于对细菌的蛋白质进行鉴定，以及研究细菌的蛋白质组成的差异性。

经过上述实验，可以获得乳酸细菌的形态特征、生理生化特性、基因组特征以及蛋白质组成，进而分类鉴定乳酸细菌的种类及特性。

2021年5月第42卷第10期食品研究与开发专题论述~=~218DOI : 10.12161/j.issn.l005-6521.2021.10.034MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用赵尘培,姜琳琳* ，张建龙,陈国忠，于馨，朱洪伟,张兴晓*基金项目:山东省自然科学基金项目(ZR2020QC227)；烟台市重点研发计划(2020YT06000171)作者简介:赵尘培(1996-),女(汉)，硕士研究生,研究方向:乳酸菌筛选及鉴定。

*通信作者凄琳琳(1986-),女(汉)，讲师，博士，研究方向:益生菌功能研究;张兴晓(1973-)，男(汉)，教授，博士，研究方向:微生物 与免疫学研究。

(鲁东大学生命科学学院，山东烟台264025)摘要:乳酸菌是健康人类及动物肠道中重要的益生菌群，在维持肠道微生态平衡方面发挥重要作用。

由于乳酸菌的益生功能具有菌株特异性，因此•准确、灵敏的分子鉴定技术对乳酸菌功能的研究十分重要。

多位点序列分型(multilocus sequence typing , MLST )是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法,能够准确地从亚种水平进行菌株分类，在鉴定物种的遗传多样性方面发挥重要作用。

该文概述MLST 技术的原理、方法、优缺点及其在乳酸菌分类鉴定及遗 传多样性方面的研究现状,为乳酸菌株的鉴定提供理论依据。

关键词：乳酸菌；多位点序列分型;鉴定;遗传多样性Application of MLST in Identification and Diversity Analysis of Lactic Acid BacteriaZHAO Chen-pei, JIANG Lin-lin *, ZHANG Jian-long, CHEN Guo-zhong, YU Xin, ZHU Hong-wei,ZHANG Xing-xiao *(School of Life Sciences , Ludong University , Yantai 264025, Shandong , China )Abstract : Lactic acid bacteria is a type of important probiotic bacteria found in the intestines of healthy humansand animals. It plays a crucial role in maintaining the dynamic equilibrium of the intestinal microecology. Because their functions are strain -specific , it is essential to develop a rapid and reliable molecular markertechnique for the identification of different species of lactic acid bacteria. Multilocus sequence typing (MLST) isa method employed for bacterial gene typing and is based on DNA sequencing. Moreover, MLST can simultaneously identify strains at the subspecies level and has been used for the analysis of the genetic diversityof lactic acid bacteria. The aim of the present study was to describe the basic principle , methods , advantagesand disadvantages of MLST, while highlighting the suitability of MLST for the identification and classification oflactic acid bacteria.Key words : lactic acid bacteria; multilocus sequence typing; identification; genetic diversity引文格式：赵尘培，姜琳琳，张建龙，等.MLST 在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用[J].食品研究与开发，2021, 42(10):218-224.ZHAO Chenpei , JIANG Linlin , ZHANG Jianlong , et al. Application of MLST in Identification and Diversity Analysis ofLactic Acid Bacteria[J]. Food Research and Development , 2021, 42( 10) ： 218—224.乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类能够发酵 糖类物质最终产物为乳酸的革兰氏阳性细菌。

产高效细菌素乳酸菌地筛选及鉴定摘要：本研究旨在从自然生境中筛选产高效抑菌蛋白地乳酸菌, 并进行抑菌活性分析和菌种鉴定. 通过牛津杯法抑菌实验对样本中乳酸菌进行初筛, 然后对发酵液进行排除酸、过氧化氢干扰和蛋白酶处理, 进一步复筛出产抑菌蛋白地乳酸菌. 通过形态学、生理生化、糖发酵<API ）和16SrDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定•结果表明：本研究成功地筛选出2株对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等致病菌有高效抑制作用地乳酸菌<抑菌圈直径均>20 mm）, 证明其抑菌物质为蛋白类物质并推测为细菌素, 菌种鉴定为植物乳杆菌和粪肠球菌• 本实验对高效细菌素—乳酸菌地研究为食品及饲料行业中乳酸菌素地开发和应用提供参考•关键词：乳酸菌；细菌素；筛选鉴定；抑菌活性畜牧生产中抗生素滥用、病源微生物耐药性等问题严重威胁着食品安全及人类健康, 越来越多地研究致力于寻找新型安全有效地绿色饲料添加剂作为理想地抗生素替代品• 细菌素是细菌在生长过程中通过核糖体途径合成并分泌到环境中地具有抑菌作用地蛋白或多肽物质, 具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点[1]•目前国内外对细菌素地研究主要集中在芽孢杆菌和乳酸菌上, 乳酸菌是一类可发酵碳水化合物、产生大量乳酸<>50%）地革兰氏阳性球菌或杆菌地统称[2]•饲料中添加乳酸菌制剂可以促进动物胃肠道微生态平衡, 改善动物健康[3]我国《饲料添加剂品种目录<2018）》中允许添加地29 种微生物菌种中有9 种属于乳酸菌属• 添加植物乳杆菌地发酵饲料中粗蛋白、粗脂肪含量明显上升, 提高饲料利用率[4]•Riboulet 等[5]研究表明, 乳杆菌素Abp118 对小鼠和猪地肠道沙门氏菌等致病菌有显著地抑制作用并影响动物机体免疫力• 因此对乳酸菌细菌素抑菌能力地挖掘成为开发绿色饲料添加剂地重点• 本实验旨在筛选出对病原菌有高效、广谱抑菌活性地产细菌素乳酸菌菌株, 并对其进行菌株鉴定, 为天然安全地饲料添加剂地开发提供理论依据.1材料与方法1.1材料与试剂生境材料<酸菜、生牛奶、青贮料、土壤等）；指示菌为单增李斯特菌<L.monocytogenes cvcc1599 ）；金黄色葡萄球菌<S.aureus cvcc26003 ）；藤黄八叠微球菌<S.lutea cmcc28001 ）；大肠杆菌<E.coil cvcc245 ）；沙门氏菌<S.typhimuriumcvcc541 ）；培养基<MRS BPY LB等）,药品采用国产分析纯；细菌基因组DNA提取试剂盒< 北京天根生化有限公司）；Analytic Products INCAPI50CH 试剂盒<法国梅里埃）.16SrDNA地PCR T增引物27F: 5' -AGAGTTTGATCCTGG CTCAG3'、1525R: 5' -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-1.2产抑菌物质乳酸菌地初筛乳酸菌地分离与培养:将收集地样本悬浮于无菌生理盐水中按梯度稀释,涂布于含溴甲酚紫指示剂<0.01%）地MRS琼脂平板上，37C培养箱培养48 h,挑选培养基变黄地菌落划线纯化, 选取镜检革兰氏染色阳性、无芽孢地菌株于MRS夜体培养基中37C培养12 h作为种子液.种子液按2滋种于新地MRS夜体培养基37C静置培养36 h 作为发酵液.以8 000 r/min 离心10 min, 取上清液备用.指示菌地制备:选取地4株指示菌中大肠杆菌用LB 培养基, 其余用BPY培养基，种子液按2%接种于液体培养基37C、150 r/min 摇床过夜< 浓度约达109个/mL）,稀释到107CFU/mL备用.菌株抑菌实验初筛:采用牛津杯法. 取备用指示菌<107CFU/mL 150卩L涂布于BPY琼脂平板上，放置3个牛津杯/板，常温干燥30 min.取菌株发酵上清200卩L 加入牛津杯内, 以空白培养基为对照,3 个重复/样, 置于37C培养24 h,测定抑菌圈直径d<mm .选取抑菌效果较好地菌株进行复筛，用甘油-20C保种备用.1.3产抑菌蛋白乳酸菌地复筛同上制作初筛菌株地发酵液和指示菌液. 检测各菌株发酵上清液地pH 值,并对发酵上清进行排酸、过氧化氢酶和蛋白酶处理：①上清原液；②用NaOH调节上清至pH 5.5 :③调节上清至pH7.2并用过氧化氢酶、蛋白酶<1mg/mL）处理，37C温育2 h后调回pH至5.5[6];④对照：用乳酸、乙酸调节pH为4.0地培养基.牛津杯法测抑菌活性• 选用单增李斯特菌、藤黄八叠微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌作为指示菌, 牛津杯法测定各菌株发酵上清抑菌活性, 分析各菌株抑菌效果并筛选出含有高效抑菌蛋白地乳酸菌作为目标菌株.1.4菌株地鉴定形态学鉴定：将目标菌株划线于MRS琼脂平板，37C培养48 h,观察菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色镜检.生理生化鉴定：对菌株进行接触酶、硝酸还原、产氨、水解、H2S、VP吲哚、明胶液化等实验＜参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》）[13];对菌株进行49种糖发酵实验＜API50CH试剂盒）•将实验结果参照第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》）并与API 数据库进行比对.16S rDNA 基因序列鉴定：利用细菌基因组提取试剂盒提取目标菌株地基因组DNA利用乳酸菌通用引物进行PCR T增并测序•通用引物序列：27F: 5' -AGAGTTTGATCC TGGCTCAG- 1 525R: 5' -AGAAAGG AGGTGATCCAGCC-;反应体系50 卩L: DNA模板1 卩L, 2X Taq PCR Mix 25 卩L,27F 2 卩L,1525R 2 卩L,双蒸水20卩L;扩增条件为：94C预变性5 min, 94C变性30 s, 55C退火30 s, 72C延伸90 s,共30个循环，最后72C延伸10 min.引物合成及PCR T物测序由上海英骏生物技术有限公司完成.运用NCBI上地BLAST在线软件将测序结果与GenBank数据库进行同源性比较；利用Clustalx 2.0.11 和MEGA5.10 软件构建乳酸菌系统发育树.1.5统计分析采用Excel 对实验数据初步整理, 并用SPSS Statistics17.0 软件中One-Way ANOVA进行进行方差分析，以P v 0.05为显著水平,P v 0.01为差异极显著，差异显著性分析应用Duncan' s多重比较.结果均以平均值±标准差表示.2结果2.1产抑菌物质乳酸菌地初筛从样本中分离出革兰氏染色阳性、无芽孢地乳酸菌72 株;再通过牛津杯法抑菌实验, 以金黄色葡萄球菌为指示菌筛选出有抑菌效果地菌株10株＜见表1）,选取其中抑菌圈直径大于16 mm地6株菌＜N13 EN3 CN4 SN4 SN5 SC5）作为后续复筛菌株.此外，发现牛津杯中发酵上清地加样量大于150卩L时抑菌效果比较明显，后续实验选用此指标.表1菌株对SA地抑菌圈直径mm菌株pH 发酵液上清/ L50 100 150 200N13 4.70 + ++ +++ +++EN3 4.91 - + ++ +++CN4 4.76 - + ++ +++SN4 4.17 + +++ +++ ++++SN5 4.15 + +++ +++ ++++AS1 5.07 - + ++ ++SC4 4.96 - + ++ ++SC5 4.76 + + ++ +++W35 4.95 + + ++ ++CW6 4.93 - + ++ ++注：抑菌圈直径"-”：＜8mm ＜无抑菌活性)；“+”：8~12 mm;牛津杯直“ ++ ”: 12~16 mm “ +++ ” : 16~20 mm “ ++++ ” : ＞20b5E2RGbCAP径为8 mm2.2产抑菌蛋白乳酸菌地复筛对初筛得到地6 菌株，发酵上清液经过排酸、H2O2酶和蛋白酶处理后与上清原液相比，抑菌活性结果见表2. 各菌株发酵液pH较低＜3.90 ＜pH ＜4.72 ),其中SN4、SN5地产酸能力最强＜pH达3.9 ).排酸处理后N13和SC5抑菌活性消失,CN4、SN4 SN5抑菌活性与发酵上清相比有所降低＜如图1),但pH 4.0 地乳酸、乙酸对照无抑菌活性；H2O2酶处理后抑菌活性无明显差异；蛋白酶K和胰蛋白酶处理后抑菌活性均消失. 此外, 在对多种指示菌地抑菌实验中＜表3), 各菌株发酵上清液对G+有较好地抑菌活性而对G无抑菌活性；其中CN4、SN4 SN5对李斯特菌有显著地抑菌活性＜抑菌圈＞20 mm；P<0.01 ) , 选为产高效抑菌蛋白地目标菌株.2.3 菌株地鉴定2.3.1 形态学鉴定如图2 所示, 筛选地目标菌株CN4 SN4 SN5平板培养48 h后呈现直径约1~2 mm圆形突起、乳白色、不透明地光滑菌落；镜检下细菌CN4为单个球状,SN4、SN5为短杆状或链状，均无芽孢、无鞭毛、无荚膜、革兰氏染色阳性.2.3.2生理生化鉴定参照第八版《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[7]并运用bioMerieux73动物生产・Animal Production2018 年第49 卷第19 期注：A:乳酸菌SN4菌落形态,B和C为SN4 CN4革兰氏染色后细胞形态<x 100oil )图2 菌株地鉴定注：A: CN4 SN4 SN5对S.aureus地抑菌圈,B : SN4发酵液处理对L. monocytogenes 地抑菌圈,C ：SN4 发酵液处理对S.aureus 地抑菌圈图1 乳酸菌发酵液对指示菌地抑菌活性表3 目标菌株对不同指示菌地抑菌圈直径mm菌株S.aureusL.monocytogenesS.lutea E.coilS.typhimuriumN13 15.75±1.06bc17.50±0.71c18.50±0.71abEN3 14.25±0.35c16.25±0.35c17.50±0.35bcCN4 17.50±0.71b20.25±1.06b15.75 ±1.06cSN4 20.75±1.06 a27.25 ±1.06a20.50 ±1.41aSN5 20.88±0.18 a27.50 ±0.71a20.25 ±0.35aSC5 14.75±1.06 c17.00 ±0.71c20.75 ±1.06aP 0 0.001 0.009 0 0注：同列数据肩标相邻小写字母表示差异显著＜P v 0.05 ),相间字母表示差异极显著＜P v 0.01 )apiweb 数据库对菌株24 、48 h API 发酵结果进行判读,结果鉴定CN4为副干酪乳杆菌＜鉴定度：ID为99.9%; T值为0.88 ); SN4 SN5同为植物乳杆菌＜鉴定度：ID为99.9%; T值为0.64 ).根据API50 CHL试剂盒使用手册，本鉴定所得ID大于99%,T值大于0.5均为极好地鉴定结果＜表4 和表5) .表4 菌株生理生化实验结果实验CN4 SN4 实验CN4 SN4H2O2酶- - H2S 产生- -厌氧生长+ + 硝酸盐还原- -V-P + + 吲哚- - 运动性- - 精氨酸双水解酶+ -产气- - 明胶液化- -产酸+ + 50 C生长--精氨酸产氨--15C生长+ -注：“+”表示阳性反应；“-”阴性反应•下表同2.3.3 16S rDNA 基因序列鉴定以菌株CN4、SN4、SN5地DNA为模板，16S rDNA通用引物进行PCR扩增后得到约1 500 bp地特异性扩增产物.PCR产物测序结果于NCBI中使用BLAST软件在GenBank中进行同源性比对,SN4和SN5序列比对为同一菌株.与CN4SN4 <SN5) 同源性最高地菌株分别为EnterococcusfaecalisstrainKLDS4.0341<No.GQ337884.1 )和Lactobacillusp1EanqFDPwplantarum strain G8 <No.JX183220.1 ),同源性均为99%.因此目标菌株CN4鉴定为粪肠球菌、SN4和SN5为同株植物乳杆菌. 乳酸菌系统发育树见图3.3讨论3.1 产抑菌物质乳酸菌地初筛基于乳酸菌对营养物质地特殊要求, 选择性培养基MRS [8]常被用作乳酸菌地分离鉴定, 以溴甲酚紫作为酸碱指示剂可将样本中产酸地细菌初步分离出来. 王有湘等[9]研究发现，相同条件下，乳酸菌在MRS上地生长情况和数量好于TJA、M17 •抑菌实验中常用地方法包括牛津杯法、滤纸片法和浊度法. 本研究采用牛津杯法对金黄色葡萄球菌地抑菌表明，发酵上清加样量大于150卩L 时才有明显抑菌效果，应该是受到牛津杯限制或琼脂扩散等原因；各菌株地抑菌活性大小不等，抑菌圈直径小于14 mm时抑菌活性较低，因此选取抑菌圈大于16 mm地菌株作为复筛菌株•3.2产抑菌蛋白乳酸菌地复筛对于初筛得到地乳酸菌，为了排除抑菌效果中H2和酸性代谢产物<乳酸、乙酸)地影响，本研究对发酵上清进行了H2 2酶处理后抑菌活性无明显差异说明抑菌物质不是HO2；上清调节pH至弱酸性后抑菌活性有所降低,说明酸性物质对抑菌活性有影响；而pH 4.0 地乳酸表2菌株发酵上清不同处理对SA地抑菌圈直径mm菌株pH发酵液上清处理上清原液调酸pH5.5H202 酶蛋白酶K胰蛋白酶N13 4.63 14.67 ±1.53 - 14.17±1.26 - -EN3 4.60 13.83 ±1.44 10.50 ±2.18 13.50 ±0.87 - -CN4 4.72 16.5 0±1.32 15.17 ±1.04 16.83 ±1.26 - -SN4 3.90 20.17 ±0.76 18.50 ±0.50 19.83 ±1.04 - -SN5 3.93 19.33 ±1.76 17.83 ±0.76 19.67 ±1.26 - -SC5 4.47 14.50 ±0.87 - 13.83 ±0.76 - -乳酸液4.0 - ND ND ND ND乙酸液4.0 - ND ND ND ND注：“-”表示抑菌圈<8 mm或无抑菌活性，“DNf表示未测定742018年第49 卷第19 期Animal Production •动物生产管号代码底物成分CN4 SN4 管号代码底物成分CN4 SN4 0 - - - - 25 ESC 七叶灵柠檬酸铁+ +1GLY 甘露醇+ - 26 SAL 水杨苷+ +2ERY 赤藻糖醇- - 27 CEL D- 纤维二糖+ +3DARA D -阿拉伯糖- - 28 MAL D- 麦芽糖+ +4LARA L- 阿拉伯糖- + 29 LAC D- 乳糖+ +5LIB D- 核糖+ + 30 MEL D- 密二糖- +6DXYL D- 木糖- - 31 SAC D- 蔗糖+ +7LXYL L- 木糖- - 32 TRE D- 海藻糖+ +8ADO D-侧金盏花醇1 - - 33 INU 菊粉--9MDX 甲基- D 吡喃木糖苷- - 34 MLZ D- 松三糖+ -10GAL D-半乳糖+ + 35 RAF D- 棉子糖--11GLU D-葡萄糖+ + 36 AMD 淀粉--12FRU D-果糖+ + 37 GLYG 糖原--13MNE D-甘露糖+ + 38 XLT 木糖醇--14SBE L- 山梨糖- - 39 GEN D- 龙胆二糖+ +15RHA L-鼠李糖-+ 40 TUR D- 土伦糖--16DUL 卫茅醇- - 41 LYX D- 来苏糖- -17INO 肌醇- - 42 TAG D- 塔格糖+ +18MAN 甘露醇+ + 43 DFUC D- 岩藻糖- -19SOB 山梨醇+ - 44 LFUC L- 岩藻糖- -20MDM 甲基- D- 吡喃甘露糖苷- + 45 DARL D- 阿拉伯醇- -21MDG 甲基- D- 吡喃葡萄糖苷- - 46 LARL L- 阿拉伯醇- -22NAG N-乙酰葡萄糖胺+ + 47 GNT 葡萄糖酸钾+ +23AMY 苦杏仁苷+ + 48 2KG 2 酮基葡萄糖酸钾- -24ARB ARBULIN + + 49 5KG 5 酮基葡萄糖酸钾- - 表5菌株对API49种糖发酵实验结果和乙酸培养基对照无抑菌活性, 可推断抑菌活性不是由酸性物质所致，但较低地pH环境可以增强其他抑菌物质地抑菌活性.Zacharof 等[10]报道，乳酸菌素在pH<5环境下可以更好地吸附于靶细胞表面发挥抑菌活性；发酵上清经蛋白酶K 和胰蛋白酶处理后，抑菌活性完全消失，说明发酵液中地抑菌物质为蛋图3菌株CN4 SN4与同源性属种16S rDNA序列构建地系统发育树75动物生产・AnimalProduction2018 年第49 卷第19 期白类物质，可初步鉴定为细菌素[11]本研究地多种指示菌地抑菌实验中，6 株乳酸菌对G+<S.aureus 、L.monocytogenes 、S.lutea ）均有抑菌活性而对G菌<E.coil 、S.typhimurium ）无抑菌活性，其中对L.monocytogenes 地抑菌效果均显著高于S.aureus 和S.lutea. 很多研究表明大部分细菌素只对近源菌株有抑菌活性，也有些细菌素抑菌谱比较广.Zacharof 等[10]研究指出，大部分地乳酸菌素对G+细菌细胞壁有特异吸附性. 其原因可能与G+和G菌细胞壁地结构差异有关系，细菌素主要通过与靶细胞膜上地特异性受体相结合而发挥抑菌或杀菌作用. 对同一指示菌地抑菌效果来看SN4 SN5发酵上清地抑菌活性极显著大于其他菌株<d>20 mm),其次为CN4地抑菌活性显著大于其他菌株<d>17 mm);因此选取CN4 SN4 SN5为具有高效产抑菌蛋白地目标菌株•3.3菌株地鉴定传统地生理生化鉴定分析方法, 往往还不能准确鉴定出细菌地种属• 通过遗传特征地保守性序列<如16S rDNA)分析,能够判定细菌间亲缘关系地远近, 从而得到准确地鉴定结果[12] 由于菌属地关系复杂, 单一鉴定方法容易受到环境和自身变异地影响而不能准确鉴定其所属, 因此本实验通过形态学、生理生化、API 糖发酵鉴定和分子学鉴定最终确定菌株地种属• 形态学和生理生化鉴定结果表明,CN4为肠球菌属，SN4、SN5同为乳杆菌属；而API糖发酵实验中CN4鉴定为副干酪乳杆菌， SN4 SN5为植物乳杆菌，这与CN4在镜检下球状形态相冲突，进一步采用16S rDNA 基因序列鉴定，在GenBank进行BLAST比对后鉴定结果为CN4为粪肠球菌,SN4、SN5为同株植物乳杆菌，因此将CN4推断为变异地粪肠球菌菌种•CN4API 鉴定和形态学、16S rDNA基因序列地鉴定结果差异，说明单一地鉴定方法不足以准确地鉴定菌株地种属，鉴定结果地差异可能是由于菌株自身地变异而使得生理生化特征发生改变成为新地菌株，因此在细菌菌种地鉴定时要运用多种鉴定方法结合确定其种属• 4 结论本研究通过多种抑菌实验对样本中地乳酸菌进行初筛和复筛，得到2株产抑菌蛋白地目地菌株，其发酵液对G+<S.aureus、L.monocytogenes、S.lutea )致病菌均有较好地抑菌活性• 通过排除酸、过氧化氢地干扰以及蛋白酶处理实验可以确定抑菌物质为蛋白类活性物质细菌素. 对目标地菌株进行形态学、生理生化实验、API糖发酵实验和16S rDNA基因序列分析菌种鉴定并将其建立了系统发育树，鉴定结果为CN4为变异地粪肠球菌,SN4和SN5为同株植物乳杆菌. 本实验将进一步研究目标菌株地生物学特性、抑菌范围、细菌素地分离和纯化和鉴定等，为其应用于青贮饲料、微生物饲料和饲料添加剂方面提供参考和依据.参考文献：[1] 郭兴华. 益生乳酸细菌分子生物学及生物技术[M]. 北京: 学出版社， 2008.[2]Zaunm u Iler T, Eichert M, Richter H, et al. 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细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展一、本文概述随着分子生物学技术的快速发展，其在细菌分类鉴定领域的应用已经取得了显著的进展。

本文旨在对细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展进行系统的梳理和总结，以期为相关领域的学者和从业人员提供全面的科研进展参考。

本文将重点介绍分子生物学技术在细菌分类鉴定中的应用，包括基因测序技术、PCR技术、基因芯片技术、宏基因组学方法等，并探讨这些技术在细菌分类鉴定中的优势、挑战以及未来发展趋势。

同时，本文还将对近年来细菌分类鉴定领域的重要研究成果进行综述，以期为细菌分类鉴定领域的研究提供有益的参考和启示。

二、细菌分类鉴定的传统方法及其局限性传统的细菌分类鉴定方法主要依赖于细菌的表型特征，包括菌落形态、细胞形态、生理生化特性、血清学反应以及生态习性等。

这些方法在过去的一个多世纪里为细菌学的发展做出了重要贡献，随着科学技术的进步和细菌学研究的深入，传统方法的局限性逐渐显现。

传统方法的鉴定过程往往繁琐耗时，需要经过多步实验操作，包括细菌培养、形态观察、生理生化试验等，这不仅增加了实验成本，也限制了鉴定效率。

传统方法对于某些表型特征相似的细菌种类往往难以准确区分，容易出现误判或漏判的情况。

传统方法对于新出现的、未知的或者难以培养的细菌种类往往束手无策，无法进行有效的鉴定。

随着分子生物学技术的发展和应用，人们开始尝试将分子生物学方法引入细菌分类鉴定领域，以期能够更快速、更准确地进行细菌鉴定。

分子生物学方法以其高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，为细菌分类鉴定提供了新的可能性和解决方案。

三、分子生物学方法在细菌分类鉴定中的发展与应用近年来，分子生物学技术的飞速发展极大地推动了细菌分类鉴定领域的研究进展。

这些技术以其高度的特异性和灵敏度，为细菌分类鉴定提供了全新的视角和强大的工具。

在细菌分类鉴定中，16S rRNA基因序列分析已成为最常用的方法之一。

16S rRNA基因在细菌中高度保守，同时又在不同种属间存在足够的变异，使得其成为细菌分类鉴定的理想靶标。

《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》一、引言乳酸细菌（Lactobacillus）是一类常见的益生菌，它们能帮助消化系统聪明，同时也可以通过促进有益的肠道微生物的生长来改善肠道健康。

因此，乳酸细菌的分类和鉴定对于研究乳酸细菌的功能和应用具有重要意义。

本文将首先介绍乳酸细菌的分类和鉴定，然后介绍乳酸细菌的实验方法。

二、乳酸细菌的分类和鉴定1. 乳酸细菌的分类乳酸细菌是属于细菌科（Bacteroidetes）的一类细菌。

它们可以分为三大类：乳酸菌（Lactobacillus）、乳酸乳球菌（Streptococcus）和乳酸变形杆菌（Bifidobacterium）。

每一类乳酸菌都有不同的特征，如形态、生长习性和生理功能。

2. 乳酸细菌的鉴定乳酸细菌的鉴定可以分成宏观鉴定和微观鉴定两种。

宏观鉴定可以从外观上分辨不同种类的乳酸细菌，其中包括形态、大小、色泽和膜结构等。

微观鉴定则是从细节上来识别乳酸细菌的特征，包括菌体的形态、菌落的形状、菌落的大小和染色等。

三、乳酸细菌的实验方法1. 样品采集乳酸细菌的实验方法首先要从样品的采集开始。

乳酸细菌的样品可以从食品、生物体表面、自然环境或肠道等环境中获取。

采集的样品应当及时保存，以防乳酸细菌的生长和繁殖。

2. 培养基制备乳酸细菌的培养基是乳酸细菌实验的基础，它可以保证乳酸细菌的生长和繁殖。

常用的乳酸细菌培养基有MRS培养基、MRS-glucose培养基和MRS-sucrose培养基等。

这些培养基中的成分可以满足乳酸细菌的需求，从而促进乳酸细菌的繁殖和活力。

3. 培养和筛选采集到的样品和制备好的培养基可以混合在一起，然后置于培养室中，根据规定的条件进行培养。

一旦乳酸细菌在培养基中获得了生长和繁殖的机会，就可以开始筛选。

筛选的过程可以通过诸如生长观察、生理鉴定和生化鉴定等方法来进行。

4. 分子鉴定最后，分子鉴定是乳酸细菌分类鉴定的最关键步骤。

分子鉴定可以通过PCR技术、限制性片段长度多态性分析（RFLP）和16S rRNA基因测序等方法准确地识别乳酸细菌的种类。

不同来源乳酸菌的分离与鉴定于晨龙;张七斤;陈光明;杨晓宇;吕天星;苏日娜【摘要】试验从传统乳制品、仔猪粪便及鸡肠道分离到6株乳酸菌,分别命名为LS、LT、LJ1、LJ2、LZ1、LZ2.通过细菌形态学、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析,对6株分离菌进行鉴定及研究.结果显示LS、LT、LJ1、LZ2菌株为短乳杆菌;LJ2菌株为粪肠球菌;LZ1菌株为嗜酸乳杆菌.这6株菌株对李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌效果.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)002【总页数】5页(P208-212)【关键词】乳酸菌;分离鉴定;16S rDNA【作者】于晨龙;张七斤;陈光明;杨晓宇;吕天星;苏日娜【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,农业部动物临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】S852.61目前由细菌引起的疾病一般都通过抗生素来治疗，但抗生素的滥用使得大部分细菌对其产生了不同程度的抗性，给疾病治疗及人类健康带来隐患。

寻找有益的抗生素替代品已成为亟待解决的问题，而以菌治菌的方法正日益被人们接受。

实践证明益生素是一种可直接饲喂动物并能促进动物肠道菌群平衡的微生态制剂，可部分替换抗生素作为饲料添加剂，有望解决抗生素残留问题及动物耐药问题，而在肠道众多菌种中，最具代表性的有益菌当属乳酸菌（罗慧等，2008）。

乳酸菌检测思考题与讨论乳酸菌检测思考题与讨论引言：乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，具有重要的生物学功能和应用价值。

乳酸菌不仅可以产生乳酸，还能够抑制有害菌的生长，增强人体免疫力，并对人体健康具有多种益处。

乳酸菌的检测对于食品、医药、农业等领域具有重要意义。

一、乳酸菌检测方法1. 培养基法：这是最常用的乳酸菌检测方法之一。

通过将样品接种到含有特定培养基的琼脂平板上，利用乳酸菌对特定营养物质的需求进行筛选和培养。

通过观察琼脂平板上是否出现特定形态和颜色的细菌落，可以初步判断样品中是否存在乳酸菌。

2. PCR法：PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，可以在短时间内扩增目标DNA片段。

通过设计特异性引物，可以选择性地扩增与乳酸菌相关的基因序列。

通过检测PCR反应产物的存在与否，可以判断样品中是否存在乳酸菌。

3. 酶法：乳酸菌在代谢过程中会产生一些特定的酶，如乳酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。

利用这些特定的酶可以进行乳酸菌的检测。

常用的方法有色谱法、比色法等。

二、乳酸菌检测的应用领域1. 食品行业：乳制品是乳酸菌最常见的应用领域之一。

通过对食品中乳酸菌含量的检测，可以评估产品质量和卫生安全，并指导生产工艺和储存条件的控制。

还可以通过检测食品中潜在致病菌和有害物质的含量来保障消费者健康。

2. 医药领域：乳酸菌具有调节肠道微生态平衡、增强免疫力等作用，在医药领域有广泛应用。

通过对患者粪便或血液样本中乳酸菌含量的检测，可以评估肠道健康状况，并指导医生制定个体化的治疗方案。

3. 农业领域：乳酸菌在农业领域中也有一定的应用价值。

通过检测土壤或植物体内乳酸菌的含量，可以评估土壤质量和植物健康状况，并指导农民合理施肥和防治病虫害。

三、乳酸菌检测中存在的问题与挑战1. 检测方法选择：不同的乳酸菌检测方法具有不同的灵敏度、特异性和操作难度。

在实际应用中，需要根据具体需求选择合适的检测方法。

同时，还需要考虑成本、时间等因素。

品质管理检测项目细菌形态学分类一乳酸杆菌乳酸杆菌的基本属性：乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。

利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。

这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。

利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。

因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。

无芽孢，革兰氏染色呈阳性。

微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。

在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。

（一）实验仪器和试剂：实验仪器：现有的仪器：欠缺的仪器：培养基和试剂：①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。

乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。

以上用量为1000ml培养基的用量。

溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。

工 业 技 术93科技资讯 S CI EN CE & T EC HNO LO GY I NF OR MA TI ON 乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的总称,主要包括乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、链球菌及双歧杆菌等。

1 乳酸菌的生理功能乳酸菌的生理功能主要有:(1)具有粘附性和定植能力。

(2)产生抑菌活性的代谢产物。

(3)降低胆固醇。

(4)具有抗变异原性。

(5)改善肝脏功能。

(6)增强免疫功能。

2 乳酸菌的类型乳酸菌大体上可分为两大类。

一类是动物源乳酸菌,一类是植物源乳酸菌。

3 材料与方法3.1材料3.1.1样品市售进口奶酪。

3.1.2培养基(1)MRS液体培养基:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵1.45g、K 2HPO 4·H 2O 2.6g、MgSO 4·7H 2O 0.58g、MnSO 4·4H 2O 0.25g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000mL。

(pH 6.2～6.4,121℃,灭菌20min)。

(2)BC G培养基:A 、B 液灭菌后混匀。

A 液:脱脂奶粉50g ,1.6%溴甲酚绿酒精液0.35m l ,蒸馏水250ml.(90℃,开盖灭菌10min).B液:酵母膏5g,琼脂10g,蒸馏水250ml。

(pH 6.8,121℃灭菌20min)A、B液灭菌后在无菌状态下混匀后倒平板。

3.2方法3.2.1样品的处理奶酪的处理:以无菌操作取奶酪1g ,放入含有9mL灭菌加热至含40℃左右的生理盐水的灭菌广口瓶内,待奶酪溶解制成1∶10的均匀稀释液,并用无菌生理盐水逐级稀释至10-3、10-4、10-5。

3.2.2乳酸菌的分离纯化采用B C G 牛乳培养基对稀释样品中的微生物通过平板倾注法进行分离纯化。

以无菌操作取奶酪稀释液10-3、10-4、10-5各0.1m L 置于灭菌后的平板中,加入15m L BCG牛乳培养基,带培养基凝固后放入恒温培养箱中,37℃恒温培养24h。