分析食品检验中乳酸菌的鉴定方法

1 范围本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。

本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。

2 规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。

3 术语和定义3.1 乳酸菌lactic acid bacteria一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。

本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lacto bacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。

4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1 恒温培养箱：36℃±1℃。

4.2 冰箱：2℃～5℃。

4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。

4.4 天平：感量0.1 g。

4.5无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

4.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。

4.7无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。

5 培养基和试剂5.1MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A.1。

5.2 MC培养基（Modified Chalmers培养基）：见附录A中A.2。

5.3 0.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.3。

5.4 0.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.3。

5.50.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.3。

5.6 0.5%甘露醇发酵管:见附录A中A.3。

5.7 0.5%水杨苷发酵管:见附录A中A.3。

5.8 0.5%山梨醇发酵管:见附录A中A.3。

5.9 0.5%乳糖发酵管:见附录A中A.3。

5.10七叶苷发酵管:见附录A中A.45.11革兰氏染色液：见附录A中A.5。

食品微生物之檢驗方法－乳酸菌之檢驗101年6月7日署授食字第1011902050號公告1. 適用範圍：本方法適用於食品中乳酸菌之檢驗。

2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以選擇性培養基培養及計數之方法。

2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。

每15分鐘落菌數不得超過15 C FU／培養皿。

2.2. 器具及材料2.2.1. 乾熱滅菌器。

2.2.2. 高壓滅菌釜。

2.2.3. 冰箱：能維持5 ± 3℃者。

2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0℃以內者。

2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差± 1.0℃以內者。

2.2.6. 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無菌操作者。

2.2.7. 天平：可稱量到2000 g ，靈敏度為0.1 g ；可稱量到120 g ，靈敏度為5 mg。

2.2.8. 旋渦混合器（Vortex mixer）。

2.2.9. 酸鹼度測定儀（pH meter）。

2.2.10. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。

2.2.11. 厭氧缸（Anaerobic jar）或厭氧培養箱：適用於厭氧培養者。

2.2.12. 吸管輔助器（Pipette aid）。

2.2.13. 吸管（Pipette）：已滅菌。

1 m L吸管應有0.01 m L之刻度； 5 m L及10 m L吸管應有0.1 m L刻度。

2.2.14. 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm ，深度約15 mm ，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他缺點。

2.2.15. 稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、99 m L及90 m L標記附蓋（栓）之可滅菌廣口瓶。

2.2.16. 藥勺、剪刀、小刀、壓舌板及鑷子：可滅菌或可拋棄式者。

2.2.17. pH試紙：範圍6-8。

2.2.18. 無菌濾膜：孔徑0.2 μm或以下之親水性醋酸纖維濾膜。

乳酸菌鉴定方法嘿，你问乳酸菌的鉴定方法哈。

那我们得先从形态学方面入手。

把含有乳酸菌的样本放在显微镜下观察。

乳酸菌的形状有点特别，大多数是杆状或者球状的。

就像一个个小卫士，在微观世界里排着队。

你可以看看它们的大小，一般都比较小，得仔细观察才能看清它们的模样。

有的乳酸菌还会连在一起，像一串串小珠子似的。

再说说菌落特征。

把乳酸菌接种到固体培养基上，让它们生长繁殖。

过一段时间后，你会看到培养基上长出了一个个小菌落。

乳酸菌的菌落通常比较小，而且表面光滑、湿润。

有点像小小的露珠落在培养基上。

颜色一般是白色或者乳白色的，看起来很干净。

接着讲讲生化反应鉴定。

乳酸菌能发酵一些糖类，比如葡萄糖、乳糖等。

我们可以通过检测它们发酵糖类产生的产物来鉴定。

比如检测有没有产生乳酸，因为乳酸菌的名字可不是白叫的，它们可是产乳酸的能手。

可以用一些化学试剂来检测，要是试剂变色了，那就说明产生了乳酸。

还有一个方法是通过分子生物学技术来鉴定。

这就有点像用高科技手段来识别乳酸菌。

提取乳酸菌的DNA，然后用特定的引物进行PCR 扩增。

就像给乳酸菌的DNA 做个标记，这样就能准确地知道是不是乳酸菌了。

我给你讲个事儿哈。

在一家做酸奶的工厂里，他们很关心酸奶里的乳酸菌。

有一次，他们怀疑酸奶里的乳酸菌有点问题，就开始进行鉴定。

先把酸奶样品放在显微镜下看，发现有很多球状的小东西，看着像是乳酸菌。

然后把样品接种到培养基上，长出了好多小菌落，菌落的特征和乳酸菌的很像。

接着他们又做了生化反应测试，发现这些菌确实能发酵乳糖产生乳酸。

最后还不放心，又用分子生物学技术验证了一下，确定就是乳酸菌。

这样他们就放心了，知道自己的酸奶里有足够的、正宗的乳酸菌。

在鉴定乳酸菌的时候，每一个方法都很重要。

就像我们认识一个人，要从不同的方面去了解。

不能只看外表，还得看看他的行为、习惯等。

鉴定乳酸菌也是一样，综合运用这些方法，才能准确地鉴定出乳酸菌。

而且操作过程要仔细，不能马虎，不然就可能得出错误的结论。

中华人民共和国国家标准G B4789.35 2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会前言本标准代替G B4789.35 2010‘食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验“㊁S N/T1941.1 2007‘进出口食品中乳酸菌检验方法第1部分:分离与计数方法“㊂本标准与G B4789.35 2010相比,主要变化如下:增加了乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明;修改了改良M R S培养基成分;修改了平板计数的接种方法和接种量㊂食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验1范围本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(l a c t i c a c i db a c t e r i a)的检验方法㊂本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验㊂2术语和定义2.1乳酸菌l a c t i c a c i db a c t e r i a一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称㊂本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(L a c t o b a c i l l u s)㊁双歧杆菌属(B i f i d o b a c t e r i u m)和嗜热链球菌属(S t r e p t o c o c c u s)㊂3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂3.2冰箱:2ħ~5ħ㊂3.3均质器及无菌均质袋㊁均质杯或灭菌乳钵㊂3.4天平:感量0.01g㊂3.5无菌试管:18mmˑ180mm㊁15mmˑ100mm㊂3.6无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂3.7无菌锥形瓶:500m L㊁250m L㊂4培养基和试剂4.1生理盐水:见A.1㊂4.2 M R S(M a nR o g o s aS h a r p e)培养基及莫匹罗星锂盐(L i-M u p i r o c i n)和半胱氨酸盐酸盐(C y s t e i n eH y d r o c h l o r i d e)改良M R S培养基:见A.2和A.3㊂4.3 M C培养基(M o d i f i e dC h a l m e r s培养基):见A.4㊂4.40.5%蔗糖发酵管:见A.5㊂4.40.5%纤维二糖发酵管:见A.5㊂4.60.5%麦芽糖发酵管:见A.5㊂4.70.5%甘露醇发酵管:见A.5㊂4.80.5%水杨苷发酵管:见A.5㊂4.90.5%山梨醇发酵管:见A.5㊂4.100.5%乳糖发酵管:见A.5㊂4.11七叶苷发酵管:见A.6㊂4.12革兰氏染色液:见A.7㊂4.13莫匹罗星锂盐(L i-M u p i r o c i n):化学纯㊂4.14半胱氨酸盐酸盐(C y s t e i n eH y d r o c h l o r i d e):纯度>99%㊂5检验程序乳酸菌检验程序见图1㊂图1乳酸菌检验程序图6操作步骤6.1样品制备6.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序㊂6.1.2冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂6.1.3固体和半固体食品:以无菌操作称取25g样品,置于装有225m L生理盐水的无菌均质杯内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,制成1ʒ10样品匀液;或置于225m L生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n制成1ʒ10的样品匀液㊂6.1.4液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25m L放入装有225m L生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1ʒ10的样品匀液㊂6.2 步骤6.2.1 用1m L 无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L ,沿管壁缓慢注于装有9m L 生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂6.2.2 另取1m L 无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1m L 灭菌吸管或吸头㊂6.2.3 乳酸菌计数6.2.3.1 乳酸菌总数乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1㊂表1 乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明样品中所包括乳酸菌菌属培养条件的选择及结果说明仅包括双歧杆菌属按G B4789.34的规定执行仅包括乳杆菌属按照6.2.3.4操作㊂结果即为乳杆菌属总数仅包括嗜热链球菌按照6.2.3.3操作㊂结果即为嗜热链球菌总数同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属1) 按照6.2.3.4操作㊂结果即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作同时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.2和6.2.3.3操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 6.2.3.3结果为嗜热链球菌总数;3) 6.2.3.4结果为乳杆菌属总数同时包括双歧杆菌属,乳杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作6.2.3.2 双歧杆菌计数根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的M R S 培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ厌氧培养72h ʃ2h ,培养后计数平板上的所有菌落数㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.2.3.3 嗜热链球菌计数根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的M C 培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ需氧培养72h ʃ2h ,培养后计数㊂嗜热链球菌在M C 琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径2m mʃ1m m ,菌落背面为粉红色㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.2.3.4 乳杆菌计数根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的M R S 琼脂培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ厌氧培养72h ʃ2h ㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.3菌落计数注:可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量㊂菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y-f o r m i n g u n i t s,C F U)表示㊂6.3.1选取菌落数在30C F U~300C F U之间㊁无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数㊂低于30C F U 的平板记录具体菌落数,大于300C F U的可记录为多不可计㊂每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数㊂6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数㊂6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数㊂6.4结果的表述6.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果㊂6.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N=ðC(n1+0.1n2)d (1)式中:N 样品中菌落数;ðC 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂6.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300C F U,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算㊂6.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂6.4.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算㊂6.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30C F U~300C F U之间,其中一部分小于30C F U或大于300C F U时,则以最接近30C F U或300C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂6.5菌落数的报告6.5.1菌落数小于100C F U时,按 四舍五入 原则修约,以整数报告㊂6.5.2菌落数大于或等于100C F U时,第3位数字采用 四舍五入 原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按 四舍五入 原则修约后,采用两位有效数字㊂6.5.3称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告㊂7结果与报告根据菌落计数结果出具报告,报告单位以C F U/g(m L)表示㊂8乳酸菌的鉴定(可选做)8.1纯培养挑取3个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于M C琼脂平板,乳杆菌属接种于M R S琼脂平板,置36ħʃ1ħ厌氧培养48h㊂8.2鉴定8.2.1双歧杆菌的鉴定按G B4789.34的规定操作㊂8.2.2涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状㊁弯曲杆状或短杆状㊂无芽胞,革兰氏染色阳性㊂嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为0.5μm~2.0μm,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性㊂8.2.3乳酸菌菌种主要生化反应见表2和表3㊂表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应菌种七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖干酪乳杆菌干酪亚种(L.c a s e i s u b s p.c a s e i)+++++++-德氏乳杆菌保加利亚种(L.de l b r u e c k i is u b s p.b u l g a r i c u s)--------嗜酸乳杆菌(L.a c i d o p h i l u s)+++-+-+d 罗伊氏乳杆菌(L.r e u t e r i)N D-+---++鼠李糖乳杆菌(L.r h a m n o s u s)+++++++-植物乳杆菌(L.p l a n t a r u m)++++++++注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%菌株阳性;N D表示未测定㊂表3嗜热链球菌的主要生化反应菌种菊糖乳糖甘露醇水杨苷山梨醇马尿酸七叶苷嗜热链球菌(S.t h e r m o p h i l u s)-+-----注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性㊂附录A培养基及试剂A.1生理盐水A.1.1成分N a C l8.5gA.1.2制法将上述成分加入到1000m L蒸馏水中,加热溶解,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.2M R S培养基A.2.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐温801.0m LK2H P O4㊃7H2O2.0g醋酸钠㊃3H2O5.0g柠檬酸三铵2.0gM g S O4㊃7H2O0.2gM n S O4㊃4H2O0.05g琼脂粉15.0gA.2.2制法将上述成分加入到1000m L蒸馏水中,加热溶解,调节p H至6.2ʃ0.2,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.3莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良M R S培养基A.3.1莫匹罗星锂盐储备液制备:称取50m g莫匹罗星锂盐加入到50m L蒸馏水中,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌㊂A.3.2半胱氨酸盐酸盐储备液制备:称取250m g半胱氨酸盐酸盐加入到50m L蒸馏水中,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌㊂A.3.3制法将A.2.1成分加入到950m L蒸馏水中,加热溶解,调节p H,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至48ħ,用带有0.22μm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中,使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50μg/m L,半胱氨酸盐酸盐的浓度为500μg/m L㊂A.4M C培养基A.4.1成分大豆蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g酵母粉3.0g葡萄糖20.0g乳糖20.0g碳酸钙10.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m L1%中性红溶液5.0m LA.4.2制法将前面7种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节p H至6.0ʃ0.2,加入中性红溶液㊂分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.5乳酸杆菌糖发酵管A.5.1基础成分牛肉膏5.0g蛋白胨5.0g酵母浸膏5.0g吐温800.5m L琼脂1.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4m L蒸馏水1000m LA.5.2制法按0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.6七叶苷培养基A.6.1成分蛋白胨5.0g磷酸氢二钾1.0g七叶苷3.0g枸橼酸铁0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4m L蒸馏水100m LA.6.2制法将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.7革兰氏染色液A.7.1结晶紫染色液A.7.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20m L1%草酸铵水溶液80m LA.7.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.7.2革兰氏碘液A.7.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.7.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.7.3沙黄复染液A.7.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10m L蒸馏水90m LA.7.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.7.4染色法A.7.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1m i n,水洗㊂A.7.4.2滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂A.7.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A.7.4.4滴加复染液,复染1m i n㊂水洗㊁待干㊁镜检㊂。

食品检验中乳酸菌的鉴定方法新思考摘要：食品是人们生存不可或缺的重要物品，对人们的身体健康等方面具有重要的影响。

因此需要对食品进行相应的检验，明确其中的成分和含量，从而保障食品的卫生和安全。

其中对乳酸菌进行检定具有重要意义，关于鉴定方法应引起相关工作人员的重视。

关键词：食品检验；乳酸菌；鉴定方法一、研究背景乳酸菌具有较多的种类，并且具有较多的用途。

当前阶段主要广泛应用到婴幼儿的食品以及保健食品中，为保障使用者的身体健康和生命安全，对食品中含有的乳酸菌种类、含量等进行鉴定具有一定的必要性。

通过添加乳酸菌有利于视屏的营养价值提高，并且对食品味道和储藏等具有较好的改善作用，因此其在食品生产行业得到了广泛的应用，并具有较高的应用价值。

乳酸菌具有调节肠道的功能，并且有利于人体血清胆固醇的降低，因此可以起到较好的预防疾病、保障人体健康的作用。

通过对食品中含有的乳酸菌进行鉴定，可以明确乳酸菌的种类及含量，受乳酸菌自身形态的影响，可通过理化特征、生物特征等均分乳酸菌并进行相应的鉴定，从而使乳酸菌的应用符合相关的规定，应用范围具有合理性进而保障其使用功能的充分发挥。

有利于促进食品检验行业的进一步发展，切实保障使用者的身体健康、生命安全。

二、乳酸菌及鉴定相关概述乳酸菌可通过将碳水化合物发酵形成乳酸，本质上是一种细菌，具有较多的种类，并且分布范围相对广泛。

当前已经有上百种的乳酸菌种类被人们所知，其中大部分的种类对人体的肠道运行具有较好的促进作用，并有利于对人体的机能进行调整。

可将乳酸菌分成以下几个类型，即动物源乳酸菌、植物源乳酸菌。

其中植物源乳酸菌更易被人体认可和接受，植物源乳酸菌具有较高的活性，因此应用到人体中发挥的生物功效更具稳定性。

对乳酸菌进行鉴定，主要是依据不同种类的乳酸菌其形态、生物特征和理化特征等方面也不相同，因此通过现代化的方法对其进行检测，便可明确食品中所含的乳酸菌的类型、含量。

当前阶段主要通过以下两种方法对食品中的乳酸菌进行鉴定，其一便是通过生理生化的方法进行鉴定。

食品微生物学检测乳酸菌检测方法设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1.1恒温培养箱：36℃±1℃1.2冰箱：2℃~5℃1.3均质器及无菌均值袋、均质杯或灭菌乳钵1.4天平：感量0.1g1.5无菌试管：18mm⨯180mm、15mm⨯100mm1.6菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.01mL刻度）或微量移无液器及吸头1.7无菌锥形瓶：500mL、250mL1.样品制备2.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

2.2冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻，时间不超过8h，也可在温度不超过45℃的条件下解冻，时间不超过15min。

2.3固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10样品匀液。

2.4液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。

操作步骤3.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸头尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌试管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

3.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

2.乳酸菌总数：根据待检样品活菌总数的估计，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。

36℃±1℃，厌氧培养48h±2h后计数平板上所有菌落数。

食品中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌是一类重要的微生物，在食品加工和保质过程中起着关键作用。

乳酸菌具有产生乳酸的能力，能够抑制有害菌的生长，提高食品的质量和安全性。

因此，乳酸菌的分离与鉴定对于食品工业具有重要意义。

乳酸菌的分离方法多种多样，常用的有直接涂布法、稀释涂布法和差减分离法等。

其中，直接涂布法是最常用的方法之一。

直接涂布法是将食品样品均匀涂布于含有特定培养基的琼脂平板上，利用乳酸菌对特定培养基的选择性生长来分离乳酸菌。

稀释涂布法则是将食品样品稀释到一定程度后，涂布于琼脂平板上进行分离。

差减分离法是相对于稀释涂布法的一种改进方法，通过两个不同培养基的对比，进一步筛选出乳酸菌。

乳酸菌的鉴定方法主要包括形态学观察、生理生化特性鉴定和分子生物学鉴定等。

形态学观察是最基本的鉴定手段之一，通过显微镜观察菌落和细胞形态特征，可以初步判断出乳酸菌的种类。

生理生化特性鉴定是将分离出的菌株在不同条件下进行相关实验，如气体产生、温度耐受性、胞外酶产生等，通过对比不同特性的表现，进一步鉴定乳酸菌的种类。

而分子生物学鉴定则能够更准确地确定乳酸菌的种属和亚属，如通过PCR扩增特定基因序列，利用DNA测序技术进行序列比对，从而鉴定乳酸菌的种类。

乳酸菌的分离与鉴定在实际食品加工中具有重要意义。

首先，通过分离和鉴定乳酸菌，可以确定食品中乳酸菌的种类和数量，进而判断食品是否存在质量和安全性问题。

其次，乳酸菌的鉴定有助于选择合适的培养条件，促进乳酸菌的生长和产酸过程，从而提高食品品质。

此外，乳酸菌的鉴定也有利于乳品行业中的产品研发和工艺改进，为创新和提高乳制品的营养和口感贡献力量。

然而，乳酸菌的分离与鉴定也面临一些挑战。

首先，食品中的乳酸菌种类繁多，分离出纯种菌株的难度较大。

其次，乳酸菌的生理生化特性相似，需要较为精确的实验手段和技术设备来进行鉴定。

此外，乳酸菌与其他微生物的相互作用也需要考虑，有时候必须结合其他鉴定方法才能得出准确结论。

食品检验中乳酸菌鉴定方法的探讨作者：周卫华来源：《中小企业管理与科技·上中下旬刊》 2018年第6期食品检验是关乎人民身体健康与生命安全的重要工作，通过对食品检验标准与方法的不断完善，能够为食品安全与健康提供保障。

论文阐述了乳酸菌及其鉴定的相关理论，简要叙述了目前我国使用的乳酸菌鉴定标准，重点分析了食品检验中不同种类的乳酸菌鉴定方法，旨在明确食品检验中乳酸菌鉴定的地位与鉴定方式，为食品安全检验工作奠定更加丰富的基础。

食品检验；乳酸菌；鉴定方法【中图分类号】TS252.1 【文献标志码】A 【文章编号】1673-1069（2018）06-0169-021 引言乳酸菌种类繁多、应用广泛，目前在保健食品、婴幼儿食品生产中被广泛应用，对乳酸菌种类和水平进行鉴定是保证食品安全的重要前提。

乳酸菌在提升食品营养价值的同时，还能够改善食品的味道、储藏性能等，在食品生产领域具有广泛的应用价值。

乳酸菌能够有力地调节人体的肠道功能，同时还能够降低人体的血清胆固醇，对保证人体健康、预防疾病具有积极意义。

乳酸菌鉴定能够对乳酸菌的种类及指标进行明确，基于乳酸菌的形态、理化及生物特征对乳酸菌进行区分和鉴定，是保证乳酸菌应用范围和效果的重要前提，能够为食品检验和乳酸菌应用范围拓展，提供巨大助力。

根据实际工作需求选取针对性的鉴定方法，是促进生产和检验工作效率的重要前提。

2 乳酸菌及鉴定相关概述乳酸菌是能够利用可发酵碳水化合物形成大量乳酸的细菌的统称，其种类十分多样，并且在自然界当中的分布十分广泛。

目前，已知的乳酸菌类型有200 多种，并且绝大部分在人体肠道运行中发挥着作用，对调节人体机能具有重要意义[1]。

乳酸菌主要可以分为两大类型，分别是动物源乳酸菌和植物源乳酸菌，相对来说人体对于植物源乳酸菌的认可与接受能力更强，并且由于植物源乳酸菌的活性较高，能够在人体中发挥稳定的生物功效。

乳酸菌鉴定是指以不同种类乳酸菌的形态、理化及生物特征为依据，采用现代化的检测方法，明确乳酸菌的类型与含量等信息。

FOOD INDUSTRY探讨食品检验中乳酸菌的鉴定方法+李曦胳佳岚王翌晨丨西安市产品质量监督检验院■《食品安全国家标准食品微生物学检验 "1/5乳酸菌检验》标准所示，乳酸菌（lactic acid bacteria，L A B)主要有乳杆菌、链球菌以 及双歧杆菌三种菌属，并在食品、药品中广泛 存在。

为响应国家对食品安全的监管，本文特 从不同角度鉴定食品中的乳酸菌菌种水平，详 细研究过程如下：资料与方法一般资料。

本次研究所有菌种均采自某市 微生物菌种保藏中心，共计15株。

其中乳酸杆 菌6株，双歧杆菌7株，链球菌2株。

鉴定仪器：（1 )API鉴定系统、API 50 CHL板条、API 20A板条（生产厂家：法 国生物梅里埃公司）；（2 )RP耗材样品制 备包（生产厂家：美国杜邦公司）；（3) 生化管（生产厂家：杭州滨和微生物）；(4 )R iboprinter^：_a微生物基因指纹鉴定 系统（生产厂家：美国Dupont公司）；（5 ) Quantity O ne紫外成像仪、电泳仪（生产厂 家：美国BioRad公司）；（6 )Veritii PCR扩 增仪（生产厂家：美国ABI公司），体积为 50 n L[2]。

鉴定试剂：（1)细菌基因组D N A 提取试剂盒（生产厂家：北京天根生物）；（2 )DNA M ark er、PC R缓冲体系 (缓冲液5 m L,含M gC12 )以及rTaqDNA 聚合酶（生产厂家：大连宝生物工程有限公司）0.25u L;(3)正向引物27F (5’ -AGAGnTGATCCTGGCrCAG-3，）、反向 引物1492R(5’-TACGGCDWXTTGTIACIT-3，)各200pmol/L。

鉴定方法。

染色镜检：根据《食品安全 国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中乳 酸菌的生化反应指标，筛选单菌落革兰染色镜 检。

根据《食品安全国家标准食品微生物学检 验双歧杆菌的鉴定》检验双歧杆菌。

乳酸菌检验的方法要点乳酸菌不是分类学上的名称，它是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳糖产生乳酸、需氧和兼性厌氧、多数无动力、过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性的无芽孢杆菌和球菌。

这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。

乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23个属的细菌。

乳酸菌的检测流程：1、乳酸菌悬液的制备：将待检测的样品，准确称取0.5克，量取99.5mL无菌生理盐水稀释，（此次稀释了200倍，即0.5克样品，稀释到了100克水溶液），再加入灭菌玻璃珠20～30粒于250mL三角瓶中，置于振荡器或摇床上剧烈摇晃30分钟以上，目的是将粘连在一起的乳酸菌细胞打散从而分散开来。

2、稀释到适当倍数：根据所待检测的样品可能的乳酸菌含量，进行适当的稀释操作，例如如果估计样品的含乳酸菌活菌数为200亿/克左右，则建议稀释2亿倍，这样将来在90mm平板上培养时会长出大约100个乳酸菌落，比较便于计数，总之控制平板培养皿上的乳酸菌落数量在30～300个的范围内，比较便于计数。

3、倒制平板即“接种”：倒制平板在超净工作台上进行，养殖户可使用一盏简单的酒精灯和一个干净的操作台就可操作。

即事先配制好并灭菌处理的检测用琼脂培养基，在水浴锅内保持50℃的温度，使琼脂培养基呈溶解状态，置于操作台旁边备用。

（养殖户可先不从压力锅中取出，在压力锅维持一定的温度，从而也不会凝固。

）取事先干热灭菌处理后的90mm培养皿（也叫平板）若干、1mL移液管若干，置于操作台上备用。

（养殖户的培养皿平板可在压力锅中进行蒸汽灭菌处理。

）在无菌条件下（打开超净工作台无菌风，或养殖户点上酒精灯），将稀释了2亿倍的乳酸菌液，用移液管移取1mL，于培养皿中，再在此培养皿中倒入前述保持溶解状态的检测培养基液15mL左右（倒培养基时，估计能覆盖满平皿的液体量即可），然后，盖好培养皿盖，轻轻转动平皿，原地转几圈，使培养基液与乳酸菌液混合均匀，等数分钟后，待培养基凝固后，可移入培养箱中进行培养；4、在培养箱中进行培养：将前面倒制好的平板倒转（即盖子在下面），放于培养箱中于33℃温度下培养2～3天，待培养皿平板中长出比较明显的带有透明圈的菌落时，即可进行计数得出检测结果。

食品中乳酸菌数的检验技术【相关支撑知识】乳酸菌是一类能发酵利用糖类物质而产生大量乳酸的细菌，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽孢杆菌和球菌。

在含糖丰富的食品中，因其不断产生乳酸使得环境变酸而杀死其他不耐酸的细菌。

大部分乳酸菌具有很强的抗盐性，能耐5％以上的NaCl浓度。

常见的乳酸菌都不具有细胞色素氧化酶，所以一般不会使硝酸盐还原为亚硝酸盐；乳酸菌也不具有氨基酸脱羧酶，不产生胺类物质，也不产生吲哚和H2S。

一般乳酸菌不分泌蛋白酶，只有肽酶，不能利用蛋白酶而仅能利用蛋白胨、肽和氨基酸。

合成氨基酸、核酸、维生素的能力极低，因而在乳酸菌生长的环境中适量地加入这类物质，能促进其正常生长。

1.乳酸菌的种类及特征乳酸菌从形态上分类主要有球状和杆状两大类。

按照生化分类法，乳酸菌可分为乳秆菌属、链球菌属、明串珠菌属、双歧杆菌属和汁球菌属5个属，每个属又有很多菌种，某些菌种还包括数个亚种。

乳杆菌属的乳酸菌形态多样，有长的、细长的、短杆状、棒形球杆状及弯曲状等（见图7-1-1）。

革兰氏阳性无芽孢菌。

微需氧，在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或充及5～10%CO时，可增加其表面生长2物。

发酵代谢，专性分解糖。

产生大量乳酸和乳酸盐。

生长温度2～53℃，最适生长温度30～40℃。

在发酵工业中应用的主要有:同型发酵乳秆菌，如德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳秆菌、嗜酸乳秆菌和干酪乳杆菌;异型发酵乳杆菌，如短乳秆菌和发酵乳杆菌。

链球菌属乳酸菌一般呈短链或长链状排列，为无芽孢的革兰氏阳性菌，兼性厌氧。

发酵葡萄糖的主要产物是乳酸，但不产气。

触酶阴性，通常溶血。

生长温度为25～45℃，最适温度为37℃。

生产中常用的主要有:乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌、乳酪链球菌和嗜热乳链球菌等。

明串珠菌属大多呈圆形或卵圆形的链状排列，常存在于水果和蔬菜中，能在高浓度的含糖食品中生长。

该菌属的乳酸菌均是异型发酵菌。

常见的有:肠膜明串珠菌及其乳脂亚种和葡萄糖亚种、嗜橙明串珠菌、乳酸明串珠菌和酒明串珠菌，尤以肠膜明串珠菌的乳脂亚种最为常见，它可发酵柠檬酸而产生特征风味物质，又称风味菌、香气菌和产香菌。

乳酸菌分离鉴定及试验方法
乳酸菌的分离鉴定主要包括以下步骤：
1. 菌落筛选：根据菌落的颜色、大小、光泽度和透明程度，挑取含溶钙圈的单菌落。

2. 分离纯化：在MRS或Elliker固体培养基上反复划线分离，直到分离到纯的单一菌落。

3. 革兰氏染色：镜检观察菌体颜色、大小、形状和排列方式。

4. 过氧化氢酶实验：将革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步认定为乳酸菌。

5. 保藏：用终浓度为25%甘油冻存管进行菌株的保藏，置于-80℃冰箱中保存备用。

乳酸菌的试验方法主要包括以下步骤：
1. 耐酸性优良菌株筛选试验：将分离纯化的乳酸菌和实验室耐酸性较好的WHH544接种到MRS液体培养基中，接种量为2%，于37℃培养箱中培养24小时，连续活化2代后，以6000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀菌体用灭菌生理盐水洗涤、离心2次后，通过麦氏比浊法调整菌悬液浓度为×108CFU/mL。

2. 其他试验：根据具体研究需求进行相关试验，例如通过不同条件培养，观察菌株生长情况；或通过发酵实验，测定乳酸菌的产酸能力等。

以上内容仅供参考，建议查阅专业微生物学书籍或文献获取更全面和准确的信息。