3-1核酸分离

第1篇一、实验目的1. 掌握小鼠肝组织中核酸的提取方法。

2. 了解DNA和RNA的组成差异及其鉴定方法。

3. 掌握防止核酸酶降解的措施。

4. 分析实验结果，验证实验方法的有效性。

二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，包括DNA和RNA两种类型。

DNA主要存在于细胞核中，负责遗传信息的存储和传递；RNA则参与蛋白质的合成和调控等生物学过程。

本实验旨在从小鼠肝组织中提取核酸，并对其进行鉴定和分析。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肝脏、小牛胸腺细胞、氯化钠、柠檬酸钠、盐酸、硫酸、3，5-二羟甲苯、二苯胺、无水乙醇、氯仿等。

2. 实验仪器：高速冷冻离心机、电子天平、研磨器、恒温水浴锅、移液器、离心管等。

四、实验方法1. 小鼠肝匀浆制备：（1）取新鲜小鼠肝脏，用生理盐水洗净，去脂。

（2）将肝脏剪成小块，加入适量的生理盐水，用研磨器进行研磨。

（3）将研磨好的肝匀浆转移至离心管中，离心去除细胞碎片。

（4）收集上清液，即为肝匀浆。

2. 核酸提取：（1）取适量的肝匀浆，加入适量的氯化钠溶液，混匀。

（2）加入柠檬酸钠溶液，混匀，置于冰浴中10分钟。

（3）加入等体积的氯仿，混匀，静置10分钟。

（4）将混合液转移至新的离心管中，离心，收集上层水相。

（5）加入等体积的无水乙醇，混匀，静置30分钟。

（6）将混合液转移至新的离心管中，离心，收集沉淀。

（7）用75%乙醇洗涤沉淀，离心，收集沉淀。

3. DNA和RNA的鉴定：（1）取适量的DNA沉淀，加入适量的盐酸和硫酸，共热，观察颜色变化。

（2）取适量的RNA沉淀，加入适量的3，5-二羟甲苯和二苯胺，共热，观察颜色变化。

4. 防止核酸酶降解：（1）选取核酸酶含量较低的材料，如小牛胸腺细胞等。

（2）在制备肝匀浆时，应尽量在冰冷条件下进行。

（3）尽快加入含0.01 mol/L柠檬酸钠的0.14 mol/L氯化钠溶液，以抑制脱氧核糖核酸酶。

五、实验结果与分析1. 肝匀浆制备成功，细胞破碎充分。

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

主要是CTAB 方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。

2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。

4、加入25ul蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml混匀，50℃水浴3h5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。

加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。

加入等体积的异丙醇。

室温10min。

2500rpm离心10min。

弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。

-20℃20min。

9、12000r/min室温离心5min。

弃上清。

将DNA溶于适量TE中。

二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

中国生物电泳网专业销售维修：各种电泳槽/电泳仪/紫外仪等电5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

Chapter 4 Nucleic acids专业________ 学号_________ 姓名________ 成绩________一、填空题（20分，每空0.5分）1. 核酸可分为和两大类，前者主要存在于真核细胞的和原核细胞的部位，后者主要存在细胞的部位。

(DNA,RNA,细胞核,拟核区，细胞质) 2. 构成核酸的基本单位是，由，和连接而成。

(核苷酸，碱基，戊糖，磷酸)3. 在各种RNA中，含量最多，含稀有碱基最多，半寿期最短。

(rRNA,tRNA,mRNA)4. 维持DNA的双螺旋结构稳定的作用力有，，。

(碱基堆积力，氢键，离子键)5. 组成DNA的两条多核苷酸链是的，两链的碱基序列，其中与配对，形成两对氢键，与配对，形成三对氢键。

（反向平行，互补配对，A,T，C,G）6. 当温度逐渐升高到一定的高度时，DNA双链，称为。

当“退火”时，DNA的两条链，称为。

（打开，变性，重新配对，复性）7. 核酸在复性后260nm波长的紫外吸收，这种现象称为效应。

（变性，减小，减色）8. tRNA的二级结构呈形，三级结构的形状象。

（三叶草。

倒“L”）9. 富含的DNA比富含的DNA具有更高的溶解温度。

（GC，AT）10.DNA的双螺旋结构模型是和于1953年提出的。

（Watson，Crick）11.DNA的T m值大小与三个因素有关，它们是，，。

（GC对，DNA均一性，溶液离子强度）12.PCR是通过、和三个步骤循环进行DNA扩增的。

（变性，退火，延伸）二、选择题（20分）1. 细胞内游离核苷酸分子的磷酸基团通常连接在糖的什么位置上？（）aa. C5’b. C3’c. C2’d. C1’2. 关于双链DNA碱基含量的关系哪个是错误的？( )ba. A=Tb. A+T=G+Cc. C=Gd. A+G=C+T3. 下列关于DNA的叙述哪项是错误的？( )ba. 两条链反向平行b. 所有生物中DNA均为双链结构c. 自然界存在3股螺旋DNAd. 分子中稀有碱基很少4. Southern印记法是利用DNA与下列何种物质之间进行分子杂交的原理？（）da. RNAb. 蛋白质c. 氨基酸d. DNA5. RNA分子中常见的结构成分是（）ba. AMP、CMP和脱氧核糖b. GMP、UMP和核糖c. TMP、AMP和核糖d. UMP、CMP和脱氧核糖6. 热变性的DNA（）aa. 紫外吸收增加b. 磷酸二酯键断裂c. 形成三股螺旋d. (G+C)含量增加7. DNA的Tm与介质的离子强度有关，所以DNA制品应保存在（）aa. 高浓度的缓冲液中b. 低浓度的缓冲液中c. 纯水中d. 有机溶液中8. 下面关于核酸的叙述中不正确的是( )ca. 在嘌呤和嘧啶之间存在着碱基对b. 当胸腺嘧啶与嘌呤配对时，由于甲基阻止氢键形成而导致碱基配对效率下降c. NaOH溶液只能水解DNA，不能水解RNAd. 在DNA分子总有氢键连接的碱基平面与螺旋平行9. 在适宜条件下，核酸分子的两条链能否自行杂交，取决于：（）da. DNA的熔点b. 序列的重复程度c. 核酸链的长短d. 碱基序列的互补10.DNA与RNA两类核酸分类的主要依据是：（）ca. 空间结构不同b. 所含碱基不同c. 所含戊糖不同d. 细胞中的位置不同11. 在核酸分子中核苷酸残基之间的连接方式为（）ca. 2’,3’-磷酸二酯键b. 氢键c. 3’,5’-磷酸二酯键d. 糖苷键12.DNA复性的重要标志是（）da. 溶解度降低b. 溶液黏度降低c. 紫外吸收增大d. 紫外吸收降低13.分离出某病毒核酸的碱基组成为A=27%,G=30%,C=22%,T=21%,该病毒为（）aa. 单链DNAb. 双链DNAc. 单链RNAd. 双链RNA14.DNA复制时，序列5’-TpApGpAp-3’将合成下列哪种互补结构？（）aa. 5’-TpCpTpAp-3’b. 5’ApTpCpTp-3’c.5’-UpCpUpAp-3’d.5’-GpCpGpAp-3’15.核酸对紫外线的吸收是由哪一结构所产生的（）ca. 磷酸二酯键b. 核糖c. 嘌呤嘧啶环上的共轭双键d. 核苷键16.在Watson-Crick的DNA结构模型中，下列正确的是（）aa. 双股链的走向是反向平行的b. 嘌呤和嘌呤配对，嘧啶和嘧啶配对c. 碱基之间共价结合d. 磷酸戊糖主链位于螺旋内侧17.DNA变性的原因是（）da. 磷酸二酯键断裂b. 多核苷酸解聚c. 碱基的甲基化修饰d. 互补碱基之间的氢键断裂18.下列关于RNA的叙述哪一项是错误的（）ca. RNA不仅只有是单链的形式存在的b. tRNA是最小的一种RNAc. 胞质中只有一种RNA，即mRNAd. 组成核糖体的主要是rRNA19. 原核生物核体为（）aa.70Sb.80Sc.60Sd.50S20.下列核酸中稀有碱基或修饰核苷相对含量最高的是（）ca. DNAb. rRNAc. tRNAd. mRNA三、是非题（5分）√（）1. DNA和RNA都易溶于水而难溶于有机溶剂√（）2. 不同生物的DNA碱基组成各不相同，同种生物的不同组织器官中DNA组成均相同（）3. 在1mol/L NaOH溶液中，RNA和DNA同样不稳定，易被水解成单核苷酸。

基因分离定律适用范围只有进行有性生殖的真核生物才适用，原核细胞和细胞质遗传均不适用。

揭示的是亲代细胞核．中染色体上的基因，通过有性生殖随配子传递给子代的规律。

致死基因（lethal gene）：导致个体或细胞死亡的基因称致死基因。

1、配子致死（gametic lethal）：致死配子期发挥作用而致死。

例题1：某种雌雄异株的植物有宽叶和窄叶两种类型，宽叶由显性基因B控制，窄叶由隐性基因b控制，B和b均位于X染色体上。

基因b使雄配子致死。

请回答：（1）若后代全为宽叶雄株个体，则其亲本基因型为。

（2）若后代全为宽叶，雌、雄植株各半时，则其亲本基因型为。

（3）若后代全为雄株，宽、窄叶个体各半时，其亲本基因型为。

（4）若后代性比为1︰1，宽叶个体占3/4，则其亲本基因型为。

（1）X B X B、X b Y（2）X B X B、X B Y（3）X B X b、X b Y（4）X B X b、X B Y2．合子致死（zygotic lethal）：致死基因在胚胎期或成体阶段致死。

1907年Cuenot发现小鼠中黄鼠不能真实遗传，不论黄鼠与黄鼠杂交，还黄鼠与黑鼠相交，子代都出现分离：黄鼠x 黑鼠黄鼠2378，黑鼠2398黄鼠x 黄鼠黄鼠2396，黑鼠1235从上面第一个交配看来，黄鼠很象是杂种，因为与黑鼠的交配结果，下代分离为1：1，如果黄鼠是杂合体，则黄鼠与黄鼠交配，子代的分离比应该是3：1，可是从上面的第二个交配结果看来，倒是与2：1很适合。

所以表面上面不符合孟德尔比例，但实质上是服从孟德尔定律的，这是由于纯合黄鼠在胚胎期死亡了。

其遗传行为分析如下：黄鼠(A Y a) x黄鼠(A Y a)↓(1A Y A Y)：2A Y a：1aa死亡黄鼠黑鼠也就是说，黄鼠基因 A Y影响两个性状：毛皮颜色和生存能力。

A Y在体色上为一显性效应，它对黑鼠基因a是显性，杂合体A Y a表型是黄鼠，但黄鼠基因A Y在致死作用方面有隐性效应，当黄鼠基因为纯合体A Y A Y时，才引起合子的死亡。

1.3 蛋白质和核酸考点一 蛋白质的结构和功能1．组成蛋白质的氨基酸的结构和种类(1)氨基酸的结构(2)氨基酸的种类种类⎩⎪⎨⎪⎧必需氨基酸⎩⎪⎨⎪⎧特点：必须从外界环境中获取种类：8种非必需氨基酸⎩⎪⎨⎪⎧特点：人体细胞能够合成种类：13种2．蛋白质的合成(1)多肽的形成过程①肽的名称确定：一条多肽链由几个氨基酸分子构成就称为几肽。

②H 2O 中各元素的来源：H 来自—COOH 和—NH 2，O 来自—COOH 。

③一条肽链上氨基数或羧基数的确定：一条肽链上至少有一个游离的氨基和一个游离的羧基，分别位于肽链的两端；其余的氨基(或羧基)在R 基上。

(2)蛋白质的结构层次(以血红蛋白为例)3．蛋白质结构多样性与功能多样性[概念检测](1)具有氨基和羧基的化合物，都是构成蛋白质的氨基酸。

(×)(2)组成蛋白质的氨基酸之间可按不同的方式脱水缩合。

(×)(3)氨基酸之间脱水缩合生成的H2O中，氢来自氨基和羧基。

(√)(4)胰岛素的不同肽链之间通过肽键相连。

(×)[教材拾遗]1．(必修1 P29正文)请叙述氨基酸的结构特点：每种氨基酸分子至少都含有一个氨基和一个羧基，并且都有一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上，这个碳原子还连接一个氢原子和一个侧链基团。

2．(必修1 P32“与社会的联系”)熟鸡蛋更容易消化的原因是高温使蛋白质分子的空间结构变得伸展、松散，容易被蛋白酶水解。

3．(必修1 P32“与社会的联系”)蛋白质变性后能(填“能”或“不能”)用双缩脲试剂检测，理由是蛋白质变性后空间结构改变，但没有破坏氨基酸之间的肽键。

4．(必修1 P32图文2­13)人正常血红蛋白的空间结构呈球状，由它参与组成的红细胞呈两面凹的圆盘状，如果血红蛋白某一处的谷氨酸被缬氨酸取代，就可能形成异常的血红蛋白。

这样的血红蛋白可聚合成纤维状，性质也与正常血红蛋白有差异，由它参与组成的红细胞就会扭曲成镰刀状，运输氧的能力会大大削弱。

核酸的分离
1. 酚-氯仿抽提法：这是一种传统的核酸分离方法，常用于从细胞或组织中提取 DNA。

该方法利用酚和氯仿的混合物来溶解细胞膜和蛋白质，而核酸则不溶于其中。

通过离心和萃取步骤，可以将核酸与其他成分分离开来。

2. 离心柱法：离心柱法是一种快速、简便的核酸分离方法。

它使用特殊的离心柱，其中填充了吸附核酸的树脂或膜。

将细胞或组织裂解物加载到离心柱上，通过离心和洗涤步骤，核酸可以选择性地结合到柱子上，而其他杂质被洗去。

3. 磁珠法：磁珠法利用磁性颗粒来结合核酸。

这些磁珠通常表面修饰有特定的探针或抗体，可以与目标核酸结合。

通过外加磁场，可以将结合了核酸的磁珠从混合物中分离出来。

4. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种基于分子量差异的核酸分离方法。

它将核酸样品加载到琼脂糖凝胶中，并在电场作用下分离不同大小的核酸片段。

通过电泳后的染色或荧光标记，可以检测和分离特定大小的核酸。

5. 色谱法：色谱法包括亲和层析、离子交换层析和尺寸排阻层析等技术，可以根据核酸的物理和化学性质进行分离。

这些方法通常用于纯化和分离特定类型的核酸。

无论使用哪种核酸分离方法，都需要注意操作的准确性和实验条件的控制，以确保获得高质量的核酸样品。

核酸分离是许多分子生物学和遗传学研究的基础步骤，对于后续的分析和应用非常重要。

一些DNA提取方法1、溶菌酶法：收集对数生长期的菌液5ml, 置于10 000 rpm离心5min; 弃上清, 用500μl TE重悬于115ml 离心管中, 加10μl 10mg/ml溶菌酶, 37℃保温20min, 再加215ul 20mg/ml蛋白酶K混匀, 37℃保温1h; 再加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1) , 置于10 000 rpm离心5min; 取上清液加2倍体积的无水乙醇和1 /10体积的NaAc (pH = 416) , 于- 20℃下静置10min后于12 000 rpm离心10min; 所得的DNA 沉淀用70%的乙醇洗2 次, 自然风干后溶于40μl 的TE (含20ug/mlRNase) , 55℃处理15min, 于- 20℃保存备用。

2、改良的CTA B法：收集对数生长期的菌液5ml, 置于10000 rpm离心5min; 弃上清, 用500μl TE重悬于115ml离心管中, 加100μl 10% SDS溶液, 215μl 20mg/ml蛋白酶K, 37℃保温1h,再加75μlNaCl和75μl 2 ×CTA B混匀, 65℃保温30min, 再加等体积的酚、氯仿、异戊醇( 25∶24∶1) , 置于10000 rpm离心5min; 以下步骤同溶菌酶法。

3、超声破碎提取法：收集对数生长期的菌液5ml, 置于10 000 rpm离心5min; 弃上清, 用3ml裂解缓冲液(110mol/L NaCl, 50mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris·Cl) , 加30μl 10mg/ml溶菌酶冰水浴30min后超声处理, 超声条件: 250W每次工作5 s, 间隙5 s, 重复20次, 再加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1) , 置于10 000 rpm 离心5min; 以下步骤同溶菌酶法。

4、（1）破壁、蛋白质和核酸分离：向装有0.05~0.2g 样品的5 mL EP 管中加500~2000 μL 裂解液，充分混匀，立即放入沸水浴中并开始计时5~20 min（细胞壁薄且壁外没有荚膜或多糖的微生物，沸水浴时间一般5~10 min；对于那些细胞壁厚或有特殊胞外结构的微生物及杂质含量高的样品，沸水浴时间一般15~20 min），每隔2~3 min 颠倒EP 管3 次；随后立即转入60 ℃水浴中水浴1 h 或更长，每隔15 min 颠倒EP 管3 次；接着转入72 ℃水浴中水浴1 h 或更长，每隔15 min 颠倒EP 管3 次。

核酸检测流程和步骤一、概述新冠病毒是一种高传染性的病毒，为了控制疫情的扩散，核酸检测成为了目前最常用的检测方法之一。

本文将详细介绍核酸检测的流程和步骤。

二、样本采集1. 采集人员：医护人员或专业采样人员。

2. 采集时间：通常在发病后7天左右进行。

3. 采集部位：咽拭子、鼻拭子或者是深部呼吸道样本（如气管分泌物等）。

4. 采集方法：（1）咽拭子：取舌根部分泌物和咽部分泌物，用棉签轻轻刮擦咽壁后放入试管中。

（2）鼻拭子：插入鼻腔深处，旋转几次后取出放入试管中。

（3）深部呼吸道样本：通过气管插管或支气管镜取得。

三、样本运输1. 样本处理前需密封好，并标注好患者信息和采样时间。

2. 样本需在规定时间内送至实验室进行处理，过长时间会影响检测结果。

3. 样本需在运输途中保持低温状态，避免样本变质。

四、核酸提取1. 样本处理前需要进行病毒灭活处理，避免操作人员感染。

2. 核酸提取是关键的步骤之一，其目的是将样本中的RNA分离出来。

3. 常用的核酸提取方法有磁珠法和硅胶柱法等。

五、核酸扩增1. 核酸扩增是将样本中极少量的RNA复制成足够数量进行检测的步骤。

2. 常用的核酸扩增方法有RT-PCR法、LAMP法等。

3. 在扩增过程中需要添加特定引物和荧光素等试剂。

六、结果分析1. 检测结果分为阴性和阳性两种情况。

2. 阳性结果表明患者感染了新冠病毒，需要隔离治疗。

3. 阴性结果并不能完全排除患者感染，需要结合临床表现和其他检测方法进行综合判断。

七、注意事项1. 采集人员应佩戴防护服等个人防护装备，避免感染。

2. 采集过程中应注意无菌操作，避免污染样本。

3. 样本处理前需要进行病毒灭活处理，避免操作人员感染。

4. 核酸提取和扩增过程中需要严格控制实验室环境和操作规范，确保检测结果的准确性。

八、总结核酸检测是目前最常用的新冠病毒检测方法之一，其流程包括样本采集、样本运输、核酸提取、核酸扩增和结果分析等步骤。

在实际操作中需要严格按照规范进行操作，确保检测结果的准确性。

如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和正确实施设计方案一、通用的技术路线设计方案：1、确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求不论是学生学习简单的分离提纯方法，还是科研人员进行研究、开发或者探索新物质，一个明确的目的和要求都是必不可少的。

本课题要求对生物大分子进行分离提纯，也即在了解生物大分子（即蛋白质、核酸、脂质、糖类）的前提下，进行尽可能完善的提纯，同时也应注意满足现实设备情况。

2、建立相应可靠的分析测定方法分离提纯最为重要的就是最终的“纯度”，所以一套完善可靠地分析测定方法就是进行工作的前提条件。

没有这双“眼睛”，将无法得到最终的实验结果。

3、查阅文献调研和预备性实验要进行分离提纯就必须掌握四种生物大分子的一般理化性质以及需要提纯的产物的一些特殊理化性质，只有这样才能进行分离提纯的工作。

4、生物材料的破碎和处理需要分离的生物大分子往往贮存在生物体内，而根据生物种类的不同，如微生物、动物、植物等，有不同的生物材料处理方式，而处理方式的得当与否，往往也决定着最终的提取率的高低甚至实验的可行性。

5、分离纯化方案的选择和探索同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。

而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。

所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。

6、生物大分子纯度的检测根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。

7、产物的浓缩、干燥与保存二、常用的检测方法：1、物理、化学方法：比色法、气相/液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。

但应注意，必须同时采用 2～3 种不同的纯度鉴定法才能确定。

2、生物学的测定法：酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；三、要了解的主要理化性质：1、在水和各种有机溶剂中的溶解性。