第九章核酸的分离与提纯

彻底，常与其他方法结合使用。
5．高通量的RNA分离技术
(1)微量移液法(micropipeting)
由Karrwer等人于1995年建立的一种方法。 特点：此法借助毛细管或微量移液管直接提取
细胞的内含物，进行RNA抽提。
操作过程
用激光移液管拉伸器(1aserpipette puller)将毛细石 英 管 拉 成 孔 径 为 l0um 的 微 量 移 液 管 ， 将 其 顶 端 弯 曲 23°，以便穿透细胞壁。
(1)机械碾碎 – 对于动物组织(如鼠肝、兔肝等)，一般多采用匀浆的 方法。即将组织剪碎置研钵中，研碎。 – 为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注 意石英砂对有效成分的吸附作用。 – 用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎，此法较温和， 适于实验室应用。 – 若需大规模生产，则可用电动研磨法，酵母、植物组 织的细胞破碎也可用此法。
二是要排除蛋白质、脂类、糖类等其他物质的污染。 – 纯化的样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过 高浓度的金属离子； – 蛋白质、脂类、糖类等的污染应降低到最低程度； – 无其他核酸的污染，如提取DNA时，应去除RNA。
一般程序
1、供体的核酸分离
供体细胞培养
收集(菌体)细胞
细胞破碎
分离总DNA 分离细胞器
是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。 由于细菌的外部有一层细胞壁，破壁较为困难，因此
用超声波处理细菌和酵母的时问要长一点。有些菌体 破碎需要5～l0min或更长，如果在细胞浮液中加石英 砂则可缩短时间。 为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间 歇处理和降低温度的方法进行。
(4)压榨法
（2）减少物理因素对核酸的降解 – 物理因素主要是机械剪切力，包括强烈震荡、搅拌、 细胞突然置于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭 长的孔道； – 其次是冻融、高温煮沸和辐射等，均将导致核酸的 降解。 – 机械剪切力主要破坏大分子量的线性DNA分子，而 对分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，破坏相 对较小。
一旦微量移液管尖端被清空后，立即供给1.3kPa的负 压，这时微量移液管就插入到目的细胞内。
一经插入，细胞内含物就被吸进微量移液管。 可以明显地看到，细胞立刻瘪了下去。 然后，微量移液管离开细胞，内含物被注入到10u1
RNA提取液中，用69kPa和1.3kPa正、负压反复作用， 以便将微量移液管顶端漂洗干净。 此法可直接从叶片的表皮细胞、防御细胞以及叶肉细 胞中提取mRNA，而叶片却不受到损伤。
(2)组织捣碎器法
是一种剧烈的破碎细胞的方法。 捣碎器(8 000-10 000 r/min)处理30～45s，植物和
动物细胞能完全破碎。 若用它破碎酵母菌和细菌的细胞，则需加入石英砂方
才有效。 在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成
分变性，同时捣碎的时间不宜太长。
(3)超声波法
随后，再加入10u1 RNA提取液，其中含有 50ug 连 接 了 oligo(dT)- 的 磁 力 珠 ， 混 合 均 匀 ， 22℃下静置l0min。
再 用 2ou1 1 倍 的 反 转 录 缓 冲 液 (50mmol/Ltris-HCl ， pH8.3 ； 75mmol/L KCl；3mmol/L MgCl2；10 mmol/L DTT) 洗两次，即可将结合在磁力珠上的mRNA洗脱 下来。
生物降解是RNA提取过程的主要危害，储存的 RNA制品也不例外，因此，为了抑制核酸酶的 活性，一般在低温下（4℃或0℃，甚至-20 ℃ 左右）进行。
进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样 品，若不能马上进行提取，应将材料置液氮中 或-80 ℃冰箱保存。
分离纯化核酸总的原则
一是应保证核酸一级结构的完整性，这是研究核酸结构 与功能的最基本要求；
4．生物酶降解
生物酶有降解细菌细胞壁的功能。 在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁
消融，随之而来的是因渗透压差引起的 细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。
二、核酸提取的基本方法
1．去垢剂(SDS)法
SDS(sodium dodecyl sulfate)：即十二烷 基硫酸钠，是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶 抑制和蛋白变性剂，也是一种去污剂。
却会从溶液中沉淀出来， 因此通过离心便可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、
多糖类物质分开。 然后将此复合物沉淀溶解于高盐溶液， 再加入乙醇使核酸沉淀，因CTAB溶解于乙醇，离心后
即可得DNA沉淀。
优点
既适用于新鲜的植物，也可用于经脱水处理的材料， 能够很好地去除多糖类杂质，对于含糖较高的植物材 料可优先采用。
分离总RNA
分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异DNA
感染或转染细胞（病毒型） 转化细菌细胞（质粒型）
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离
是一种温和、彻底破碎细胞的方法。 即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于
细胞直径的小孔，致使细胞被挤压破碎。
2．溶胀和自溶
(1)溶胀
概念：在低渗溶液，如低浓度的稀盐溶液中，由于存 在渗透压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜 膨胀破裂的现象称为溶胀。
步骤：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出至室 温下(或40℃左右)迅速融解。如此反复冻融多次，细 胞可在形成冰粒和增高胞液盐浓度的同时，发生溶胀， 以致破碎。
（2）抽提核酸，去除与核酸结合的蛋白质、 多糖、脂类，去除盐、有机溶剂等杂质，以 及去除其他不需要的核酸分子；
（3）核酸的精制纯化。
一、细胞的破碎
一般动物组织的细胞膜较脆弱，易破碎，而植 物和微生物的细胞比较牢固。
细胞破碎的方法很多，可根据组织特性和核酸 分离目的加以选择。
1．物理方法
DNA片段的回收 4、质量评估
1） 凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析
特定
第二节 核酸制备的基本方法
核酸制备的步骤
（1）抽提组织或细胞的破碎、消融。 – 抽提核酸必须事先将生物材料破碎或消融， 这关系到核酸回收率的高低。 – 破碎与消融组织细胞，通常有使用匀浆器、 捣碎器的机械方法以及温和的反复冻融法， 使用表面活性剂或各种酶处理的方法。
(2)自溶
概念：细胞结构在本身所具有的各种水解酶作 用下，发生溶解的现象称为自溶。
注意：应用此法时要特别小心操作，因为水解 酶不仅可破坏细胞壁、细胞膜，同时也可使某 些有效成分在自溶时分解。
3．化学处理
用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯等) 或表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)处理细 胞时，可使细胞壁和细胞膜的结构部分 溶解，导致整个细胞破碎。
机制：高浓度的盐可以破坏核酸和蛋白质之间的次级 键，Байду номын сангаас核蛋白解联。
一般先用lmol/L NaCl或lmol/L NaClO4进行抽提， 再加入氯仿/异戊醇离心去蛋白，最后用甲醇或异丙醇 使核酸沉淀。
其中的氯仿可以使蛋白表面变性，帮助去蛋白。 异戊醇可以消泡以维持离心层的稳定。 特点：该法对核酸的损伤较小，但由于去除蛋白不够
②因为某些实验，特别是对时钟基因的 研究，时间因素至关重要，采用此法可 减少采样时间对实验的影响。
(3)原生质体分离法(protoplasting and sorting)
特点：是一种快速而准确地从分生组织的细胞中提取 RNA的技术，已应用于拟南芥根系全球性基因表达图 谱的制作。
原理：首先需将荧光蛋白基因转入受体细胞，用酶处 理破壁后，通过紫外照射使那些表达绿色荧光蛋白的 细胞产生荧光，再通过荧光感受分离仪(flurescenceactivated cell sorter，简称FACS)将其从特定组织 或区域中分离出来，进而制得RNA
第九章 核酸的制备
第一节 核酸制备的基本原理
核酸的种类
脱氧核糖核酸（DNA）：细胞核，单链或双链
核糖体RNA
核糖核酸（RNA） 转运RNA 信使RNA
细胞质， 单链或双链
但无论哪核酸，在生物体中一般以核蛋白的形式存在， 因此，为了提取制备核酸，必须将核蛋白解联（即利
用接联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白）并去除蛋白， 同时必须维持核酸的天然性状，不使核酸发生变性或
降解， 操作上尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各
种不利因素对核酸的破坏，同时要求去蛋白迅速彻底。 为了保证分离核酸的完整性及纯度，在实验过程中，
应注意以下条件和要求：
（1）尽量避免化学因素对核酸的降解 – 过酸或过碱以及其他化学因素将破坏多聚 核苷酸链的磷酸二酯键，使核酸降解； – 核酸（特别是RNA）在碱性溶液中十分容 易降解. – 因此抽提介质的pH常以5.5-9.0为宜。
特点：此法得率高，对核酸影响小，但制品中仍残留微 量蛋白。SDS在低温或有两价金属离子或钾离子存在时 将形成沉淀，使用时应该注意。
2．酚抽提法
酚也是一种蛋白表面变性剂。球状蛋白在水溶 液中其亲水性氨基酸残基的侧链位于外侧，疏 水性氨基酸的侧链位于内侧，
酚法于1957年为Kirby建立，最早用于DNA 的抽提。
酚的作用机制:
可能是插入蛋白结构的内部，破坏各种氨基酸残基侧 链基团问的次级键，使蛋白的结构翻转，
即原来存在于内侧的疏水性氨基酸残基侧链转向外侧， 而外侧的亲水性氨基酸残基侧链则转向内侧，导致蛋 白质变性。
酚还能使核酸酶失活。
3．CTAB法
CTAB(eetyltriethylammonium bromide):即十 六 烷基三乙基溴化铵，是一种去污剂。
微量移液管被安装在连接了气泵的微操纵器上，通过负 压 将 大 约 1ul RNA 提 取 液 (100mmol/L Tris-HCl ， pH8.0 ； 500mmol/L LiCl ； 10mmol/L EDTA ； 1%SDS；5mmol/L DTT)压入微量移液管。