核盘菌arom基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达
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微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&பைடு நூலகம்*(+&"$ ,&-&"$
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［$］ 。目前， 利用该途径的酶系获 病原菌的合适靶标 ［#］
氨基酸饥饿控制， 表达量低， 因此从原菌体中难以分 离纯化出足够用于结构和功能研究的 GHIJ 蛋白。 进行 *%&- 基因的外源表达研究是解决这一问题的 途径之一。本文克隆并表达了核盘菌 *%&- 基因， 为 建立大量获得该酶的方法和研究 GHIJ 蛋白的催 化机理奠定基础。
［7］
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结果
核盘菌 !"#$ 基因编码框序列的扩增和测序 根据核盘菌 ’-,+ 基因序列设计引物 %: 和 %(，
酿酒酵母 -!,. 的转化和转化子鉴定
酿酒 酵 母 M:)9 的 转 化 采 用 GN%0J##35%J$-O ［7］ 法 。酵母 转 化 子 质 粒 提 取 采 用 G=PN01A? 方 法 。 根据 ’-,+ 基因序列设计用于鉴定的引物 $" 和 $)。 引物 $" 序列为： )Q!’%%%O’%%&O%%OO%&O%!"Q。引 物 $) 序列为： )Q!OO%%&O%’&&OO%O%OO%!"Q。将提 取的酵母质粒用作 $’B 反应的模板， 反应体系参照 反 应 条 件 为： &1R1B1 24 5’6 指导， *,S "8A， ,*S 质粒转化大肠 "8A， +(S "8A， ,8 个循环。另取 :8 G "
得菌丝体。将核盘菌菌丝体用无菌水清洗， 吸干水 分后参照文献 ［)］ 进行 35% 提取。 !"’ ()* 根据核盘菌 ’-,+ 基因序列 （ %6+,7889） 设计上 &; 游引 物 %: 和 下 游 引 物 %(。 用 ./-,$#%0 35%
扩增 ’-,+ 基因全 $/<=>?@1A? 试剂盒进行 $’B 反应， 长编码框序列 %!CBD。 $’B 产物采用凝胶纯化试剂 盒纯化， 纯化步骤参照试剂盒说明书进行。 !"+ 酿酒酵母表达载体构建 用限制性内切酶 !() ! 和 1,0 ! 酶切凝胶纯化 后的 $’B 产物 %!CBD。酶切产物浓缩、 纯化后与同 样处理的酵母载体 E6-#( 连接。连接体系为： :8 F 连接酶缓冲液 ( ， （ ） ， 插入片 G E6-#( (88HIJ" G 8K) G " " 段 :+ （约 : ， G I） &, 35% 连接酶 8K) G。取 (8 G连 " " " " 接产物， 转化大肠杆菌 （ 2 L 3,"& ） 3M) #感受态细胞。 提取大肠杆菌转化子质粒， 进行酶切鉴定。将重组 质粒命名为表达载体 E6-#(!1@/>， 送交上海博亚生 物技术有限公司测序， 以 %: 为测序引物。 !",
核盘菌 （ !"#$%&’()(* +"#$%&’(&%,- ） 是一种植物病原 真菌， 能够侵染大约 !%# 种植物， 其中包括了大量农 作物， 常在发病区导致粮食和蔬菜严重减产 。国 内对核盘菌引起的菌核病多采取化学防治措施进行 处理。然而随着人们对环境保护认识的加深， 寻求 新的有效、 低污染的防治方法势在必行。 GHIJ 蛋 白是真菌中催化芳香族氨基酸合成途径第二步到第 六步的五功能酶， 同时具有脱氢奎尼酸合酶、 43烯醇 丙酮酰莽草酸3&3磷酸合酶 （ 7QLQ 合酶， 、 莽草 7QLQL） 酸激酶、 脱氢奎尼酸脱水酶 （脱氢奎尼酸酶） 和莽草 酸脱氢酶的催化活性。芳香族氨基酸合成途径广泛 地存在于细菌、 真菌和植物中， 而由于哺乳动物体内 不存在该途径， 因此相应的酶是控制细菌和真菌类
核盘菌 $’(. 基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达
$ 于寒颖#， ， 杨 谦#" （# 哈尔滨工业大学生命科学与工程系 （ 大庆石油学院石油工程系
$
哈尔滨
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大庆
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摘
要： 核盘菌 （ !"#$%&’()(* +"#$%&’(&%,-） 测序。该基因编码的 GHIJ 蛋白是芳香族氨基酸合成 *%&- 基因已经被克隆、
总 B5% 转移至带电荷的尼龙膜上。探针制备和杂 交步骤除了所有试剂均用 3-$’ 处理的去离子水配 制外， 都遵循 35% 探针标记和检测试剂盒 % 的说明 书进行。 !"8 转化子 9(:( 合酶酶活测定 用含 (V 棉子糖的 #’!W 酵母尿嘧啶营养缺陷 型选择培养基活化酵母转化子。将活化的转化子转 接到 )8>G 含 (V 半乳糖的 #’!W 培养基和含 (V 葡 萄糖的 #’!W 培养基中， 并使其最初 9:788 达到 8K,。 "8S 、 :98@J>NH 振荡培养。分别在诱导 ,9X、 78X、 +(X 和 9,X 离心收集菌体， 用缓冲液 #&-& 重悬 （ (88 G " 。加入 8K(I 酸洗玻璃珠， 剧烈振荡破 #&-&JI 菌体） 碎细胞， 每振荡 "8A 冰浴 "8A。 ,S 、 :(888@J>NH 离心 取上清， 即完成粗酶液的制备。参照文献 ［+］ :8>NH， 和 ［9］ 测定酵母转化子的 -$#$ 合酶酶活。用考马斯 亮蓝法测定蛋白含量。
总 B5% 作为模板。反应条件为： *,S "8A， ,*S "8A， +(S :>NH， ,8 个循环。 采用 23, &:,! 和 18# ! 酶切 E6-#(!1@/>， 凝胶 将其用作制备探针的模 纯化约 988UE 的 35% 片段， 板。总 B5% 采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳方法分
［)］ 离 。用毛细管转移方法将对照质粒和酵母转化子
,,
（(887） （:） 6W M1H!=NHI #0 ’" L J ;30’ <&3-,$&,",=&3’ >&)&3’ ,7
物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。莽草酸! "!磷 酸（ #"$ ）用 肺 炎 克 雷 伯 氏 菌（ !"#$%&#""’ ［,］ 发酵液制备 。磷 酸 烯 醇 %&’’ ())*+） ()#*+,)&’# ， 式丙酮酸 （ $-$） 购自 %./012/ 公司。其他生化试剂 为进口或国产分析纯。 !"# $%& 提取 核盘菌用 $3 培养基培养 , 4 )2， 过滤培养液获
得商业上成功的是美国孟山都公司开发的除草剂草 甘膦 （靶标是 7QLQ 合酶） 。草甘膦因具有低污染的 特性已经被广泛地用于作物苗前、 苗后除草， 果园除
［&］ 草以及要求保护物种多样性的森林保护区除草 。
大量获得酶蛋白， 研究其催化机制并找到催化的关 键位点是设计和合成蛋白质抑制剂的前提。然而， 以单体形式存在 由于真菌的 GHIJ 蛋白是二聚体， 时无活性， 分子量大， 易受蛋白酶降解， 在菌体内受
杆菌 （ 2 L 3,"& ） 3M) #高效感受态细胞。然后提取大 肠杆菌转化子质粒， 用 7&) 2$酶切鉴定。 !"/ 转化子 !"#$ 基因表达的 *01()* 和 %2345637 杂交检测 酵母转化子 M:)9 总 B5% 的提取参照小量酵母 菌总 B5% 抽提试剂盒的说明书进行。 根据核盘菌 ’-,+ 基因序列设计 B&!$’B 实验 使用 的 核 盘 菌 ’-,+ 基 因 特 异 引 物 $) 和 $7 （ )Q! 。 B&!$’B 反 应 体 系 参 O’&’%O’O%’&&%&’’%’!"Q） 照 CH? #P?E B5% $’B RNP （ %;T） 试剂盒指导， 取( G "
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引物的 )Q端分别添加限制性内切酶 !() ! 和 1,0 ! 的酶切位点。其中 %: 含有 R/Y1Z 序列， 而 %( 的反 向 互 补 序 列 含 有 终 止 密 码 子。 %:： )Q!%O’’OO O&%’’&’%%O&’%%O%&OOO%&’&%’%%’!"Q；%(：)Q! &%%&O’OO’’O’&’%%’%&%’%%%OO&&OO%&O’&!"Q。 以核 盘 菌 基 因 组 35% 为 模 板， 用高保真酶 &; 进行 反应。 ./-,$#%0 35% $/<=>?@1A? $’B $’B 产物 的电泳结果显示， 扩增得到的 35% 片段约 ,+88UE， 与预期大小相符。将扩增得到的 35% 片段凝胶纯 化后进行酶切鉴定。结果显示， 其酶切图谱与 ’-,+ 基因相应 35% 片段的酶切分析结果相同 （图略） 。 #"# 酵母表达载体的构建 将 $’B 扩增得到的 ’-,+ 基因全长编码框序列 用 !() !和 1,0 !进行双酶切， 与用相同限制性内切 酶酶切的载体 E6-#( 连接。连接产物转化大肠杆 菌 （ 2 L 3,"& ） 。提 取 大 肠 杆 菌 转 化 子 质 粒， 用 3M) # 7&) 2$酶切鉴定阳性克隆， 7&) 2$ 在载体多克隆位 点有一个酶切位点， 在插入片段上有两个酶切位点。
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