免疫组库高通量测序技术检测ALL-MRD的研究进展

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mrd检测判断急性淋巴细胞白血病预后的临床研究

中国农村卫生 2019年10月第20期总第170期China's rural health,October 2019,No.20,Total No.170 48MRD检测判断急性淋巴细胞白血病预后的临床研究张为伟吴楠丁凤姝（黑龙江省哈尔滨市儿童医院 150010 ）【摘要】目的：探讨微小残留病灶（MRD）检测对急性淋巴细胞白血病（ALL）预后判断的临床价值。

方法：选取本院收治的120例ALL 患者作为研究对象，统计MRD阳性及阴性患者不同危险度及不同治疗时期的复发情况，同时比较诱导缓解治疗第33天不同骨髓缓解状况下MRD水平。

结果：诱导缓解治疗第33天以及维持治疗第3个月，高危组的MRD阳性率均显著高于中危组及低危组，差异有统计学意义（P<0.01）；不同治疗时期MRD阳性复发率显著高于MRD阴性复发率，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论：MRD水平与ALL的预后有关，MRD阳性可作为ALL患者预后判断的重要因素。

【关键词】微小残留病灶；急性淋巴细胞白血病；复发【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1674-361X(2019)10-0048-01近年来，随着白血病化疗，靶向治疗和干细胞移植技术的不断发展，急性淋巴细胞白血病的治愈率有了显着提高。

在一些发达国家超过80％，但20％的患者是最早的淋巴细胞分化的变化。

结构中免疫球蛋白重链和T细胞受体基因的重排被认为是B细胞和T细胞。

细胞白血病的恶性生长是一种微小的残留病。

其中一个重要原因复发和治疗失败的原因是急性淋巴细胞白血病，完全缓解后残留在骨髓或脑脊液中的白血病细胞的存在。

改善化疗方案，早期预防中枢神经系统白血病，并计划实施ALL以延长生存期。

在这项研究中，120名接受MRD治疗的ALL患者于2017年6月入院接受比较MRD 阳性和阴性患者复发，探讨MRD在预后中的作用。

所有患者报告如下。

1 资料与方法1.1一般资料选取本院2017年1月-2018年6月收治的120例ALL患者作为研究对象，上述病例均经骨髓细胞形态学、免疫学、分子生物学、遗传学等确诊，且均为初发患者，其中B淋巴细胞白血病109例，T淋巴细胞白血病11例；男68例，女52例；年龄18～70岁，平均（41.3±5.6）岁。

微小残留病灶(MRD)监测在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的应用进展

微小残留病灶(MRD)监测在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的应用进展任雨虹【摘要】慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是西方国家最常见的成人白血病,在我国的发病率也日益增加.近年来针对CLL的新药层出不穷,微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)监测逐渐成为评估疗效的重要手段.本文总结了目前常用的MRD检测方法,包括流式细胞学和基于PCR法的分子学检测,并介绍了其在初治CLL疗效评价、预后评估和在移植后CLL复发预警方面的应用进展.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2019(046)003【总页数】5页(P404-407,419)【关键词】慢性淋巴细胞白血病(CLL);微小残留病灶(MRD);监测【作者】任雨虹【作者单位】复旦大学附属中山医院血液科上海 200032【正文语种】中文【中图分类】R733.72慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤,以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征,在西方国家的年发病率为4.2/10万,80岁以上人群年发病率甚至超过30/10万[1]。

CLL的治疗方案经历了从传统化疗到化学免疫治疗的转变,但CLL的首要治疗目标仍是获得更深程度的缓解和更持久的无进展生存(progression free survival,PFS)。

能达到更深检测程度的微小残留病灶(minimal residual disease,MRD)监测逐渐成为了疗效评估的重要指标。

不同于其他白血病,CLL预后的高度异质性和累及多部位的特点使得针对其MRD的监测比其他白血病更复杂。

本文将对目前MRD监测在CLL中的应用进展进行介绍。

MRD在CLL中的检测方法作为一项评估疗效深度的监测指标,理想的MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。

综述：高通量测序技术综述

高通量测序技术综述姓名：舒云康学号：200830010416班级：农学院生物技术1班2011. 06. 01摘要：高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

同时，高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing) 关键字：高通量测序深度测序新一代测序应用正文：一、测序技术发展现状根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina(Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA纳米球测序（DNA nanoball sequencing）等。

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。

比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。

在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（smallRNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。

免疫组库测序

4. 信息分析:对测出来旳序列数据进行信息挖掘，来发掘出生物学意义与成果。数据分析主要涉及数据清理、质量控制、不一样本数据分离、序列比对、序列注释以及下游旳多种分析。
二、免疫组库测序
1、免疫组库测序概念
免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）是以 T/B 淋巴细胞为研究目旳，用多重PCR技术或5’RACE扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性旳互补决定区（CDR3区），再结合高通量测序技术（HTS），全方面评估免疫系统旳多样性，进一步挖掘免疫组库与疾病旳关系。
3、序列构造分析分析CDR序列构成及序列碱基成份分析CDR序列旳碱基插入和缺失编码CDR序列翻译成氨基酸和肽链
4、免疫组库构建构建免疫组库体现谱，统计多样性抗体库克隆体现情况免疫组库多样性呈现，绘制V/J基因体现旳2D、3D图
5、免疫组库差别分析样品间多样性差别分析（辛普森系数、香农威纳系数）样品间克隆体现差别分析（CDR3，V-D-J）分组样品间旳克隆体现差别分析（CDR3，V-D-J）
IR-SEQ
三．信息分析
1、免疫组库概念
免疫组库（Immune Repertoire，IR）是指在任何指定时间，某个个体旳循环系统中全部功能多样性B细胞和T细胞旳总和。研究免疫组库就要测定免疫系统中旳BCR和 TCR旳基因或RNA分子序列。
2、两种PCR技术旳优缺陷
Arm-PCR是最新开创旳一种高效扩增子救援多重 PCR，它克服了老式多重PCR旳缺限。经过在扩增旳早期使用基因靶点特异性旳引物，而在指数扩增期使用共用旳引物，使得全部模板旳扩增效率大大提升，因而具有较高旳特异性和敏捷性。
3、模板比较

《中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南》要点

《中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南》要点成人急性淋巴细胞白血病（ALL）是最常见的成人急性白血病之一，约占成人急性白血病的20%～30%，目前国际上有比较统一的诊断标准和不同研究组报道的系统治疗方案，完全缓解（CR）率可达70%～90%，3～5年无病生存（DFS）率达30%～60%；美国癌症综合网（NCCN）于2012年首次公布了ALL的诊断治疗指南，我国于2012年发表我国第1版成人ALL诊断与治疗的专家共识，得到了国内同行的认可。

最近2016版WHO造血与淋巴组织肿瘤分类发表，对于ALL的分类有一些更新，提出了一些新概念；NCCN对于成人ALL的临床指南也先后几次修改。

基于此，对我国成人ALL诊断与治疗的专家共识进行了更新。

一、诊断分型（一）概述ALL诊断应采用MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学）诊断模式，诊断分型采用WHO 2016标准。

最低标准应进行细胞形态学、免疫表型检查，以保证诊断的可靠性；骨髓中原始/幼稚淋巴细胞比例≥20%才可以诊断ALL；免疫分型应采用多参数流式细胞术，最低诊断分型可以参考1995年欧洲白血病免疫学分型协作组（EGIL）标准（表1），疾病分型参照WHO 2016 版分类标准。

同时应除外混合表型急性白血病，混合表型急性白血病的系列确定建议参照WHO 2008造血及淋巴组织肿瘤分类的标准（表2），可以同时参考1998 EGIL标准（表3）。

预后分组参考Gökbuget等发表的危险度分组标准（表4）。

细胞遗传学分组参考NCCN 2016 建议：预后良好遗传学异常包括超二倍体（51～65条染色体）、（t12；21）（p13；q22）和（或）ETV6-RUNX1；预后不良遗传学异常包括亚二倍体（＜44条染色体）、（tv；11q23）［（t4；11）和其他MLL 重排］、（t9；22）（q34；q11.2）、复杂染色体异常。

建议开展相关的遗传学检查，提供诊断分型、预后判断所需的标志。

多发性骨髓瘤微小残留病检测的研究进展

多发性骨髓瘤微小残留病检测的研究进展丁凯;付蓉【摘要】近年来随着新药物的临床应用,多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者的预后有了根本性的改善,但目前仍不能达到临床治愈.主要障碍为微小残留病(minimal residual diseases,MRD)的存在,其对于患者无进展生存期(progression-free survival,PFS)和总生存期(overall survival,OS)具有重要影响.考虑到患者的克隆异质性、基因不稳定性和无效免疫监视,准确定义和精准检测MRD对制定临床治疗决策十分重要,同时MRD阴性也是患者维持治疗的理论终点和新药临床试验的重要研究终点之一.迄今为止,在检测精度、标准化和普遍适用性方面尚缺乏完美的MRD检测手段.本文综述包括流式细胞术和各种分子生物学检测方法在内的检测MM患者MRD的主要技术,对其各自的优缺点和未来发展方向予以阐述.【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2018(045)014【总页数】5页(P745-749)【关键词】多发性骨髓瘤;生存期;残留病;流式细胞术;测序【作者】丁凯;付蓉【作者单位】天津医科大学总医院血液内科天津市300052;天津医科大学总医院血液内科天津市300052【正文语种】中文近十几年来，得益于多种新型药物的临床应用，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者的预后获得根本性改善，总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）均有所提高［1-3］。

MM患者诱导治疗后的完全缓解率（complete remission，CR）从10%提高至80%［4-5］。

患者治疗后能否达到并保持CR直接影响PFS和OS［6］，然而，由于微小残留病（minimal residual diseases，MRD）的存在，使部分已获得CR但MRD持续阳性的MM患者早期复发，相比于MRD持续阴性的患者其PFS和OS 明显缩短［7-9］。

免疫组学的研究进展

免疫组学的研究进展唐康侯永利王亚珍陈丽华（中国人民解放军空军军医大学基础医学院免疫学教研室，西安 710032）中图分类号R392.9 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2024）01-0185-07［摘要］随着高通量测序技术、生物信息学等相关领域进展以及人类对免疫系统功能认识的逐步深入，免疫组学从最初解析B细胞受体（BCR）、T细胞受体（TCR）基因序列逐渐发展为解析和绘制宿主免疫系统和抗原的互作关系以及宿主免疫系统应答机制的全景图谱，主要包括抗原表位组学、免疫基因组学、免疫蛋白质组学、抗体组学和免疫信息学等方面的研究，并基于大量免疫学研究数据建立了ImmPort、VDJdb和IEDB等免疫学数据库，加速了新抗原表位的发现和免疫应答机制等研究。

免疫组学能够揭示免疫系统与疾病的关联，促进新型疫苗和免疫治疗策略开发，将有效推动个体化医疗和精准药物治疗。

近年免疫组与暴露组等的整合以及与人工智能的融合将对全面理解免疫系统对环境因素的响应和调节机制、解析疾病发生和发展的分子机制产生重大影响。

［关键词］免疫组；免疫组学；免疫信息学；人工智能Advances in immunomics researchTANG Kang， HOU Yongli， WANG Yazhen， CHEN Lihua. Department of Immunology， School of Basic Medicine，Air Force Medical University， Xi'an 710032， China［Abstract］With the progress of high-throughput sequencing technologies and bioinformatics， and deepening understanding of immune system，immunomics has evolved from initially deciphering gene sequences of B cell receptor （BCR）and T cell receptor （TCR） to unraveling and mapping interactions between host immune system and antigens， as well as panorama of host immune system response mechanisms， which now encompasses various research areas， such as antigen epitopeomics， immunogenomics， immunopro‐teomics， antibodyomics and immunoinformatics. Based on a large amount of immunological research data， immunological databases such as ImmPort， VDJdb and IEDB have been established to accelerate discovery of new antigen epitopes and study of immune response mechanisms. Immunomics has revealed the association between immune system and diseases， promoted the development of novel vac‐cines and immunotherapeutic strategies， and effectively drove the development of personalized medicine and precision medicine. In recent years， integration of immunome with exposome and fusion it with artificial intelligence will have a significant impact on compre‐hensively understanding immune system's response and regulatory mechanisms to environmental factors， as well as deciphering molecular mechanisms underlying disease occurrence and progression.［Key words］Immunome；Immunomics；Immunoinformatics；Artificial intelligence免疫组（immunome）是宿主免疫系统与抗原的互作关系以及宿主免疫系统应答机制的全景图谱，包括免疫系统的识别对象、识别受体以及参与免疫应答过程的其他分子［1-3］。

《成人急性淋巴细胞白血病诊疗规范》要点

《成人急性淋巴细胞白血病诊疗规范》要点一、概述急性淋巴细胞白血病（ALL），是一种常见的恶性血液病，生物学特征多样而临床异质性很大，以骨髓和淋巴组织中不成熟淋巴细胞的异常增殖和聚集为特点。

ALL占所有白血病的15％，约占急性白血病的30%～40%。

我国1986年白血病流行病学调查研究显示我国的ALL发病率为0.69/10万。

二、临床表现急性白血病的临床表现包括骨髓组织受白血病细胞浸润所引起的骨髓正常造血衰竭表现（如贫血、感染、出血等）以及白血病细胞的髓外浸润引起的异常（如淋巴结、肝脾肿大等）两大方面。

ALL的临床表现各异，症状可以表现比较隐匿，也可以呈急性，这取决于骨髓被恶性克隆替代的程度和髓外浸润的范围；患者就医前的症状期平均约6周（可短于1周至长达1年）。

与急性髓系白血病比较，起病情况及发热、出血、贫血等症状基本相似，但ALL的髓外浸润及中枢神经系统白血病更常见。

（一）正常骨髓造血功能受抑制的表现1．贫血贫血是白血病最常见的症状之一，常较早出现，且随着病情进展而加重。

2．出血出血也是常见表现，约半数病例可有不同程度出血。

3．发热、感染一半以上患者由发热起病，可为低热或高热。

（二）白血病细胞增殖浸润的表现1．肝、脾、淋巴结肿大：以轻、中度肝脾肿大多见。

2．骨关节疼痛：骨和骨膜的白血病浸润引起骨痛（儿童较成人多见、ALL较急性髓系白血病多见），骨痛常比较剧烈，部位不固定，主要见于四肢骨、脊柱和骨盆，游走性不明显，应用一般止痛剂疗效不佳。

3．中枢神经系统白血病（CNSL）：CNSL多发生在白血病的缓解期，初诊病例相对少见；ALL的CNSL发生率比在急性髓系白血病（AML）高。

4．睾丸：睾丸白血病是仅次于CNSL的白血病髓外复发的根源，也常出现在缓解期的ALL患者。

三、诊断分型（一）细胞形态学（二）免疫分型（三）细胞遗传学和分子学分析（四）ALL的形态学、免疫学、细胞遗传学、基因分型（MICM 分型）（五）WHO分型1．ALL，非特指型2. ALL伴重现性遗传学异常3. T淋巴母细胞白血病4．暂定分型：（六）鉴别诊断1 传染性单核细胞增多症：2 急性髄系白血病M0、M1及急性混合细胞白血病：3 慢性粒细胞白血病急淋变：4 再生障碍性贫血及免疫性血小板减少症：5 慢性淋巴细胞白血病及幼淋细胞白血病：四、治疗患者一经确诊后应尽快开始治疗，治疗应根据疾病分型采用合适的治疗方案、策略。

基因测序技术在肿瘤诊疗中的应用进展

循环游离肿瘤ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）测序技术是液体
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中国临床保健杂志２０１６年１０月第１９卷第５期ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＨｅａｌｔｈｃ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１６，Ｖｏｌ．１９，ＮＯ．５
第一代基因测序技术出现于２０世纪７０年代，标志性技术是由Ｓａｎｇｅｒ和Ｇｉｌｂｅｒｔ等人发明的链终止法和化学降解法，已广泛应用于生命科学研究中，如人类基因组计划即是采用第一代测序技术，总共测量了人类基因组中约３０亿个碱基对，发现大量与疾病有关的基因，为疾病的诊断与治疗提供了大量信息［５７］。第一代基因测序技术方法简便快捷，但测序通量低，操作过程复杂且费用高，在大样本测序上也存在诸多困难。
活检的一种，与现有的组织活检技术不同，其通过检测外周血或体液标本中ｃｔＤＮＡ可以在疾病早期检出肿瘤。［１６］早在１９９８年就有研究证实了利用ｃｔＤＮＡ诊断癌症的可行性。在结肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌和头颈部癌等癌症中，ｃｔＤＮＡ中包含ＤＮＡ点突变、甲基化、微卫星不稳定性等诸多变异信息［１７］。但由于传统检测方法的局限性，只能针对某一个或几个特定的基因进行检测，从而限制了其在癌症诊断领域的应用。高通量测序技术的发展使得研究者能够对ｃｔＤＮＡ进行全基因组测序［１８］。Ｄａｗｓｏｎ等［１９］证实采用基因测序技术检测ｃｔＤＮＡ在监测肿瘤负荷的敏感性和动态性方面均优于传统的肿瘤标记物检测和循环肿瘤细胞检测。该研究提示利用基因测序技术检测ｃｔＤＮＡ有望成为肿瘤患者早期诊断的有力手段。２．２肿瘤个体化治疗个体化治疗一直是肿瘤治疗过程中的热点问题，高通量基因测序技术的出现推动了肿瘤个体化治疗的进展。部分肿瘤患者基因组存在特征性的改变，如甲基化水平的改变，ＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＴＰ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２基因突变等［２０］。通过高通量测序技术可以精确检测出这些变异，从而帮助制订个体化的治疗措施，包括分子靶向药物或通路靶向药物的使用和放化疗的应用［２１］。同时，采用高通量测序技术比较肿瘤原发灶与复发灶基因序列的差异，可以帮助评估化疗效果和了解耐药的潜在机制［２２］。既往肿瘤患者的基因测序取材手段主要为组织活检，但该方式的有创性会影响对基因状况的实时观察，同时由于肿瘤存在异质性，单一部位的活检并不能反映肿瘤的全貌；采用高通量测序技术无创性检测ｃｔＤＮＡ将会很好地解决上述问题［１６，２３］。Ｕｃｈｉｄａ［２４］和Ｓｏｂｅｒ等［２５］证实对肺癌患者ｃｔＤＮＡ进行深度测序可确定其表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）分型，从而决定是否使用酪氨酸激酶抑制剂（ＴＫＩｓ）进行靶向治疗。Ｌｉａｏ等［２６］采用高通量测序技术检测肝癌患者ｃｔＤＮＡ，证实其可预测无复发生存期，并可克服肿瘤异质性的限制。通过高通量测序技术监测编码免疫球蛋白受体的ｃｔＤＮＡ片段可比影像学检查更早发现弥漫性Ｂ淋巴瘤的复发，同时还可提供肿瘤异质性、克隆演变进程和耐药机制方面的信息，从而指导淋巴瘤的个体化治疗。［２７］由于基因测序技术在取材手段和方式方法的不断更新，其必将在肿瘤个体化治疗中发挥举足轻重的作用，从而开启精准医疗疾病之一。由于其发病隐匿、治疗方法局限、多数预后不良，且分子生物学特征复杂多变，因而肿瘤的预防、早期筛查与诊断、个体化治疗、预后评估一直是临床医生致力于解决的关键问题。研究已证实，肿瘤多存在基因的改变，随着分子生物学技术的发展，基因测序技术取得长足进步，这对上述难题的解决起到巨大的推动作用［１４］。本文就基因测序技术在肿瘤诊疗中的应用进行综述。１基因测序技术的概述

高通量测序技术的原理及应用研究进展

高通量测序技术的原理及应用研究进展随着生物技术的不断发展，人类对生命的理解越来越深刻。

多年来，生命科学家们通过不断努力，得以掌握了越来越多的生物信息。

而高通量测序技术就是其中最为重要的一种方法。

此技术将在本文中受到重点探讨。

一、高通量测序技术的原理高通量测序技术，也称Next Generation Sequencing（NGS），其诞生的历程可以追溯至1977年人类基因组计划（Human Genome Project）的启动。

该计划旨在绘制出人类基因组的全貌，并揭示人类遗传学的奥秘。

然而，这项伟大的计划的完成，需要巨大的人力、物力和财力，耗时也颇长。

而随着科技的进步，人们对生命科学的理解得到了极大的提升，使得原本充满挑战的任务得以变得简单。

高通量测序技术便是其中一项较为重要的突破。

高通量测序技术是一种全新的基因测序方法。

当使用高通量测序技术进行测序时，可以在短时间内测出无数个基因序列。

这些序列会被转化成电子信号，并传递给计算机进行处理。

在进行高通量测序时，需要三种基本的结构：模板、引物和DNA聚合酶。

其中，模板为待测样本DNA。

引物是一种由碱基组成的DNA或RNA短链，主要作用是将DNA聚合酶引向模板上。

DNA聚合酶，则是一种酶类，主要作用是将引物添加到模板上，形成新的DNA 链。

高通量测序技术的核心原理即在于：运用这些结构，可以通过多轮引物扩增，对样本DNA进行高通量测序。

二、高通量测序技术的意义高通量测序技术在基因研究领域中有着广泛的应用，其意义也十分重要。

在发现新的基因功能、揭示遗传变异和基因表达规律等方面，高通量测序技术都可以给我们提供有力的支持。

例如，在基因组学研究中，我们可以运用高通量测序技术对特定基因进行定位，并探究其表达量和剪接变异。

而在疾病诊治方面，高通量测序技术可以用来寻找致病基因，并建立相应的动物模型以研究特定疾病的发病机制。

总体而言，高通量测序技术在生物科学研究领域中有着无限的应用前景。

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免疫组库高通量测序技术检测ALL-MRD的研究进展【摘要】急性淋巴细胞白血病（ALL）占儿童恶性肿瘤性疾病的首位，尽管儿童ALL治疗已取得很大进展，但复发仍是我们面临的难题。

白血病的微小残留病（MRD）状态是复发的根源。

研究表明，对患者进行定期MRD检测具有重要的临床指导意义。

目前临床上通过实时定量PCR、流式细胞术和原位荧光杂交等技术检测白血病微小残留病（MRD），但是这些技术都有各自的局限，导致一定程度的漏检或假阳性。

免疫组库高通量测序技术（IR-SEQ）的高灵敏度和高特异性，能够更加全面地检测MRD。

本文将对IR-SEQ技术在检测ALL-MRD中的研究进展进行综述。

【关键词】急性淋巴细胞白血病；微小残留病；免疫组库；高通量测序急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）在儿童所有恶性肿瘤性疾病中占据首位，且有逐年增加的趋势，我国每年约有1.5-2万名新发儿童白血病，其中急性淋巴细胞白血病占80%左右，是小儿时期最常见的白血病类型，发病高峰年龄为3～4岁，是严重威胁小儿生命和健康的疾病之一。

随着诊疗技术水平的增高，人们对儿童白血病经过形态学、免疫学、遗传学及分子生物学检测综合分析（MICM分型）的方法对急性白血病进行了精确的诊断和分型、分层治疗使得儿童ALL的诊疗水平方面得到了质的飞跃，但仍有20%～30%患儿在缓解后复发[1-3]，这与体内仍存在形态学无法检测的残留白血病细胞，即微小残留白血病（minimal residual disease，MRD）有关。

因此，在治疗过程中对白血病患者进行定期MRD检测，具有重要的临床指导意义。

目前用于临床评估MRD的技术包括流式细胞术（flow cytometry，FCM）、实时定量PCR（real-time quantification polymerase chain reaction，RQ-PCR）和原位荧光杂交等技术[4]，但是这些技术都有各自的局限，导致一定程度的漏检或假阳性，也都无法监测治疗过程中病人整体的免疫系统重建情况。

免疫组库测序技术（immune repertoires sequencing，IR-SEQ）的高灵敏度和高特异性，能够更加全面地检测MRD，在一定程度上弥补传统方法的不足。

1 免疫组库高通量测序技术的介绍1.1 高通量测序高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS），第二代测序技术，又被称为“下一代测序”（next generation sequencing，NGS）[5]。

二代测序技术具有很高的通量，能够同时并行检测几十万到几百万的DNA分子[6，7]，能够用来对进行基因组水平的转录组或者基因组的分析。

二代测序一般采用连接酶或者聚合酶，一般是同步化三磷酸核苷酸的洗脱和同步化的荧光检测方法相结合，采用“边合成边测序”的方法，输出短的连续性的DNA片段序列。

根据测序原理和技术的不同，主要的技术平台包括以下几种：Roche/454 FLX、Illumina Hiseq系列和ABI SOLID系列。

其中，应用做广泛的，仍然是Hiseq系列。

Illumina Hiseq测序技术其前身是solexa测序技术，依靠其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结”技术，能够实现样本制备的自动化和高通量的碱基大规模平行测序。

主要的步骤是：1）将待测的DNA制备成一定大小的DNA片段的文库，在片段的两端加上接头；2）将模板DNA加到芯片上，进行桥式扩增，形成DNA簇；3）进行边合成边测序。

边合成边测序的核心的原理是，在合成新的DNA互补链时，加入改造后的DNA聚合酶和带有荧光标记的4种dNTP，这些dNTP是“可逆性终止子”，其3’端带有化学修饰的部分，未切除掉该修饰时，不能连接下一个碱基，能够保证每轮反应只连接一个核苷酸。

在掺入单个碱基后，用激光扫描整个芯片，读取每条模板序列所聚合上的核苷酸种类，之后切除掉末端修饰，掺入下一个碱基，这样，统计每个循环的碱基种类，就得到了所测DNA片段的信息。

目前，Hiseq测序技术的序列读长已经可以达到2×250bp，其读长受到多种影响荧光信号的因素影响，例如荧光标记的不完全的切除。

总的来说，Illumina Hiseq系列具有通量较高、准确率较高、成本较低、所需要样本量少、简单快速等优点，是目前最常用的测序平台。

1.2 免疫组库技术免疫组库（immune repertoire，IR）是指，在一个特定时间点，某个样本的免疫系统中所有有功能的的T细胞和B细胞的总和，即人体的特异性免疫系统的细胞的总和。

免疫组库测序技术（immune repertoires sequencing，IR-SEQ）是用高通量测序的方法研究免疫系统中B细胞和T细胞的多样性和特异性的技术，因此，免疫组库技术的主要研究对象仍是BCR和TCR的CDR区。

由于BCR基因组成的V和J基因种类非常多，因此，需要采用多重PCR的方法对其进行扩增和捕获。

其原理是在B细胞表面受体的V基因和J基因的保守区域设计多重PCR引物，通过多重PCR技术扩增B细胞表面受体的互补决定区CDR3区域，用高通量测序的方法，对大量B细胞的CDR3区进行检测和识别，以此来研究免疫系统中复杂多样的B细胞和T细胞。

2 抗原受体基因重排用于MRD检测早在HTS技术出现之前，就有很多通过检测抗原受体基因重排检测急性淋巴细胞白血病的研究，应用较早还是RQ-PCR的技术。

M Brüggemann等的研究发现92%的T-ALL中存在克隆性的TRB基因重排，为TRB基因重排作为T-ALL微小残留病检测的分子标记奠定了基础[8]。

T Flohr等人同样利用RQ-PCR的技术，对儿童的急性淋巴细胞白血病的IHG基因和TCR的重排进行了研究，他们发现，在B细胞类型的急性淋巴细胞白血病中，83%的病人样本能够检测到IGH基因的重排[9]，除此之外，Michael J也进行了类似的研究，他们也是采用RQ-PCR的方法，在43个B-ALL样品中，有37个样本检测到了V-J的重排，有4个样本检测到了D-J的不完全重排[10]，这为后面的高通量测序方法提供了依据。

3 高通量免疫组库测序技术用于MRD检测HTS使测定复杂的适应性免疫分子成为可能，免疫组库测序技术应运而生，并展示了巨大的优势。

该技术分别在T/B细胞受体的V基因和J（或C）基因区设计引物，PCR扩增富集代表T/B细胞多样性的CDR3区域，然后分析测序得到的数十万条T/B细胞受体序列的多样性情况[11-13]。

2009年，Boyd等用Immu-Seq的方法在淋巴细胞增殖性疾病（如慢性淋巴性白血病）患者的外周血中找到克隆性增殖的抗体重链基因（IGH），第一次证明了用免疫组库高通量测序的方法检测MRD的可能性[11]。

2012，Harlan Robins实验室首先将免疫组库高通量测序技术用于T-ALL MRD的检测，发现免疫组库高通量测序方法的敏感性要高于流式细胞术，在白血病残留细胞的水平低于10-5时仍然可以检测到，而流式细胞术只能检测10-4以上的残留[14]。

随后，免疫组库高通量测序也被Malek Faham等人应用于B-ALL MRD检测的研究中，将ASO-PCR，流式细胞术和高通量检测技术做了对比，三种方式的检测结果具有很高的一致性，并且高通量测序的方法具有更高的分辨率，检测到更多的致病克隆[15，16]。

同时，他们也用同样的方法验证了急性淋巴细胞白血病的基因的二次重排的假说，即致病的B细胞在完成V-D-J基因的重排后，又将原来的V基因用一个新的V基因替换掉，进化出新的致病克隆，使得白血病细胞的基因和表型有所改变，而这种改变会导致传统RQ-RCR无法检测到残留的白血病克隆。

除了在检测MRD方面的应用外，免疫组库测序技术也被用来检测免疫重建的过程。

Aaron C.Logan等人，用高通量免疫组库测序技术来检测用造血干细胞移植的方法治疗的慢性淋巴细胞白血病的病人的免疫重建的过程，他们从诊断时一直检测到550天以上，发现在诊断时，病人的IGH基因图中中几乎全部是白血病克隆基因，在治疗后56天的时候白血病克隆的比例已经降低，但仍然存在，治疗后180天，白血病克隆完全消失，365天的时候病人的IGH基因图谱和健康人已经完全一样，预示着其免疫系统已经完全恢复[17]；并且可以通过检测到的白血病细胞残留情况预测预后效果，预测结果与临床结果一致[18]。

综上所述，用免疫组库高通量测序方法检测微小残留疾病，具有以下优点：无需针对患者设计特异PCR引物或探针，节省人力、时间等；操作简便，利于标准化，通量高，稳定性好；灵敏度高，可达到10-5数量级以上；检测整个抗原受体基因组变化情况，不会因为白细胞表面抗原表达的变化或白血病细胞的进化而漏检；动态监控患者免疫系统的变化情况及重建情况，提示预后效果。

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