第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告摘要：本实验旨在研究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法。

通过对感受态细胞的制备和转化实验的设计和操作，我们成功获得了转化子，并验证了转化效率。

实验结果表明，制备和转化感受态细胞是一种有效的基因工程技术，可用于基因克隆和表达研究。

引言：大肠杆菌是一种常见的细菌，在基因工程领域被广泛应用于基因克隆、表达和蛋白质生产等研究。

然而，大肠杆菌在自然状态下对外源DNA的吸收能力较差，因此需要将其转化为感受态细胞，以便进行基因操作。

感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的重要步骤。

本实验旨在探究大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法，并验证其可行性。

材料与方法：1. 大肠杆菌菌种：选用E. coli DH5α菌株作为实验对象。

2. 培养基：LB培养基。

3. 转化子：选用pUC19质粒作为转化子。

4. 热激转化：将感受态细胞与转化子混合后，通过热激转化的方法将外源DNA转化入细胞。

5. 酒精沉淀：将转化子沉淀后，通过酒精沉淀的方法提取转化子。

结果与讨论：在本实验中，我们首先制备了感受态细胞。

通过在LB培养基中培养大肠杆菌DH5α菌株，使其进入对外源DNA的吸收状态。

然后，我们将感受态细胞与转化子pUC19质粒混合，并进行热激转化。

转化子中的抗生素抗性基因能够在转化后表达，从而筛选出转化子。

最后，我们通过酒精沉淀的方法提取转化子。

为了验证转化效率，我们进行了转化效率测试。

将转化子接种到含有抗生素的LB平板上，培养一夜后，我们观察到形成了菌落。

通过计算菌落的数量，我们可以得出转化效率。

实验结果显示，转化效率达到了10^6 CFU/μg DNA，表明我们成功转化了感受态细胞。

感受态细胞的制备和转化是基因工程研究中的关键步骤。

通过转化外源DNA，我们可以将目标基因导入大肠杆菌，实现基因克隆和表达。

本实验中使用的热激转化和酒精沉淀方法是常见的转化方法，其简单易行，且转化效率高。

2 大肠杆菌感受态细胞的制备（钙转）及转化细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态被称之为感受态，一般认为处于感受态的细胞，其细胞膜的通透性增加，易于接受外源的DNA。

质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入感受态细胞的过程通常被称之为转化。

用于一般转化的感受态细胞应该是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配，这样能确保转入的DNA能够稳定复制，所携带的基因能顺利表达。

钙离子介导的大肠杆菌的质粒转化主要基于：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，丢失部分膜蛋白,细胞膜通透性增加；钙离子同添加进来用于转化的质粒DNA形成不易被DNA 酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物容易粘附于细菌细胞表面，以增加进入细胞的几率；42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。

进行转化操作的感受态细胞加入非选择性的液体培养基，在最适合生长温度（37℃）进行孵育和复苏，使得转入感受态细胞的外源DNA所携带的筛选标记等基因表达，以获得新的表型（如Amp抗性）；最后将复苏后的大肠杆菌涂布在筛选培养基固体平板上进行筛选即可。

钙离子的处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。

如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

感受态细胞制备及转化影响的主要因素：（1）细胞的生长状态和密度。

最好从－70℃或－20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的培养物，而不要用已经多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。

细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳，即应用对数期或对数生长前期的细菌。

菌体密度可通过测定培养液的OD600进行粗略的评价。

对大肠杆菌TG1菌株，OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。

大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。

由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。

本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。

感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。

为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。

常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。

培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。

感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。

首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。

培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。

其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。

最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。

感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。

转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。

转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。

常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。

质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。

将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。

转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。

热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。

电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。

化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。

转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。

第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。

为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从—70℃或—20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。

一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。

二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。

细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。

本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。

而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。

目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。

主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。

证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。

2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。

目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。

有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。

大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。

实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。

二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。

在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。

三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。

将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。

若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。

四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。

目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)随着基因工程和生物技术的发展，基因克隆和DNA转化技术已经成为生命科学研究的基本技术之一。

大肠杆菌是广泛应用的微生物基因克隆和表达系统，其中电转化是一种常用的DNA转化方法。

在电转化过程中，使用感受态细胞进行DNA 转化可以提高转化效率和获得更多的转化子。

因此，制备感受态细胞及其转化方法研究对开展基因克隆和表达等方面的研究具有非常重要的意义。

感受态细胞制备方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为Luria-Bertani（LB）培养基。

2.细胞质壁分离方法将DH5α菌株经过预培养后，用LB培养基洗涤一次，收集菌落后进行以下步骤。

•在含有1mM EDTA的冷0.5M葡萄糖缓冲液中洗涤细胞三次；•加入60mg/mL的亚胺青钾（IPTG）处理4小时取得感受态细胞。

3.细胞计数及保存使用平板计数器计数，将细胞用LB培养基稀释至约1 x 10^9/mL，添加10% v/v的甘油保存在-80℃。

电转化方法1.大肠杆菌菌株及培养基选择本实验使用大肠杆菌DH5α菌株，培养基为SOC培养基（Super Optimal broth with Catabolite repression）。

2.DNA处理方法将所需构建质粒经过酶切和纯化等操作处理后，加入所需菌株中进行转化。

3.转化操作•取感受态细胞保存液用LB培养基洗涤3次；•加入所需DNA，静置30分钟使其与感受态细胞充分结合；•以1mm间隔安置两条电极在电转化仪中；•用微管脚吸取约50μL细胞转移到抗电极侧的铝箔上，用蒸馏水润湿铝箔；•将铝箔上细胞转移到电极之间的空间内，使用脉冲电压脉冲电压 1.8 kV, 25 uF, 200Ω电阻取得转化产物。

以上是大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化的实验步骤。

感受态细胞制备方法和电转化方法的优化将提高转化效率和转化获得率，从而为生命科学研究提供更好的服务。

一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，大肠杆菌作为常用的基因工程受体菌，其感受态细胞的制备及转化方法对于基因克隆、表达以及基因功能研究等领域具有至关重要的意义。

传统的感受态细胞制备及转化方法往往存在转化效率低、细胞活性不稳定等问题，优化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法成为当前研究的热点。

本文旨在介绍一种经过优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，旨在提高转化效率，保证细胞活性，并简化操作步骤，为相关领域的研究提供更为可靠、高效的实验手段。

二、材料与方法1 大肠杆菌菌株：选用的大肠杆菌菌株应具备易于转化、生长迅速且遗传背景清晰的特性。

（1）从LB平板上挑取单菌落，接种至5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。

（2）次日，按1:100的比例将菌液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4-6。

（3）将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体。

（4）弃去上清液，用预冷的1M CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。

（5）再次4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体，并用预冷的含15%甘油的1M CaCl₂溶液重悬菌体。

（6）将感受态细胞分装至无菌的EP管中，每管50μl，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。

（2）向感受态细胞中加入适量的质粒DNA（或连接产物），轻轻混匀，冰浴30分钟。

（4）向EP管中加入500μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏45分钟。

（5）将复苏后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜。

为了提高转化效率，我们在传统的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法上进行了以下优化：（1）在菌液OD600达到4-6时进行感受态细胞的制备，此时菌体处于对数生长期，活性较高，有利于后续的转化。

（2）在制备感受态细胞时，使用预冷的1M CaCl₂溶液进行重悬，并在其中加入15%的甘油，以提高细胞的稳定性并防止冰晶形成。

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。

研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。

大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。

用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。

若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。

从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。

将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。

转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。

在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。

实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。

通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。

实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。

2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。

3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。

4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。

5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。

实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。

在37摄氏度下孵育过夜。

2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。

3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。

将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。

然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。

4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。

在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。

结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。

在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。

通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。

这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。

大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。