第八章- 1 - 第八章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatograph)
第一节 概述（Generalization）
以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、 高效液相色谱法的特点
目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小，分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，液膜厚度df大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料大多采用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题：一是柱流动阻力大大增大，因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大，要采用专业的装柱技术。
高效液相色谱习题及参考答案
一、单项选择题
1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（ ）。
A、分配色谱法 B、排阻色谱法 C、离子交换色谱法 D、吸附色谱法2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（ ）中被分离。
A、检测器 B、记录器 C、色谱柱 D、进样器
3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？
A、0.5μm B、0.45μm C、0.6μm D、0.55μm
4. 在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？
A、改变流动相的种类或柱子 B、改变固定相的种类或柱长
C、改变固定相的种类和流动相的种类 D、改变填料的粒度和柱长
5. 一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为（ ）
A、甲醇/水（83/17） B、甲醇/水（57/43）
C、正庚烷/异丙醇（93/7） D、乙腈/水（1.5/98.5）
6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（ ）检测器不能使用梯度洗脱。
A、紫外检测器 B、荧光检测器
C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器
7. 在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（ ）范围内。
A 、10～30cm B、 20～50m C 、1～2m D、2～5m
8. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（ ）
A、组分与流动相 B、组分与固定相
C、组分与流动相和固定相 D、组分与组分
9. 在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行（ ）的操作
高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程
高效液相色谱仪操作步骤：
1)． 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2)． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)． 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)． 进入HPLC控制界面主菜单，进入手动菜单。
5)． 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6)． 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。选用合适的流速，走基线，观察基线的情况。
7)． 设计走样方法。若需建立一个新的方法，选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。一个完整的走样方法需要包括：
a.进样前的稳流，一般2-5分钟；
b.基线归零；
c.进样阀的转换；
d.走样时间，随不同的样品而不同。
8)． 进样和进样后操作。进样时所有的样品均需过滤。方法走完后，记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9)． 关机时，先关计算机，再关液相色谱。
注意事项：
1)． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3)． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4)． 压力不能太大，最好不要超过2000 psi
HPLC的两个使用问题
HPLC的两个使用问题
1. 色谱柱中的流动相会排干吗？
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。
化学与材料工程学院
环境监测分析实验报告
实验名称： 高效液相色谱分析苯-甲苯混合物
专业班级： 应化13
学 号： 150313135
姓 名： 朱建南
指导教师： 翟春
实验地点： 敬行楼A210
实验日期： 2016年 11月 28日
高效液相色谱实验
一、 实验目的
1． 了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作；
2． 学习苯-甲苯混合物的定性分析方法；
3． 评价色谱柱柱效；
4． 了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；
5． 学习未知样品的定量分析方法。
二、 实验原理
不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等
1．色谱定性分析方法
a保留时间定性 b 峰高增量定性
2．色谱定量分析方法
a 归一化法,要求所有组分必须全部出峰。
b 标准曲线法（外标法）。简单、方便, 结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
三、 仪器与试剂
LC-1602A型高效液相色谱仪、甲醇(色谱纯) 、苯、甲苯、苯－甲苯
四、 高效液相色谱仪操作步骤
1. 流动相的预处理
甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 准备苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样
3. 高效液相色谱仪操作
a 依次高压输液泵和检测器电源开关；
b 打开色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，并开灯；
c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
