高效液相色谱谱图分析

第八章- 1 - 第八章 高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatograph)

第一节 概述（Generalization）

以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。

HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。

高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）是最常使用的化学键合相。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。

一、 高效液相色谱法的特点

目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。达到传质阻力小，分离效率高。早期HPLC的固定相用涂渍的方法制备，液膜厚度df大，这和GC一样，会大大降低色谱柱的柱效。现代HPLC填料大多采用键合固定相，其固定相膜很薄，因而大大提高了柱效。高效固定相会带来什么新问题呢？使用高效填料带来两个新问题：一是柱流动阻力大大增大，因此需要采用高压泵输液；二是表面能很大，要采用专业的装柱技术。

萘、联苯的高效液相色谱分析

指导老师：郭文英

实验人：王壮

同组实验：余晓波

实验时间：2016.3.21

一．实验目的

1. 理解反相色谱的优点及应用。

2. 掌握归一化定量方法。

3. 了解高效液相色谱仪的结构，掌握它的基本操作。

二．实验原理

在液相色谱中，若采用非极性固定相（如十八烷基键合相）和极性流动相，称为反相色谱法。这种方法特点适合于同系物、苯并系物的分离分析。萘、联苯在ODS柱上的作用力大小不等，则k＇值（k＇为不同组分的分配比）不等，在柱内的移动速率不同，因而先后流出柱子。根据组分峰面积大小及测得的定量校正因子，就可由归一化定量方法求出各组分的含量。采用归一化方法的条件是样品中所有组分都要流出色谱柱，并能给出信号。此法简便、准确，对进样量的要求不十分严格。

三．仪器及试剂

仪器：高效液相色谱仪；紫外吸收检测器（254nm）；色谱柱；微量注射器

试剂：甲醇（A.R.）,重蒸馏一次；二次蒸馏水；萘、联苯均为分析纯；流动相：甲醇/水=88/12；萘标准溶液；联苯标准溶液；萘、联苯混合试样。

四．实验内容

1. 打开仪器，并将实验条件调节如下：柱温为室温；流动相流量为1.0/minml；检测器工作波长为254nm。

2. 用甲醇把微量注射器洗3遍，再用萘和联苯的混合待测液润洗3遍，然后吸取10L混合液，顺时针打开六通阀，进样，2min后关闭六通阀，拔出微量注射器。记下各组分的保留时间和峰面积。重复两次。

3. 按上述操作分别注入萘、联苯的标准溶液，记下保留时间和峰面积。重复两次。

4. 实验结束后，将流动相流量逐渐降低，最后使得流动相为甲醇，关闭仪器。

五．结果处理

图1.联苯的液相色谱图

并得到联苯的保留时间16.050minRt 峰面积12209080.2AmAU

图2.萘的液相色谱图

得到萘的保留时间24.615minRt峰面积21634080.6AmAU

实验中标准物质的配制方法如下：准确称量0.08g萘，联苯0.02g，用重蒸馏的甲醇溶解，并转移到50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。且色谱仪的进样量为20L，则以联苯为标准物其质量120=0.02850LmggmL，萘的质量2200.08=32g50LmgmL

高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程

高效液相色谱仪操作步骤：

1)． 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2)． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3)． 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4)． 进入HPLC控制界面主菜单，进入手动菜单。

5)． 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6)． 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。选用合适的流速，走基线，观察基线的情况。

7)． 设计走样方法。若需建立一个新的方法，选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。一个完整的走样方法需要包括：

a.进样前的稳流，一般2-5分钟；

b.基线归零；

c.进样阀的转换；

d.走样时间，随不同的样品而不同。

8)． 进样和进样后操作。进样时所有的样品均需过滤。方法走完后，记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9)． 关机时，先关计算机，再关液相色谱。

注意事项：

1)． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3)． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)． 压力不能太大，最好不要超过2000 psi

HPLC的两个使用问题

HPLC的两个使用问题

1. 色谱柱中的流动相会排干吗？

不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。

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1 高效液相色谱法

一、原理

高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相，压入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。

二、适用范围

高效液相色谱法是一种分离分析方法，适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。中国药典主要用于药品的含量测定、有关物质检查、杂质限度检查和鉴别等。

三、仪器

高效液相色谱仪主要由输液泵系统、进样器系统、色谱柱、检测器、记录器、显示器及数据处理机（或兼有组分收集系统）等组成。使用时应按仪器的说明书进行操作。

四、仪器的校正

1.高效液相色谱仪的柱箱控温精度、基线噪声、基线漂移、灵敏度或检测限、线性范围的检定均按仪器说明书的技术要求进行校验，应符合规定。

2.以紫外-可见光检测器、荧光检测器、差示折光检测器为检测器的实验室通用液相色谱仪的检定，所用各种标准物质应使用经国家技术监督部门批准颁发的标准物质。具体校正方法和主要技术指标见“高效液相色谱仪检测器的校验”。

3.泵的耐压试验

4.泵流量设定值误差、流量稳定性误差的试验

5.柱恒温箱温度设定值误差和控温稳定性误差的试验

6.梯度准确度的试验

7.定性定量重现性的试验

五、对仪器的一般要求

1.色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶（正相色谱）和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶（反相色谱）最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。

2.药典正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。