铜绿假单胞菌噬菌体PaP2基因组的末端鉴定

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于环境中的革兰阴性杆状细菌，对人类和动物的健康带来了重要的威胁。

铜绿假单胞菌是一种常见的致病菌，特别是对免疫力低下的人群和患有囊性纤维化等疾病的患者来说，可能导致严重的感染和疾病。

噬菌体是一种专门感染细菌的病毒，可以促进细菌的快速寄主扩增和传播。

利用噬菌体进行铜绿假单胞菌的分离鉴定可以帮助我们更好地了解该菌株的特性和基因组信息。

铜绿假单胞菌噬菌体的分离可以通过环境样品的筛选和处理进行。

首先，我们可以收集不同环境中的样品，如土壤、水、医院洗手间等。

接下来，将采集到的样品进行取样，在无菌条件下进行菌落分离和培养。

将提取到的细菌溶菌液与靶菌进行混合培养，并在相关培养基上选择呈现清晰的菌落。

分离到的铜绿假单胞菌噬菌体可以进行鉴定。

通过电镜观察噬菌体的形态特征，如头部形状、基质的尾部形状等，可以初步判断其属于铜绿假单胞菌噬菌体。

进一步，可以通过传统的形态学特征结合分子生物学方法进行鉴定。

例如，进行噬菌体DNA的提取并使用PCR扩增常见的噬菌体基因，如大头蛋白基因和小头蛋白基因，进行测序和比对，以确定其属于铜绿假单胞菌噬菌体。

铜绿假单胞菌噬菌体的基因组学研究可以帮助我们深入了解其功能和特性。

首先，可以进行整个噬菌体基因组的测序和组装，以获取其完整的基因组序列。

这可以通过先进行高通量测序获取大量噬菌体DNA，然后使用生物信息学工具将测序得到的短序列片段组装成完整的基因组。

基因组学研究还可以揭示铜绿假单胞菌噬菌体的基因组结构特征，如基因数量、基因功能和组织方式等。

通过对基因组的分析，我们可以预测噬菌体的宿主范围和寄主特异性。

此外，基因组数据还可以为进一步研究噬菌体的功能基因和适应性基因提供线索，例如毒力相关因子和耐药基因等。

此外，基因组学研究还可以帮助我们了解铜绿假单胞菌噬菌体的进化历程和遗传变异。

第33卷 第4期 2018年8月天津科技大学学报Journal of Tianjin University of Science & TechnologyV ol. 33 No. 4 Aug. 2018收稿日期：2016-12-06；修回日期：2017-04-27基金项目：国家自然科学基金资助项目(31370205，30970114)作者简介：周 维（1990—），女，湖南人，硕士研究生；通信作者：杨洪江，教授，hongjiangyang@抑制铜绿假单胞菌生长的噬菌体K4基因的筛选周 维，孙 利，尤甲甲，杨洪江(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)摘 要：噬菌体基因组携带多种影响宿主菌生长的基因，是筛选新型抗菌素的可能靶位．本研究分别克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa )噬菌体K4携带的全部75个基因，在阿拉伯糖启动子控制下进行表达．实验结果表明，6个噬菌体基因的表达产物能够显著抑制宿主菌的生长．生物信息学分析显示，基因gp72编码的末端酶大亚基与噬菌体基因组包装过程相关，基因gp49编码假定的5′-3′核酸外切酶，其余4个基因编码产物未发现特定的蛋白结构域．利用脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA 的完整性，在阿拉伯糖诱导5h 时，蛋白Gp17、Gp41、Gp72、Gp29和Gp49能够导致宿主菌染色体DNA 的显著降解，这是抑制宿主菌生长的可能原因．蛋白Gp67对宿主菌染色体DNA 没有影响，其抑制细胞生长的机制不同于其他蛋白．实验还发现，筛选基因的产物还能影响噬菌体的感染效率．本研究发现的抑制细菌生长的基因，能够为筛选新型抗菌素提供新的靶位． 关键词：噬菌体K4基因；抑制生长；筛选中图分类号：Q71 文献标志码：A 文章编号：1672-6510(2018)04-0007-07Screening of Phage Genes Inhibiting the Growth ofPseudomonas aeruginosaZHOU Wei ，SUN Li ，YOU Jiajia ，YANG Hongjiang(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology ，Ministry of Education ，Tianjin Key Laboratory of IndustrialMicrobiology ，College of Biotechnology ，Tianjin University of Science & Technology ，Tianjin 300457，China ) Abstract ：Phage genes might inhibit the growth of host bacteria and are likely the targets for novel antibiotics screening ．In this research ，all 75genes of Pseudomonas aeruginosa phage K4were cloned and expressed under the control of arabinose promoter ，respectively ．Six of them might inhibit the growth of the host bacteria ．Bioinformatic analysis showed that gene gp72 encodes a terminase large subunit relating to phage genome packaging process ；gene gp49 encodes a hypothetical 5'-3' exonuclease ；and the remaining four genes encode hypothetical proteins with unknown functional domains ．Pulsed field gel electrophoresis was used in analyzing the chromosome DNA extracted from the host cells carrying the identified genes ．After arabinose induction for 5 h ，the strains expressing protein Gp17，Gp41，Gp72，Gp29，and Gp49，respectively ，had their ge-nome DNA degraded significantly ，and the possible cause is that the growth of the host had been inhibited ．No genome DNA degradation was observed in protein Gp67，indicating a different inhibition mechanism might be employed by the gene prod-uct ．Our data also show that the products of the isolated genes might affect the infection efficiency of the phage ．In conclu-sion ，the genes identified in our work inhibiting the growth of the bacteria may serve as new targets for screening novel an-timicrobial agents.Key words ：phage K4 gene ；growth inhibition ；screening抗生素的广泛使用导致细菌耐药性菌株不断出现．噬菌体作为一种新型杀菌剂，越来越引起人们的关注，不断有研究报道利用噬菌体治疗各种病原菌导致的疾病[1–4]．噬菌体通过编码裂解酶等因子，攻击DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20160398·8·天津科技大学学报第33卷第4期宿主菌的细胞外部结构，破坏宿主菌的胞壁质，裂解宿主菌，导致宿主菌死亡[5]．同时，噬菌体基因组携带多种基因，其编码蛋白能够控制细菌的多种代谢途径，达到抑制宿主菌生长或杀死宿主菌的目的．Datta 等[6]研究了λ噬菌体非致死基因对大肠杆菌(E．coli)生长的抑制作用，发现λ噬菌体N-cIts突变株中存在3种毒性因子对其宿主大肠杆菌生长有抑制作用．首先，其编码的O蛋白和P蛋白能够使溶源化细菌在42℃时被杀死．其次，λ噬菌体基因组中kil编码的Kil蛋白可能破坏细胞膜的外部结构，并与其他抑制组分共同作用，从而抑制宿主菌的生长．最后，λ噬菌体的cII基因产物能够抑制宿主菌染色体DNA的复制，从而抑制宿主菌的生长[7]．枯草芽胞杆菌(Bacil-lus subtilis)噬菌体SPO1基因组中，基因gp44、gp50和gp51是中期转录表达的基因，在未感染的枯草芽胞杆菌或大肠杆菌中表达时，其基因产物能够抑制细菌RNA的合成，从而导致宿主菌细胞的死亡[8]．噬菌体在长期进化过程中，其基因组具有极大的遗传多样性，能够编码多种特定蛋白质，具有阻止宿主菌细胞重要代谢过程的功能．一些噬菌体多肽识别宿主菌DNA复制和翻译机制的重要组成部分，从而阻止相应代谢途径的进行，导致细胞生长的停滞或死亡．Liu等[9]首先筛选具有抑制宿主菌生长的噬菌体基因，通过高通量技术在化合物文库中筛选潜在的抗菌素分子，以期获得具有杀菌活性的新型抗菌素．由于噬菌体是地球上种类与数量最多的生物，具有丰富的遗传多样性，该种筛选抗菌素的策略预计能够成为获得新型抗菌素的重要途径．本研究分别克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体K4携带的全部75个基因，在阿拉伯糖启动子控制下进行表达，观察其表达产物是否能够抑制宿主菌的生长．同时，利用脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA的完整性，分析噬菌体基因表达产物抑制宿主菌生长的可能机制．本研究结果将有助于发现筛选新型抗菌素的新靶位．1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌株与质粒大肠杆菌(E．coli)DH5α(hsdR recA lacZYΦ80 lacZΔM15)、铜绿假单胞菌[10](Pseudomonas aerugi-nosa)PAK(实验室菌株血清O6型)、质粒pRKaraRed[11](携带基因araC及P BAD启动子)均由本实验室保存．1.1.2培养基、抗生素与酶LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，pH 7.0～7.2．用于细菌常规培养．抗生素：氨苄青霉素100μg/mL、四环素6μg/mL．限制性内切酶Bam HⅠ和Sna BⅠ，TaKaRa公司；阿拉伯糖，北京博特普科学技术有限公司．1.1.3仪器PCR基因扩增仪、脉冲场凝胶电泳仪，美国Bio-Rad公司；全自动凝胶成像仪，北京原平皓生物技术有限公司．1.2 构建表达载体质粒及噬菌体K4基因克隆实验所用的质粒为pRKaraRed，利用Bam HⅠ将3个lambda-Red系统基因(exo、bet、gam)切除，自连得到质粒pZW1501，如图1所示[11]．X为噬菌体K4的75个基因中的一个基因；P BAD为阿拉伯糖启动子；araC为抑制因子，控制启动子P BAD的表达；tetA为四环素抗性标记基因图1质粒pZW1501构建及噬菌体K4基因克隆示意图Fig. 1Construction of plasmid pZW1501 for cloning phage genes根据已测定的噬菌体 K4基因组序列进行分析，发现K4基因组有75个基因．利用Primer Premier2018年8月 周 维，等：抑制铜绿假单胞菌生长的噬菌体K4基因的筛选·9·5.0软件进行引物设计，以噬菌体K4基因组DNA 为模板进行扩增．PCR 产物用限制性内切酶Sna B Ⅰ和Bam H Ⅰ酶切，与经相同酶切的载体质粒连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞，在含四环素6μg/mL 的 LB 培养基上筛选转化子，提取质粒并进行酶切验证(图1)．1.3 筛选影响宿主菌生长的基因将重组质粒电击转化进入铜绿假单胞菌PAK 菌株中，转化子在含有6μg/mL 四环素的LB 培养基中37℃振荡培养．将过夜培养的菌液转接至含有6μg/mL 四环素的新鲜LB 培养基中，实验组加2%的阿拉伯糖，对照组不加阿拉伯糖．37℃振荡培养5h ，测定600nm 下的吸光度．实验重复3次，按照式(1)计算相对菌体浓度．6006002%LB A A =阿拉伯糖培养基的相对菌体浓度培养基的(1)1.4 涂板计数法确认噬菌体基因的抑制作用按上述方法培养携带重组质粒的PAK 菌株，转接至新鲜的含有6μg/mL 四环素的LB 培养基中继续培养至A 600＝0.6．重新转接至含有四环素终质量浓度为6μg/mL 的LB 培养基中，实验组加入2%阿拉伯糖，对照组不加阿拉伯糖．继续培养，分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8h 取样，用0.9%的生理盐水进行稀释，然后涂布平板，实验重复3次． 1.5 生物信息学分析利用DNA Master 软件和SMART 蛋白结构域预测软件，在NCBI 核酸数据库进行比对分析，预测噬菌体 K4 基因编码蛋白的功能．1.6 脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA37℃过夜培养携带重组质粒的菌株，转接至新鲜的LB 培养基中，继续培养至A 600＝0.6，重新转接至新鲜含有6μg/mL 四环素的LB 培养基中，实验组加入2%的阿拉伯糖，对照组不加阿拉伯糖，37℃振荡培养5h ．收集2mL 菌液，5000r/min 离心5min弃上清液，细胞加入含0.5% SDS 裂解液，澄清后加入50μg/mL 蛋白酶K ，60℃过夜，过夜的混合物与指示剂溴酚蓝混合．将梳子放入胶槽，倒入熔化的低熔点琼脂糖，制成胶块．待胶块凝固后用移液枪将样品点入胶块中．以0.5×TBE 为电泳缓冲液，在14℃、120°、6V/cm 线性条件下电泳． 1.7 噬菌体敏感性检测敏感性实验采用双层点滴法进行[12]，将携带噬菌体基因的菌株作为指示菌，实验组培养基中含有2%阿拉伯糖，对照组培养基中不含阿拉伯糖．将K4裂解液稀释100倍，取1μL 点板，干燥后，倒置培养，每小时观察1次．2 结果与分析2.1 噬菌体K4基因组特征铜绿假单胞菌噬菌体K4基因组较小，全长为50284bp ，包含75个基因．通过生物信息学分析，发现噬菌体K4编码的大多数蛋白为功能未知的假定蛋白，只有少数基因产物具有已知功能．其中，基因gp49编码假定的5′-3′核酸外切酶，基因gp72编码末端酶大亚基，基因gp73编码门蛋白，基因gp74编码尾丝蛋白． 2.2 噬菌体K4基因对宿主菌生长的影响噬菌体基因组可能携带某些特定基因，其编码产物通过不同作用机制，控制宿主细胞的特定代谢途径，进而抑制细菌生长或杀死细菌．为了分析噬菌体K4基因是否具有类似功能，扩增并克隆了75个噬菌体基因，按照筛选影响宿主菌生长的基因的方法，分析基因的功能，结果如图2所示．*表示宿主菌生长受到抑制，◇表示宿主菌生长速率有所提高．1为菌株PAK/pZW1501，2—76分别为菌株PAK/pZW1501-gpX图2 噬菌体K4基因对宿主菌PAK 生长的影响Fig. 2 Effects of phage K4 genes on the growth of the host strain PAK·10·天津科技大学学报第33卷第4期实验结果发现，噬菌体K4的75个基因中，有6个基因在阿拉伯糖的诱导下，能够编码某种蛋白抑制其宿主菌铜绿假单胞菌PAK菌株的生长，它们分别是gp17、gp29、gp41、gp49、gp67、gp72．2.3 携带抑制基因的宿主菌生长时间曲线为验证噬菌体K4基因功能，进行平板计数实验．将菌株PAK/pZW1501分别在含有2%阿拉伯糖和不含阿拉伯糖的LB培养基上培养，实验结果如图3所示，阿拉伯糖不影响菌株PAK/pZW1501的生长．携带抑制基因的菌株生长时间曲线如图4所示．图3菌株PAK/pZW1501生长时间曲线Fig. 3Growth curve of strains PAK/pZW1501(a)菌株PAK/pZW1501-gp17(b)菌株PAK/pZW1501-gp29(c)菌株PAK/pZW1501-gp41(d)菌株PAK/pZW1501-gp49(e)菌株PAK/pZW1501-gp67(f)菌株PAK/pZW1501-gp72图4携带抑制基因的菌株生长时间曲线Fig. 4Growth curve of strains carrying the identified phage K4 genes with the inhibition function有4个基因编码的蛋白，能够明显地抑制宿主菌的生长，它们分别是gp17、gp41、gp49和gp72．图4(a)中gp17的表达产物从3,h开始抑制宿主菌的生长；图4(b)中gp29的表达的产物对宿主菌同样有抑制作用，但抑制作用较弱；图4(c)中基因gp41在阿拉伯糖诱导条件下，表达的产物在3,h后对宿主细胞的生长产生抑制作用；图4(d)中gp49编码的蛋白积累到5h后才对宿主菌有抑制作用；图4(e)中gp67编码的蛋白积累到一定量后导致宿主菌死亡；图4(f)中gp72编码的蛋白从3,h开始抑制宿主菌的生长．2018年8月 周 维，等：抑制铜绿假单胞菌生长的噬菌体K4基因的筛选·11·2.4 宿主菌生长相关基因的生物信息学分析从上述实验可知，铜绿假单胞菌噬菌体K4中有6个基因能对其宿主菌的生长有影响，对这些基因进行生物信息学分析，结果见表1．表1 噬菌体基因的生物信息学分析Tab. 1 Bioinformatic analysis of phage gene基因 氨基酸/个 功能gp17 85 假定蛋白；与 Pseudomonas aeruginosa 噬菌体KPP10假定蛋白KPPQO-gp070同源性为36%,[16]gp29 311 假定蛋白；与Salinivibrio 噬菌体CW02假定蛋白的同源性为38%,[17]gp41 98 假定蛋白；与Pseudomonas aeruginosa 噬菌体O4假定蛋白的同源性为100%,①gp49 293 假定5′-3′核酸外切酶；与Pseudomonas aeruginosa 噬菌体O4假定蛋白的同源性为100%,① gp67 179 假定蛋白；与Salinivibrio 噬菌体CW02假定蛋白的同源性为45%,[17]gp72536末端酶大亚基；与Salinivibrio 噬菌体CW02包装酶的同源性为74%,[17]注：①噬菌体O4基因组已经上传至GeneBank ，收录号为 NC -031274.1蛋白Gp49具有helix-hairpin-helix 结构，含有helix-hairpin-helix 结构的蛋白质具有原核生物DNA聚合酶5′核酸外切酶区域[13]，及真核和原核RAD2家族5′-3′核酸外切酶活性，如T4[14]的前体及一些病毒核酸外切酶．蛋白Gp72中具有ATP 酶活性中心．蛋白Gp72的ATP 酶活性中心与噬菌体T3末端包装酶大亚基的ATP 酶活性中心同源性为28%，蛋白Gp72 核酸内切酶活性中心与噬菌体T3末端包装酶大亚基核酸内切酶活性中心同源性为34%[15]． 2.5 脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA为了研究噬菌体K4基因抑制宿主菌生长的机制，在2%阿拉伯糖诱导5h 后，提取宿主菌染色体DNA ，利用脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA 的完整性，结果如图5所示．＋表示添加2%阿拉伯糖，-表示不加阿拉伯糖．染色体DNA 分别从以下菌株中提取：1. PAK/pZW1501-gp17；2. PAK/pZW1501-gp29；3. PAK/pZW1501-gp41；4. PAK/pZW1501-gp49；5. PAK/ pZW1501-gp67；6. PAK/pZW1501-gp72图5 脉冲场凝胶电泳分析Fig. 5 Pulsed -field gel electrophoresis蛋白Gp17、Gp29、Gp41、Gp49和Gp72能够显著降解宿主菌基因组DNA ，可能是造成宿主菌生长受到抑制的原因；蛋白Gp67对宿主菌基因组DNA 没有影响，其抑制细胞生长的机制不同于其他蛋白． 2.6 敏感性检测结果噬菌体K4基因产物对宿主菌生长具有影响，这些基因产物是否对噬菌体K4的感染过程也产生影响？按照噬菌体敏感性检测方法所述，分析了在重组菌株中噬菌体K4的敏感性变化，结果如图6所示．37℃培养5h 后，空白对照铜绿假单胞菌PAK 菌株及PAK/pZW1501菌株在添加2%阿拉伯糖或不加的诱导条件下，双层平板上均形成比较清晰噬菌斑．携带抑制作用基因的菌株在不加阿拉伯糖时，双层平板上出现清晰噬菌斑，而在阿拉伯糖质量分数为2%时，出现的噬菌斑是模糊的．这6个具有抑制宿主菌生长作用的基因中，通过功能预测基因gp49和gp72编码的蛋白质具有已知功能的结构域，而其余4个基因，编码的均为假定蛋白，功能尚不清楚．这6个基因表达的产物对宿主菌的生长均具有抑制作用，该6个基因可能通过抑制宿主菌的代谢过程，最终损伤了细胞的代谢活性即生理状态，从而导致了噬菌体K4感染效率的降低，从而形成模糊的噬菌斑．1. PAK/pZW1501；2. PAK/pZW1501-gp17；3. PAK/pZW1501-gp29；4. PAK/pZW1501-gp41；5. PAK/pZW1501-gp49；6. PAK/pZW1501-gp67；7. PAK/pZW1501-gp72图6 携带生长抑制基因菌株对噬菌体K4的敏感性分析 Fig. 6 Spotting assay of strains carrying genes of phage K43 讨 论在筛选噬菌体K4对宿主菌具有作用的基因时，发现噬菌体K4的gp72基因是噬菌体K4的末端酶大亚基，能够抑制宿主菌生长．末端酶大亚基是由400～750个氨基酸组成，以单体的形式存在于溶液中，主要有1个核酸内切酶活性中心与1个ATP 酶活性中心，具有ATP 酶活性、核酸内切酶活性和DNA 解旋酶活性．末端酶大亚基具有ATP 酶活性区域，这个区域水解ATP 释放出能量[18–19]．根据Hegde 等[20]研究发现，噬菌体T4的末端酶大亚基与门蛋白特殊结合的相互作用是噬菌体T4组装DNA·12·天津科技大学学报第33卷第4期过程中很重要的一步．另外也发现，噬菌体K4的gp49基因能够抑制宿主菌的生长，利用DNA master软件和SMART蛋白结构域预测软件，在NCBI核酸数据库进行比对分析，预测gp49编码的蛋白是假定5′-3′核酸外切酶．核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始依次催化水解3、5–磷酸二酯键、降解核苷酸的酶．核酸外切酶一般分为两种形式，单链的核酸外切酶与双链的核酸外切酶[21]．噬菌体核酸外切酶属于双链核酸外切酶，这种酶催化双链DNA分子从5′-P 末端进行逐步的水解释放出5′-单核苷酸，但不能降解5′-OH末端[22]．在DNA的复制过程中用到的相关酶及辅助因子有：DnaA、DnaB、DnaC、单链DNA结合蛋白(SSB)、RNA聚合酶、DNA解旋酶(拓扑异构酶Ⅱ)等；RAN聚合酶Ⅰ具有5′-3′核酸外切酶活性，这对DNA复制的忠实性(只作用于双链DNA碱基配对部分，从5′末端水解下核苷酸或寡核苷酸)极为重要，如果没有这种活性，DNA复制的错误将会大大增加[23]．蛋白Gp49是否具有5′-3′核酸外切酶活性还有待进一步研究．根据Sampath等[24]的研究结果表明，枯草芽胞杆菌噬菌体SPO1在抑制宿主菌专一性生物合成中的作用有两个，即抑制宿主菌基因的表达和抑制宿主菌DNA的合成．总RNA合成的减少，这样可能直接增加dNTP的储存量及在治疗中引起在DNA合成速率中dNTP不真实的降低．Datta等[6]的研究发现噬菌体λ的P蛋白影响其宿主菌大肠杆菌DnaA蛋白结合oriC DNA-链的功能．噬菌体λ,的P蛋白也影响大肠杆菌DnaA蛋白结合ATP的功能，DnaA蛋白是一种染色体复制发起蛋白，参与DNA复制的起始，DnaA也是ATP结合蛋白[25]．噬菌体感染细菌是一个复杂的过程，其感染效率制约于宿主菌细胞的生理状态，随着环境因素变化而不同[26]．本研究对噬菌体K4基因进行研究，发现噬菌体K4基因组携带着对宿主菌生长具有抑制的基因，编码多种具有不同功能的蛋白，影响细胞的多种代谢途径，最终损伤了细胞的代谢活性即生理状态，从而导致了噬菌体K4感染效率的降低，噬菌斑区域较对照模糊．在本研究中，由脉冲场凝胶电泳分析结果可知，铜绿假单胞菌噬菌体K4中6个抑制宿主菌生长的基因的抑制机制分为两种类型．第一种类型是gp17、gp29、gp41、gp49、gp72这5个基因抑制宿主菌生长的机制是一致的，这5个基因可能编码某种蛋白导致宿主菌染色体DNA的显著降解．第二种类型是gp67，该基因编码的蛋白不能导致宿主菌染色体DNA的降解来抑制宿主菌的生长，而是应用其他的抑制机制，比如抑制宿主菌的代谢途径等，这需要进一步的探索与研究．Molshanski-Mor等[27]运用高通量测序识别T7噬菌体的特征抑制基因序列．这一结果验证了通过识别噬菌体的基因来推断新靶点抑菌素方法的可行性，这也为治疗细菌感染提供了新的治疗途径．铜绿假单胞菌噬菌体K4的基因中大部分编码的ORFs是假定蛋白，而到目前为止，对已经完成测序的600多种噬菌体基因组序列分析表明，很大一部分预测的ORFs与现有数据库中的蛋白质序列无相似性；即使是人们研究最多的T4噬菌体，也有超过一半的ORF 功能没有明确[28]．这说明目前人们对大部分噬菌体的相关蛋白及其功能机制的研究少之又少，也就是说，通过研究噬菌体与宿主相互作用机制的前景巨大，这也将为噬菌体治疗、开发新的抗菌素及其应用的研究提供一定的基础．参考文献：［1］Gu J，Li X，Yang M，et al. Therapeutic effect of Pseudo-monas aeruginosa phage YH30 on mink hemorrhagicpneumonia[J]. Veterinary Microbiology，2016，190：5-11.［2］Biswas B，Adhya S，Washart P，et al. Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from a clinical isolate ofvancomycin-resistant Enterococcus faecium[J]. Infectionand Immunity，2002，70(1)：204-210.［3］Hanlon G W. Bacteriophages：An appraisal of their role in the treatment of bacterial infections[J]. InternationalJournal of Antimicrobial Agents，2007，30(2)：118-128. ［4］Taylor P W，Stapleton P D，Luzio P J. New ways to treat bacterial infections[J]. Drug Discovery Today，2002，7(21)：1086-1091.［5］王琰，陆承平. 噬菌体裂解酶的抗菌特性[J]. 微生物学报，2009，49(10)：1227-1281.［6］Datta I，Sau S，Sil A K，et al. The bacteriophage lambda DNA replication protein P inhibits the oriC DNA- andATP-binding functions of the DNA replication initiatorprotein DnaA of Escherichia coli[J]. Journal of Bio-chemistry and Molecular Biology，2005，38(1)：97-103. ［7］Kedzierska B，Glinkowska M，Iwanicki A，et al. Toxicity2018年8月周 维，等：抑制铜绿假单胞菌生长的噬菌体K4基因的筛选·13·of the bacteriophage λcII gene product to Escherichiacoli arises from inhibition of host cell DNA replication[J]. Virology，2003，313(2)：622-628.［8］Wei P，Stewart C R. Genes that protect against the host-killing activity of the E3 protein of B. subtilis bacterio-phage SPO1[J]. Journal of Bacteriology，1995，177(10)：2933–2937.［9］Liu J，Dehbi M，Moeck G，et al. Antimicrobial drug dis-covery through bacteriophage genomics[J]. Nature Bio-technology，2004，22(2)：185-191.［10］Bradley T J，Khan N H. The production of extracellular lipids by Pseudomonas aeruginosa NCTC 2000 in sta-tionary liquid media containing macrogols[J]. Journal ofPharmacy & Pharmacology，1974，26(11)：900-902. ［11］Liang R，Liu J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short ho-mology regions[J]. BMC Microbiology，2010，10：209. ［12］Yang H，Liang L，Lin S，et al. Isolation and characteriza-tion of a virulent bacteriophage AB1 of Acinetobacterbaumannii[J]. BMC Microbiology，2010，10：131. ［13］Urs U K，Murali R，Krishna Murthy H M. Structure of taq DNA polymerase shows a new orientation for thestructure-specific nuclease domain[J]. Acta Crystal-lographica，1999，55(12)：1971-1977.［14］Mueser T C，Nossal N G，Hyde C C. Structure of bacte-riophage T4 RNase H，a 5' to 3' RNA-DNA and DNA-DNA exonuclease with sequence similarity to the RAD2family of eukaryotic proteins[J]. Cell，1996，85(7)：1101-1112.［15］Pajunen M I，ElizondoM R，Skurnik M，et al. Complete nucleotide sequence and likely recombinatorial origin ofbacteriophage T3[J]. Journal of Molecular Biology，2002，319(5)：1115-1132.［16］Uchiyama J，Rashel M，Takemura I，et al. Genetic char-acterization of Pseudomonas aeruginosa bacteriophageKPP10[J]. Archives of Virology，2012，157(4)：733-738.［17］Shen P S，Domek M J，Sanz-Garcia E，et al. Sequence and structural characterization of great salt lake bacterio-phage CW02 a member of the T7-Like supergroup[J].Journal of Virology，2012，86(15)：7907-7917. ［18］Nemecek D，Gilcrease E B，Kang S，et al. Subunit con-formations and assembly states of a DNA-translocatingmotor：The terminase of bacteriophage P22[J]. Journalof Molecular Biology，2007，374(3)：817-836. ［19］Alam T I，Rao V B. The ATPase domain of the large terminase protein，gp17，from bacteriophage T4 bindsDNA：Implications to the DNA packaging mechanism[J]. Journal of Molecular Biology，2008，376(5)：1272-1281.［20］Hegde S，Padilla-Sanchez V，Draper B，et al. Portal-large terminase interactions of the bacteriophage T4 DNApackaging machine implicate a molecularlever mecha-nism for coupling ATPase to DNA translocation[J].Journal of Virology，2012，86(8)：4046-4057. ［21］Dizman Y A，Muratoglu H，Sandalli C，et al. Chilo iri-descent virus(CIV)ORF 012,L encodes a protein withboth exonuclease and endonuclease functions[J]. Medi-cal Microbiology，2016，161(11)：3029-3037. ［22］Mitsunobu H，Zhu B，Lee S J，et al. Flap endonuclease activity of gene 6 exonuclease of bacteriophage T7[J].Journal of Biological Chemistry，2014，289(9)：5860-5875.［23］王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2002：406-424.［24］Sampath A，Stewart C R. Roles of genes 44，50 and 51 in regulating gene expression and host takeover during in-fection of Bacillus subtilis by bacteriophage SPO1[J].Journal of Bacteriology，2004，186(6)：1785-1792. ［25］Erzberger J P，Mott M L，Berger J M. Structural basis for ATP-dependent DnaA assembly and replication-originremodeling[J]. Nature Structural & Molecular Biology，2006，13(8)：676–683.［26］Qin X，Sun Q，Yang B，et al. Quorum sensing influences phage infection efficiency via affecting cell populationand physiological state[J]. Journal of Basic Microbiol-ogy，2017，57(2)：162-170.［27］Molshanski-Mor S，Yosef I，Kiro R，et al. Revealing bacterial targets of growth inhibitors encoded by bacte-riophage T7[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，2014，111(52)：18715-18720.［28］Miller E S，Kutter E，Mosig G，et al. Bacteriophage T4 genome[J]. Microbiology and Molecular Biology Re-views，2003，67(1)：86-156.责任编辑：郎婧。

铜绿假单胞菌的鉴定及重组外膜蛋白免疫效果的初步研究的开题报告一、研究背景铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性菌，具有较强的耐药性和致病性，是医院感染和呼吸系统感染的主要病原体之一。

由于其致病力强，治疗难度大，已被世界卫生组织列为“高度危险病原体”。

目前对于铜绿假单胞菌的诊断和治疗仍面临诸多挑战，因此对其鉴定和免疫学研究具有重要意义。

二、研究内容1. 铜绿假单胞菌的鉴定：通过常规生化试验、分子生物学技术等方法，对铜绿假单胞菌进行鉴定，建立可靠的鉴定方法。

2. 铜绿假单胞菌外膜蛋白的免疫学研究：利用重组外膜蛋白进行免疫学研究，包括抗原性分析、免疫原性评价等，以期建立有效的免疫防治方法。

三、研究意义1. 为有效预防和控制铜绿假单胞菌感染提供科学依据。

2. 为开发新型铜绿假单胞菌疫苗提供技术支持。

3. 为进一步探究铜绿假单胞菌致病机制提供参考。

四、研究方法1. 从临床样本中分离铜绿假单胞菌。

2. 通过常规生化试验和分子生物学技术对铜绿假单胞菌进行鉴定和鉴定方法的优化。

3. 利用大肠杆菌作为表达宿主，构建重组外膜蛋白表达载体，并表达外膜蛋白。

4. 对重组外膜蛋白进行抗原性分析和免疫原性评价。

五、研究进度目前已完成对外膜蛋白表达载体的构建和外膜蛋白的表达。

下一步将进行外膜蛋白的纯化和鉴定方法的优化。

预计在两年内完成研究任务。

六、研究预期结果1. 建立铜绿假单胞菌的鉴定方法，并验证其可靠性。

2. 研究铜绿假单胞菌外膜蛋白的免疫学效应，为疫苗研发提供技术支持。

3. 探究铜绿假单胞菌致病机制，为其防治提供参考。

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铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其控制生物被膜的应用研究李玲艳;杨洪江;岳华【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2011(031)004【摘要】目的分离鉴定铜绿假单胞菌烈性噬菌体,研究噬菌体控制宿主菌形成牛物被膜的效率.方法以铜绿假单胞菌临床菌株为指示菌,从不同环境样品中分离噬菌体;采用限制性内切酶图谱分析和宿主范围测定方法,对分离的噬菌体进行分类;利用透射电子显微镜对分离噬菌体进行形态学研究;以TJC729为指示菌,开展噬菌体控制牛物被膜形成的应用研究.结果分别以14株铜绿假单胞菌临床分离菌株为指示菌,共分离得到13株烈性噬菌体,命名为C1～C13.利用限制性内切酶EcoR Ⅰ分析结果表明,13株噬菌体基因组均为双链DNA,并可被分成8组;宿主谱测定结果显示,c1和C13、C6和C7、C9和C11分别具有相同的宿主范围,其余7株噬菌体的宿主范围各不相同.随机挑选噬菌体C1进行形态学研究,发现噬菌体C1头部具有二十面体结构,尾部较长且无收缩性尾鞘,属于长尾噬菌体科.生物被膜控制实验结果显示,混合噬菌体能够较好地抑制TJC729生物被膜的形成.进一步实验结果显示,噬菌体C1、C10和C12分别与牛物被膜混合培养24 h后,牛物被膜的量分别下降到初始量的32.7%、57.6%、32.8%.结论分离了13株铜绿假单胞菌烈性噬菌体,它们能够显著抑制宿主菌生物被膜的形成,并对生物被膜造成一定程度的破坏,为控制铜绿假单胞菌引起的感染提供了一个新方法.%Objective To isolate and classigy the bacteriophages specific to Pseudomonas aetuginosa and to investigate biofilm control efficaey of the isolated virulent phages.Methods With P. aeruginosa clinical strains as indicators.bacteriophages were isolated byscreening difierent environmental samples.Classification of the isolated phages was done with the methods of restriction fragment analysis of phage genome and host range analysis.Transmission electron microscopy(TEM)was used in phage morphology study.In biogilm control tests,TJC729 was used as the jndicator strain to study the biofilm control efficacy of the isolated phages.Results Total 13 lytic phages specific to P.aeruginosa strains were isolated and named as C1-C13.According to the result of restriction fragment analysis.all 13 phages were double-stranded DNA viruses and could be divided into eight groups.Host range experiments were conducted with 5 laboratory strains and 12 clinical strains of P. aeruginosa.The same infection profiles were observed among phage C1 and C13,C6 and C7,and C9 and C11,respectively.While the remaining 7 phages each had different unique infection profile.Phage C1 was selected randomly to study its morphology.The obtained images showed that phage C1 had an icosahedral head with a non-contractile tail,belonging to the Siphoviridae pared with the single phage,phage cocktail had the best effect on biofilm control.Further experiment results showed that phage C1.C10 and C12 can destroy biofilm after treatment of the biofilm for 24 h.The biofilm amounts were deceased to 32.7%,57.6%and 32.8%of the initial values,respectively.Conclusion Thirteen virulent phages specific to P. aeruginosa had been isolated.The phages could significantly inhibit the biofilm formation and had a certain degree of damage on the biofilm.The results suggested an alternative method for the treatments of P.aeruginosa infections.【总页数】5页(P330-334)【作者】李玲艳;杨洪江;岳华【作者单位】300457,天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室;300457,天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室;300457,天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室,天津市工业微生物重点实验室【正文语种】中文【相关文献】1.噬菌体作用细菌生物被膜的研究进展2.铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定3.犬源奇异变形杆菌噬菌体分离、鉴定及对生物被膜的作用4.噬菌体vB_SauM_RS对乳源金黄色葡萄球菌生物被膜的清除作用5.溶原性噬菌体对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3一个结构蛋白的N-端测序及编码基因的确定张克斌;金晓琳;朱军民;陈志瑾;饶贤才;胡福泉【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2003(25)13【摘要】目的确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的主要结构蛋白基因。

方法将噬菌体PaP3颗粒用CsCl梯度离心纯化 ,SDS PAGE电泳其结构蛋白后 ,电转印于PVDF膜上 ,再用Edman降解法对主要结构蛋白作N端测序 ,根据蛋白N端 5个氨基酸残基序列逆推其编码读框。

结果PaP3主要结构蛋白的N端 5个氨基酸残基顺序为 :Ala Thr Pro Thr Asn。

结论据此推定其编码基因为ORF 3 63 5 4～3 73 0 7(负链 )编码的蛋白 ,该蛋白共有 3 18氨基酸 ,其等电点为 7 70 ,分子质量为3 5 0 2 4 46。

【总页数】3页(P1140-1142)【关键词】铜绿假单胞菌;噬菌体;蛋白质;N端测序【作者】张克斌;金晓琳;朱军民;陈志瑾;饶贤才;胡福泉【作者单位】第三军医大学基础医学部微生物学教研室【正文语种】中文【中图分类】Q939.48;R394-33【相关文献】1.铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶基因的克隆表达及生物学活性 [J], 贾鸣;胡晓梅;孙卫忠;饶贤才;丛延广;胡福泉2.铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组电转化宿主菌的条件初探 [J], 周莹冰;申晓冬;丛延广;李明;黄建军;胡晓梅;胡福泉3.铜绿假单胞菌噬菌体PaP1主要结构蛋白编码基因的确定 [J], 李明;黄建军;申晓冬;胡晓梅;饶贤才;胡福泉4.铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的结构蛋白及其编码基因的研究 [J], 黄建军;胡晓梅;朱军民;申晓冬;李明;饶贤才;胡福泉5.铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组测序 [J], 张克斌;金晓琳;朱军民;胡晓梅;饶贤才;胡福泉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

铜绿假单胞菌的鉴定方法与技术进展铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阴性杆菌。

它是一种多重耐药的病原菌，对众多常用抗菌药物表现出不同程度的耐受性。

鉴定铜绿假单胞菌的方法及技术的进展对于临床医学、环境卫生以及食品安全等领域具有重要意义。

一、传统鉴定方法1. 形态学特征：铜绿假单胞菌在常规琼脂平板上生长呈青绿色，细菌呈短杆状或不规则杆状，革兰染色呈阴性，不产生孢子。

2. 生理和生化特性：铜绿假单胞菌可利用较多种类的碳源生长，产生草酸酶、葡萄糖氧化酶等酶类。

此外，它还可产生金黄色脆忻素、绿色芽孢杆菌素等色素。

3. 血清学鉴定：通过血清学反应检测铜绿假单胞菌所产生的O抗原和Vi抗原，结合凝集试验、血凝试验等方法进行鉴定。

二、分子生物学鉴定方法随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学方法被用于铜绿假单胞菌的鉴定和检测。

1. 16S rRNA基因测序：16S rRNA基因是细菌共有的基因，在物种鉴定上具有较高的特异性和可溯源性，通过对铜绿假单胞菌菌株进行16S rRNA基因测序，可以快速准确地鉴定其物种。

2. 基因片段PCR：利用铜绿假单胞菌特异基因片段进行PCR扩增，如oprL基因、oprD基因等，通过特异性条带出现可以判断是否为铜绿假单胞菌。

3. 多重PCR技术：多重PCR技术可以通过扩增多个特异基因片段，提高检测的特异性和灵敏度，如gyrB、rpoB、27-kDa等基因片段。

三、质谱法质谱法是近年来快速进行菌种鉴定的一种方法，其应用已得到广泛推广。

主要有飞行时间质谱法、荧光定量PCR结合质谱法、表面增强激光解析电离质谱法等。

这些质谱方法可以通过菌株代谢产物的分子质量进行鉴定。

四、胶体金技术胶体金技术通过标记特异性抗体或引物，利用胶体金颗粒作为信号素，通过胶体溶液在酶或免疫检测中的特异性反应，可以高度敏感地鉴定铜绿假单胞菌。

五、纳米生物传感器纳米生物传感器是一种新兴的鉴定技术，通过利用纳米材料的特殊性质以及生物传感机制来实现铜绿假单胞菌的高灵敏度检测。

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其基因组学研究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugonosa）在医学上称为绿脓杆菌。

该菌具有极强的环境适应能力和对多种抗生素的耐受能力。

对于人体，绿脓杆菌是最重要的条件致病菌，是创伤、烧伤及免疫受损机体最容易感染的细菌之一，严重地危害着人类的健康与生命。

噬菌体（Bacteriophage）是细菌的病毒，它与宿主菌关系密切。

一方面，溶原性噬菌体通过自身携带的外源性遗传物质改变宿主菌的生物学性状，同时，在与宿主菌基因组不断地重组、整合、转座和切离过程中彼此交换遗传物质，影响宿主菌及自身基因的多样性，成为除质粒之外的一股重要基因流（genestream），在生物之间介导着基因的水平转移（horizontal transfer）；另一方面，基于裂菌性噬菌体能特异性裂解宿主菌，也基于如果诱导前噬菌体进入裂菌性生长周期就可导致细菌裂解，噬菌体有望发展成为抗细菌感染的生物制剂。

不管是想研究噬菌体与细菌间相互作用关系，揭示噬菌体介导的基因水平转移所导致的生物多样性等重大问题，还是研究噬菌体的工程改造和噬菌体治疗，都需要对噬菌体及其宿主菌的遗传学背景有极清楚的认识。

最近，绿脓杆菌PA01菌株全基因组测序工作已完成，而绿脓杆菌噬菌体的基因组研究工作的积累仍非常有限。

为此，本研究以绿脓杆菌为宿主菌，成功分离了3株新的噬菌体，对其中两株（一为溶原性噬菌体，一为裂菌性噬菌体，二者具有一相同的宿主菌）展开了全基因组测序。

井对已完成测序的PaP3展开了基因组学研究和某些基因功能的研究。

主要内容及实验结果包括以下几方面： 1．以绿脓杆菌临床分离株为宿主菌，从医院下水道污水中分离到3株绿脓杆菌噬菌体，分别命名为 PaPI、PaPZ和 PaP3。

其中 PaPI是裂菌性噬菌体，PaPZ和PaP3是溶原性噬菌体；电镜结果表明PaPI为有尾噬菌体，PaPZ、PaP3为短尾噬菌体；按国际上分类标准，PaPI属肌尾噬茵体科m），PaPZ和PaP3属短尾噬菌体科（Pedoviridae）；三株均为双链DNA噬菌体。

铜绿假单胞菌的菌种鉴定
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性细菌，通常是一种耐药性很强的致病菌。

对于铜绿假单胞菌的鉴定可以从多个角度进行：
1. 形态特征，铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性杆菌，通常呈杆状。

在培养基上形成圆形、平滑、有金属光泽的绿色或蓝绿色细菌落。

2. 生理生化特征，铜绿假单胞菌对氧的需求较高，是一种好氧菌。

它能够利用多种碳源和氮源进行代谢，产生酶类如氧化酶和蛋白酶。

此外，铜绿假单胞菌还能产生金属螯合物和溶解磷酸盐等特性。

3. 生化试验，进行一系列生化试验，如氧化/发酵葡萄糖、产气、利用麦尔刻姆盐基本培养基等试验，可以帮助鉴定铜绿假单胞菌。

4. 分子生物学鉴定，利用PCR技术对细菌的16S rRNA基因进行扩增和测序，然后与已知的铜绿假单胞菌的序列比对，可以准确
鉴定出细菌的种属。

总的来说，铜绿假单胞菌的鉴定需要结合形态特征、生理生化
特征、生化试验和分子生物学方法，综合分析才能做出准确的鉴定。

这些方法的综合运用可以帮助科研人员和临床医生准确诊断和治疗
相关感染。