黄曲霉生长条件

霉菌的发育和产毒条件
霉菌是一种生活在我们周围的微生物。

虽然有些霉菌对我们有益，如产生某些药物和食品，但有些却对我们健康和食品安全造成威胁。

这是因为一些霉菌能够产生毒素，如“赭曲霉毒素”、“黄曲霉毒素”等，这些毒素会对人体健康造成伤害。

那么，霉菌的发育和产毒，与
哪些因素有关呢？
第一，温度。

霉菌的生长速度与温度密切相关。

温度过高或过低
都不利于霉菌的生长，它们适宜的生长温度一般在20℃-30℃之间。

在这个温度范围内，霉菌的生长速率较快，容易产生大量毒素。

第二，湿度。

霉菌对湿度也非常敏感。

高湿度环境容易使霉菌生
长迅速，因此，在潮湿的环境中存放的食品容易受到霉菌的污染。

第三，营养。

霉菌需要营养才能生长繁殖。

它们通常以植物和动
物的残渣、粪便、饲料等为食物，还可以使用一些有机物质为能源。

第四，氧气。

霉菌经常是好氧生物，需要氧气进行呼吸。

一些霉
菌也可以在低氧环境中存活，但它们的生长速度会大大减缓。

综上所述，要防止霉菌的产生，就要控制它们的生长发育条件：
避免过高或过低的温度和湿度、妥善存放食品、保持清洁、尽量减少
有机物质的堆积等。

另外，我们消费食品时要尽可能选择新鲜的、质
量安全的食品，避免食用发霉的食品。

黄曲霉毒素的理化性质及生成因素作者：来源：《食品界》2017年第04期黄曲霉毒素（AFB）是一种由若干真菌，例如隶属于曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉产生的一种次生型代谢型产物。

AFB1的发现与分离主要归因于1960年代，在英国发生一起神秘的数十万只火鸡突发性死亡事件，该事件给当地养禽业带来了巨大的经济损失。

那时人们还不能正确的认识黄曲霉毒素，只能暂时将其称为“火鸡X病”。

后来调查发现，当时火鸡和其他农场动物的大规模死亡，其起因是与一种从巴西进口的发霉花生粕有关。

霉变的花生粕被添加进了动物饲料从而导致了动物的患病与死亡。

该可疑因子能被氯仿抽提出来，同样在1961年，人们发现了其与黄曲霉菌之间存在某种关联。

1962年，科学家提议，使用Aspergillus（曲霉菌属）的首字母合并flavus（黄色的）的前三个字母，将其命名为aflatoxin（黄曲霉毒素）。

自从黄曲霉毒素被发现以来，它对人类和动物健康的消极影响便是个炙手可热的研究领域。

黄曲霉毒素主要发生在热带和亚热带，特别是气候炎热而又潮湿的地区，这种气候可以极大的促进真菌的生长和产毒。

同时，落后的农业生产、错误的贮藏方式和匮乏的运输与经销，均是导致毒素污染和诱发相应疾病的主因。

人类接触黄曲霉毒素主要是通过消化道的直接摄入被污染的食物，或者是间接地食用先前吞食了受黄曲霉毒素污染饲料的动物。

黄曲霉毒素的理化性质1962年，荷兰科学家们分离纯化出了黄曲霉毒素的晶体，并将其分为B型和G型。

随后，Asao等进一步的将B型分为B1和B2型，并描绘出它们各自的独特化学结构特征。

经过几代科学家的研究探明，黄曲霉毒素是一类化学结构相类似的二呋喃香豆素衍生物，其基本结构为1个二呋喃环和1个氧杂萘邻酮（香豆素）组成。

前者属于基本毒性结构，而后者与致癌性有关。

目前已分离鉴定出黄曲霉毒素的20余种异构体。

其中最常见的有黄曲霉毒素 B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2 （AFB2）、黄曲霉毒素 M1 （AFM1）、黄曲霉毒素 M2（AFM2）等（见图 1）。

黄曲霉菌生殖方式引言黄曲霉菌（Aspergillus flavus）是一种常见的真菌，它广泛存在于自然界中的土壤、植物和食品中。

黄曲霉菌对人类和动物具有重要的经济和食品安全意义，因为它能产生黄曲霉毒素，对人和动物的健康造成威胁。

了解黄曲霉菌的生殖方式是研究和防控其生长和毒素产生过程的重要基础。

二级标题1：黄曲霉菌的生殖方式概述黄曲霉菌的繁殖主要通过两种方式进行，分别是无性生殖和有性生殖。

三级标题1：无性生殖无性生殖是黄曲霉菌最常见的繁殖方式，也是其主要的繁殖方式之一。

无性繁殖方式包括产孢体的产生和传播。

1.产孢体的产生在适宜的环境条件下，黄曲霉菌会形成大量的孢子。

孢子是无性生殖的结果，它们具有很强的存活能力，并能快速繁殖。

2.产孢体的传播黄曲霉菌的孢子可以通过多种途径传播，包括风、水、土壤以及动物和人体表面等。

一旦孢子附着在适宜的基质上，它们会迅速萌发并形成新的菌丝体。

三级标题2：有性生殖有性生殖在黄曲霉菌的生命周期中相对较少见。

有性生殖会在特定的环境条件下发生，一般与无性生殖交替进行。

1.有性生殖的触发条件有性生殖的发生需要特定的环境条件，如食物充足、湿度适宜、温度适宜等。

这些条件有助于促进黄曲霉菌的有性生殖产生。

2.有性生殖的过程在有性生殖过程中，黄曲霉菌的两个菌丝体进行交配，将其细胞核互相融合，形成新的菌丝体。

这种有性生殖方式有助于增加黄曲霉菌的遗传多样性。

二级标题2：黄曲霉菌的繁殖周期黄曲霉菌的繁殖周期包括孢子的形成、孢子的传播以及新菌丝体的形成。

了解黄曲霉菌的繁殖周期有助于判断其繁殖能力和传播途径。

三级标题1：孢子的形成黄曲霉菌的无性生殖方式主要通过孢子的形成进行。

当环境条件适宜时，黄曲霉菌会产生大量的孢子，这些孢子具有很强的存活能力，并能在适宜的环境下迅速发芽。

三级标题2：孢子的传播黄曲霉菌的孢子可以通过风、水和动物等途径传播。

风是孢子传播的最主要途径，因为孢子很轻，容易被风吹动并传播到远处的地方。

有关黄曲霉菌和其毒素的描述全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：黄曲霉菌是一种常见的真菌，其产生的毒素会对人体和动物的健康造成严重危害。

黄曲霉菌最常见的毒素是黄曲霉素，它是一种具有强烈肝毒性的有机化合物，对人体的肝脏造成严重损害。

除了黄曲霉素之外，黄曲霉菌还会产生其他一系列毒素，如赭曲霉素、麦角菌素等，它们会引起不同程度的中毒反应。

黄曲霉菌在自然界中广泛存在，常生长在潮湿、温暖的环境中，如发霉的谷物、果蔬、坚果等食品上。

一旦食品被黄曲霉菌污染，就可能产生毒素，对人体造成危害。

黄曲霉菌的毒素具有热稳定性，在一定温度下不易被破坏，因此即使食品加热也不能完全去除毒素。

食用被污染的食品后，人体可能出现黄曲霉菌毒素中毒的症状。

轻微中毒症状包括头痛、头晕、恶心、呕吐、腹泻等，严重中毒则可能导致肝功能损害、黄疸、肝癌等严重后果。

长期摄入含有黄曲霉菌毒素的食物，还会增加患癌症、肝硬化等疾病的风险。

为了防止黄曲霉菌及其毒素对人体的危害，我们可以采取一些预防措施。

保持食品清洁卫生，避免食用发霉食品。

储存食品时要注意通风干燥，防止黄曲霉菌的生长。

食品加工过程中要遵循卫生标准，避免污染。

建议选择新鲜、质量可靠的食品，避免长时间食用过期食品或贮存不当的食品。

当发现食品有发霉的迹象时，应及时丢弃，避免继续食用。

如果食用食品后出现不适症状，应及时就医，避免延误治疗。

在日常生活中，我们应该增强对黄曲霉菌及其毒素的认识，提高食品安全意识，保护自己和家人的健康。

黄曲霉菌及其毒素是一种常见的食品安全隐患，对人体健康造成严重危害。

为了预防中毒事件的发生，我们应该加强食品安全意识，正确储存、处理食品，避免食用发霉食品，及时处理发现的风险食品。

只有保持警惕和谨慎，我们才能远离黄曲霉菌及其毒素的威胁，保障自己和家人的健康和安全。

第二篇示例：黄曲霉菌（Aspergillus flavus）是一种常见的霉菌，广泛存在于自然界中。

这种霉菌主要寄生在玉米、花生、大米、小麦、大豆、燕麦等谷物和豆类上，尤其是在温暖潮湿的环境中容易生长。

花生油黄曲霉素引言黄曲霉素（Aflatoxins）是一类由真菌黄曲霉（Aspergillus flavus和Aspergillus parasiticus）产生的有害化合物。

它在自然界广泛存在于土壤、植物及动物产品中，比如谷物、坚果、油料、肉类等。

花生油是一种常见的油料，而黄曲霉素也可能存在于花生油中，对人体健康造成潜在的威胁。

本文将探讨花生油中的黄曲霉素的来源、危害以及如何避免。

黄曲霉素的来源黄曲霉素的来源主要包括以下几个方面：1.黄曲霉的存在：真菌黄曲霉广泛存在于土壤、植物及动物产品中，它们可以在适宜的温度和湿度条件下生长繁殖。

因此，花生油中的黄曲霉素可能是由花生种子本身或者种子表面的黄曲霉菌所产生。

2.采收和储存条件：花生种子的采收时间和储存条件也可能影响花生油中黄曲霉素的含量。

果实采收过程中的损伤、霉菌污染以及不适宜的储存条件都可能导致黄曲霉素污染的风险增加。

3.加工过程：花生种子经过加工后才能得到花生油，其中的加工过程可能会对黄曲霉素的含量产生影响。

比如，如果花生种子在加工过程中受到了霉菌污染或者经过不充分的清洁处理，就会导致花生油中黄曲霉素的含量升高。

黄曲霉素的危害黄曲霉素对人体健康有一定的危害性。

长期暴露于高浓度的黄曲霉素会引起黄曲霉素中毒，表现出多种症状，包括肝脏损害、免疫抑制、致癌等。

以下是黄曲霉素可能对人体造成的危害：1.肝脏损害：黄曲霉素主要在肝脏中代谢，长期高剂量暴露可能导致肝损害，如肝细胞坏死、纤维化和癌变。

2.免疫抑制：黄曲霉素对免疫系统有一定的抑制作用，可能使人体对感染和疾病的抵抗能力下降。

3.致癌作用：大量的研究表明，黄曲霉素是一种致癌物质，可能增加各种癌症（如肝癌、结肠癌等）的风险。

如何避免花生油中的黄曲霉素为了保证花生油的安全，我们应该采取以下措施来避免花生油中的黄曲霉素：1.品牌选择：选择正规的品牌产品，他们通常会对生产过程进行严格的控制和监测，以确保产品的安全性。

霉菌繁殖的适宜温度一、引言霉菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，其生长和繁殖受到许多环境因素的影响，其中温度是最为重要的因素之一。

本文将详细介绍霉菌繁殖的适宜温度范围及其相关知识。

二、霉菌简介1. 霉菌的分类霉菌是真菌门中一个广泛存在于自然界中的类群，包括黄曲霉、青霉、黑曲霉等多种不同种类。

根据其形态和生物学特征，霉菌可以分为接合菌门、子囊菌门、担子菌门和真菌门等不同类群。

2. 霉菌的特点与其他微生物相比，霉菌具有以下几个特点：（1）体型较大，能够裸眼可见；（2）在适宜条件下能够形成大量孢子；（3）能够利用各种有机物进行代谢；（4）对环境因素变化敏感，易受外界干扰。

三、温度对霉菌繁殖的影响1. 温度对霉菌繁殖速率的影响温度是影响霉菌生长和繁殖的最为重要的环境因素之一。

在适宜温度下，霉菌能够迅速繁殖，而在过高或过低的温度下，霉菌的生长和繁殖速率将受到限制。

2. 霉菌对不同温度的适应性不同种类的霉菌对温度的适应性有所不同。

一般来说，大多数霉菌在20℃-30℃范围内能够迅速繁殖，而在40℃以上则会停止生长。

此外，一些耐高温的霉菌能够在50℃以上存活并繁殖。

四、常见霉菌及其适宜温度范围1. 黄曲霉黄曲霉是一种常见的霉菌，在食品、饲料等领域中广泛存在。

其适宜生长温度为20℃-30℃，最低生长温度为12℃，最高生长温度为42℃。

2. 青霉青霉是一种广泛存在于自然界中的真菌，在食品加工、医药等领域有重要应用。

其适宜生长温度为20℃-30℃，最低生长温度为5℃，最高生长温度为40℃。

3. 黑曲霉黑曲霉是一种产生黄酮类化合物的真菌，在医药、食品等领域中有广泛应用。

其适宜生长温度为20℃-30℃，最低生长温度为10℃，最高生长温度为42℃。

五、结论总体来说，霉菌的繁殖速率和适应性都与温度密切相关。

在实际应用过程中，需要根据不同的霉菌种类和具体环境条件选择适宜的温度范围进行控制和调节。

2005～2006学年第二学期《食品安全导论》试题（A卷）答案及评分标准一、名词解释（每题3分）1．保质期是指在标签上规定的条件下，保持食品质量（品质）的期限。

在此期限，食品完全适于销售，并符合标签上或产品标准中所规定的质量（品质）；超过此期限，在一定时间内，食品仍然是可以食用的。

2．食源性疾病是指通过摄食进入人体内的各种致病因子引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。

（或者食源性疾病是指感染性和有毒性物质伴随食物进入人体所引起的疾病。

）3．食物中毒是指摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后所出现的非传染性（不同于传染病）急性、亚急性疾病。

食物中毒属于食源性疾病的范畴。

4．绿色食品是在生态环境符合国家规定标准的产地，生产过程中不使用任何有害化学合成物质，或在生产过程中限定使用允许的化学合成物质，按特定的生产操作规程生产、加工，产品质量及包装经检测符合特定标准的产品。

5．食品的腐败变质食品的腐败变质，是指食品在一定的环境因素影响下，由微生物为主的多种因素作用下所发生的食品失去或降低食用价值的一切变化。

二、单项选择题（每题2分）1、A2、B3、C4、D5、B三、填空题（每空1分）1、感观指标、理化指标、微生物指标2、微生物因素3、罐头4、无公害食品、绿色食品、有机食品5、农田、餐桌四、判断对错（每题1分）1、√2、√3、×4、×5、×6、√7、×8、×9、√10、×五、简答题（每题5分）1、谷物及其制品因贮藏或食用方法不当容易引起黄曲霉毒素污染，那么黄曲霉毒素污染食品的原因及其脱毒方法分别是什么？答：黄曲霉菌是空气和土壤中存在的非常普遍的微生物，世界范围内的绝大多数食品原料和制成品均有不同程度的污染。

黄曲霉菌在有氧、温度(30～33℃)和湿润(89％～90％)的条件下容易生长，从而造成贮存的花生、玉米、大米、小麦、大麦、棉籽和大豆等多种谷物的污染变质。

科学解读黄曲霉毒素在我们的日常生活中，常常会听到“黄曲霉毒素”这个词，它似乎总是与食品安全问题紧密相连，让人感到担忧和恐惧。

那么，黄曲霉毒素究竟是什么？它又为什么会对我们的健康造成威胁呢？让我们一起来科学地解读一下黄曲霉毒素。

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的有毒代谢产物。

这些真菌在适宜的温度和湿度条件下，容易在粮食、油料作物、坚果、乳制品等食品中生长和繁殖，并产生黄曲霉毒素。

黄曲霉毒素并不是单一的一种物质，而是一组结构相似的化合物，目前已发现的黄曲霉毒素有二十多种，其中以黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 最为常见，而黄曲霉毒素 B1 则被认为是毒性最强、致癌性最大的一种。

黄曲霉毒素的毒性极强，它对肝脏有特别大的损害作用。

一旦进入人体，黄曲霉毒素会通过血液循环到达肝脏，干扰肝脏的正常功能，破坏肝细胞，导致肝细胞坏死、肝硬化，甚至引发肝癌。

而且，黄曲霉毒素不仅对成年人的健康有危害，对于儿童的生长发育也会产生不良影响，可能会影响儿童的智力发育和身体机能。

那么，黄曲霉毒素是如何进入我们的生活中的呢？这主要与我们的饮食习惯和食品储存方式有关。

在一些地区，由于气候潮湿，粮食和油料作物在储存过程中如果没有做好防潮措施，就很容易被黄曲霉和寄生曲霉等真菌感染，从而产生黄曲霉毒素。

此外，一些小作坊生产的食用油，如果原料受到污染，或者在加工过程中卫生条件不达标，也可能会含有黄曲霉毒素。

还有我们常吃的坚果，比如花生、核桃，如果在储存过程中受潮发霉，也可能会产生黄曲霉毒素。

既然黄曲霉毒素这么可怕，我们应该如何预防和避免呢？首先，要注意食品的储存。

粮食和油料作物要存放在干燥、通风的环境中，避免受潮。

坚果等食品最好购买小包装，开封后尽快食用，吃不完的要密封保存。

其次，要选择正规渠道购买食品。

正规厂家生产的食品，在原料采购、加工生产、质量检测等环节都有严格的标准和监管，能够有效降低黄曲霉毒素超标的风险。

另外，在日常生活中，我们要养成良好的饮食习惯。

应用与环境生物学报 2010，16 ( 5 ): 724~729Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2010-10-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2010.00724黄曲霉毒素（Aflatoxins ）为分子真菌毒素，是一种剧毒和强致癌物质，为迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种. 1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO ）的癌症研究机构划定为一类致癌物. 黄曲霉毒素最易污染玉米、花生、花生油、大米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯. 现已经确定的黄曲霉毒素有20余种，但是污染粮食的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2和M 1等. 在天然污染的粮食中以黄曲霉毒素B 1（AFB 1） 毒性最大，量也最多[1]，致癌性也最强[2]，国际癌症研究机构已经将AFB 1列为人类致癌物[3]，AFB 1属于肝脏毒素，诱发肝癌的能力比二甲基亚硝胺大75倍[1]. AFB 1的危害作用表现在多方面，它不仅是一种肝毒素和致癌剂，而且影响血液循环、造血和消化机能等[4]. 人类健康受AFB 1的危害主要是由于食用被AFB 1污染的食物. 长时间食用含低浓度AFB 1的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因[5~6]. 以外，黄曲霉毒素与其它致病因素（如肝炎病毒）等对人类疾病的诱发具有叠加效应.为深入研究AFB 1的致病机理，就必须提取AFB 1，建立各种动物模型. 目前已有针对相对湿度和温度建立黄曲霉（Aspergillus flavus ）生长模型的相关报道，SamapundoL 等建立了黄曲霉生长的相对湿度、温度模型[7]，彭坚等以小麦为基质建立了黄曲霉的生长预测模型[8]，但研究结果发现，菌斑直径并未随着产毒培养时间的延长而递增. 为掌握黄曲霉的产毒规律，获得更高浓度的毒素，本实验以不同时间、温度和湿度为培养条件，用Logistic （一级）和Ratkowsky （二级）模型对黄曲霉产毒条件进行系统的优化.黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取*庄振宏 郑传琦 汪世华**（福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室/生命科学学院 福州 350002）Optimization of Aspergillus fl avus Culture Conditions and Extractionof A fl atoxin B1*ZHUANG Zhenhong, ZHENG Chuanqi & WANG Shihua **(Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, and College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou 350002, China)Abstract Optimization of culture conditions for Aspergillus flavus was carried out to extract high concentration of a fl atoxin B 1. A. fl avus was cultivated in the rice medium under different temperature gradients (15 ℃, 20 ℃, 25 ℃, 30 ℃, and 35 ℃) and different humidity gradients (0%, 80%, 85%, 90%, 95%, and 100%) respectively. The size of plaque was continuously measured every day for 18 times with Logistic Model and Ratkowsky Modeland. At last, the conditions of toxin production by A. fl avus were optimized by means of the Response Surface Model. The results showed that under the optimized culture conditions (35 ℃，100% humidity at a culture time of 16~17 days), the concentration of the extracted a fl atoxin B 1 was 3 312 ng/mL, and the aflatoxin B 1 yield of per unit area was much higher than that (1 101.471 ng/mL) extrated before optimization in our lab. Further study is needed for carcinogenic mechanism of a fl atoxin B 1. Fig 5, Tab 4, Ref 18Keywords Aspergillus fl avus ; a fl atoxin B 1; rice medium; temperature; humidity; optimization CLC Q949.327.106摘 要 为提取高浓度的黄曲霉毒素B 1，以大米为培养基培养黄曲霉，分别在不同温度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）和湿度梯度（0%、80%、85%、90%和95%和100%）下培养，每天测量一次菌斑直径的变化（共测18 次），然后采用Logistic （一级）和Ratkowsky （二级）模型对黄曲霉菌斑大小进行拟合和检验，最后借助响应面模型对黄曲霉产毒条件进行优化. 结果显示，在35 ℃和100%湿度的培养条件下，只需培养16~17 d 即可获得直径较大的黄曲霉菌斑，提取黄曲霉毒素B 1浓度为3 312 ng/mL ，单位面积黄曲霉毒素B 1产量是优化前（1 101.471 ng/mL ）的3倍. 图5 表4 参18关键词 黄曲霉；黄曲霉毒素B 1；大米培养基；温度；湿度；优化CLC Q949.327.106收稿日期：2009-11-09 接受日期：2009-11-17*国家“863”计划项目（No. 2007A A10Z430）、国家自然科学基金项目（Nos. 31000961，30771400）、福建省自然科学基金项目（Nos. 2010J01068，2009J06008）、教育部新世纪优秀人才支持计划（No. NCET-10-0010）、霍英东教育基金会第十一届高等院校青年教师基金项目（No. 111032）、福建省重点引智项目（No. SZ2008039）、福建省教育厅科技计划项目（No. JB08068）、福建省教育厅资助省属高校专项计划（No. JK2010022）和福建省高校新世纪优秀人才支持计划 Supported by the National “863” Program of China (No. 2007AA10Z430), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31000961, 30771400), the Natural Science Foundation of Fujian, China (Nos. 2010J01068, 2009J06008), the Program of Ministry of Education of China for New Century Excellent Talents in Universities (No. NCET-10-0010), the 11th Fok Ying Tung Education Foundation for Young Teachers in Universities (No. 111032), the Key Project of Fujian for Intellectual Introduction (No. SZ2008039), the Science and Technology Project of Department of Education of Fujian (No. JB08068), the Subsidizing Program of Department of Education of Fujian for Provincial Universities (No. JK2010022), and the Program for New Century Excellent Talents in Universities of Fujian**通讯作者 Corresponding author (E-mail: wshyyl@)7255 期庄振宏等：黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 菌 种 黄曲霉菌标准菌株3.4409，购自中国科学院菌种保藏中心. 点植接种于PDA 试管斜面培养基，28 ℃培养2~3 d供实验用.1.1.2 培养基 在大米培养基中添加不同量的甘油，分别制备相对湿度为0、80%、85%、90%和95%和100%的培养基[9]. 1.1.3 毒素检测试剂盒 ELISA 试剂盒购自北京营养源研究所. 组成：AFB 1抗原包被酶标板（96孔），抗体，酶标二抗，空白对照液，底物（1 mg×6），底物液A ，底物液B ，终止液，PBS-T 洗液.1.2 方 法1.2.1 黄曲霉菌的培养条件及优化 菌落生长实验[10]：用灭菌生理盐水清洗培养2~3 d 的黄曲霉菌落孢子，稀释. 吸取10 μL 孢子稀释液点在相应湿度的大米培养基正中央，分别置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的培养箱中，每隔1 d 测量直径变化.拟合生长模型的建立：1）模型的假设：孢子接种时，不考虑其初始直径差异，统一假设初始直径为1 mm ；并假设椭圆菌斑的直径为椭圆长轴与短轴的平均值. 2）Logistic （一级）模型：采用Logistic （一级）模型[11]拟合实际测定的生长曲线：用线性最小二乘法估计这个模型的参数r ^和X m ：其中，X m 为最大生长值，X 0为初始值，r ^为比生长速率. 用Matlab 7.0软件拟合，得到预测生长曲线的参数最大生长值和比生长速率. 3）Ratkowsky （二级）模型检验：（二级）模型用经典的Ratkowsky 方程[12]拟合，即最大生长速率随温度变化的函数关系：式中，C 1、C 2、T min 和T max 分别是4个经验常数，T min 是微生物能生长的最低温度，T max 是微生物能生长的最高温度. 说明温度较低时，比生长速率的平方根与温度呈线性关系. 4）响应面法分析实验：用SPSS 13.0软件对实验数据进行分析，比较各因素的t 值和可信度. 根据各显著影响因素效应的大小、正负确定效应值（正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值），用MATLAB 7.0软件设计响应面实验，并进行数据处理，以获得培养较大直径菌斑的优化方案. 1.2.2 AFB 1的提取 在通风橱中，往每个培养黄曲霉菌的锥形瓶中加入100 mL 甲醇水（体积比为1 : 1），用玻棒搅拌. 超声萃取10 min 后，快速抽滤，收集滤液，摇匀，然后将滤液倒入球形瓶中，在45 ℃下将滤液旋转蒸发至大约5 mL ，最后经10 000 r/min 、4 ℃离心15 min ，取上清，置于4 ℃冰箱中保存. 用甲醇水（体积比为1 : 1）稀释即可得到不同浓度的AFB 1. 1.2.3 ELISA 标准曲线法测定AFB 1浓度[13~15] AFB 1酶联免疫试剂盒平衡至室温，用1.5 mL 酶标稀释液稀释冻干酶标抗原[16]. 用洗涤液洗板2次并拍干. 按表1依次加入试剂.表1中，1号孔为阳性孔，2号孔为阴性孔，3号孔为限量孔，4~12号孔为试样孔. 4~9号孔中分别加入50 µL AFB 1系列标准溶液，浓度分别为0 ng/mL 、0.1 ng/mL 、0.25 ng/mL 、0.5 ng/mL 、1 ng/mL 和2 ng/mL ，10~12号孔中分别加入50 µL 不同浓度的AFB 1提取液，再把酶标抗原溶液加于各孔中，摇匀，37 ℃温育30 min. 甩干后用洗涤液洗板5次，拍干. 各孔分别加入50 µL 底液a （0.2 g/L 四甲基联苯胺）和50 µL 底液b （乙酸钠柠檬酸缓冲液），37 ℃显色15 min ，各孔分别加入50 µL 终止液，并于450 nm 波长处测定各孔吸光值A [12]. 以4号孔的吸光值A 0为分母，5~9号孔的吸光值A 5~A 9为分子，以吸光值的比值为纵坐标，以6个AFB 1标准溶液浓度的对数（lg C ）为横坐标，绘制AFB 1的标准曲线，再以此标准曲线求出待测AFB 1溶液的浓度.2 结果与分析2.1 黄曲霉菌培养条件的优化2.1.1 黄曲霉菌培养条件的Logistic （一级）模型拟合 采用Logistic （一级）预测模型拟合各环境条件下测得的实际生长数据，得出各条件下黄曲霉菌落的生长预测值，拟合曲线如图1. 由于湿度为0的阴性对照组中菌斑完全没有生长，所以不进行拟合.由表2可知，Logistic 模型拟合生长值的拟合优度R 2都达到0.98以上，因此可以作为预测黄曲霉生长的模型，接着以Logistic （一级）模型拟合数据为基础，建立二级模型.2.1.2 黄曲霉菌培养条件的Ratkowsky （二级）模型检验 黄曲霉菌在不同相对湿度条件下的比生长速率μ对温度（二级）模型拟合曲线如图2所示. 由图2可知，在15~35 ℃范围内，培养的黄曲霉生长速率的平方根与温度呈线性关系，生长率随温度的升高而增加，各线性模型的相关系数均达0.95以上，模型拟合度较高.2.1.3 响应面法分析黄曲霉菌培养条件 用SPSS 13.0软件对实验数据进行分析，比较各因素的t 值和可信度.由表3可看出，温度、时间表现为正效应，湿度表现为负效应. 可信度均大于95%，表现为极显著. 因此以下试验分别以确定的正最大温度（35 ℃）和负最大湿度（100%）为基础，进一步探讨时间因子的效应.由图3-A 可以发现，在100%湿度下，菌斑的直径随温度的升高而增加，当温度达到35 ℃时达到最大值，接近200 mm ，而温度低于15 ℃时没有明显变化. 在时间方面，发现100%湿度条件下培养16~17 d ，菌斑的直径即可达最大值，菌斑直径随温度和时间响应面的方差分析及其显著性分析的表1 AFB 1酶联免疫试剂盒试剂添加顺序表Table 1 The adding order of reagents for enzyme-linkedimmunoassay of AFB 1次序Order 加入量Dosage 孔号 Hole No.123456789101112150 μL A A B 待测试样稀释液 Diluted samples to be tested 2………………………摇匀 Shaking………………………350 μL D C C C C C C C C C C C 4………………………摇匀 Shaking………………………A ：7%甲醇溶液；B ：AFB 1标准物质；C ：酶标AFB 1抗原；D ：酶标AFB 1抗原稀释液A: 7% methanol solution; B: AFB 1 reference material; C: Enzyme-labelled AFB 1; D: Diluted enzyme-labelled AFB 172616 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol结果发现，该回归模型在α=0.01水平上显著（P≈0），相关系数R2为0.957 0，调整后的R2为0.927 0，即表明该模型可以解释92.7%的响应面黄曲霉菌斑的变化，说明该响应面模型的拟合程度较好.由图3-B可知，在35 ℃条件下，菌斑的直径随湿度的增大而增加，当培养基的湿度达到100%时达到最大值，也接近200 mm，而湿度低于90%时增长极为缓慢. 菌斑的直径随时间的变化趋势和100%湿度条件下的试验结果一致，即培养16~17 d后可达最大值. 菌斑直径随湿度、时间响应面的方差分析及其显著性分析结果显示，该回归模型在α=0.01水平上显著（P≈0），方程的相关系数R2为0.963 0，调整后的R2为0.960 0，即表明该模型可以解释96.0%的响应面黄曲霉菌斑图1 不同温度和湿度条件下黄曲霉菌落生长值的拟合曲线Fig. 1 Fit curves of A. fl avus under different temperatures and humidities by Logistic model表2Logistic（一级）模型拟合优度R2统计表Table 2 The goodness of fi t（R2）of each Logistic modelθ/℃RH100%95%90%85%80%150.99680.99000.99470.99140.9864 200.99620.99850.99730.99750.9952 250.98890.99260.99300.98760.9925 300.99830.99610.99450.98910.9956 350.99710.99140.99740.99220.98777275 期庄振宏等：黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取的变化，说明该响应面模型的拟合程度较好.为进一步确定菌斑在最佳温度或湿度条件下的生长变化趋势，分别绘制了100%湿度条件下黄曲霉菌斑直径随温度和时间（Y =f (X 1,X 3)）变化的响应等高线图，以及35 ℃条件下黄曲霉菌斑直径随湿度和时间（Y =f (X 2,X 3)）的响应等高线图.从图4-A 发现，在100%湿度下，当温度达到35 ℃时菌斑的直径达到最大值. 当培养时间为16~17 d 时菌斑的直径可达最大值. 根据图4-B 可以发现，在35 ℃条件下，当培养基的湿度达到100%时菌斑的直径达到最大值. 在35 ℃条件下培养图2 各相对湿度黄曲霉菌斑比生长速率对温度的回归直线Fig. 2 Regression line of A. fl avus speci fi c growth rate at different humidity with temperature表3 各因素水平、效应值及显著性分析Table 3 The analysis for the level of various factors, effect size, and signi fi cation因素Factor效应值Effect size 效应水平Effect levelt P 温度 Temperature (X 1)0.629+20.0800.000湿度 Humidity (X 2)-0.483-15.4670.000时间 Time (X 3)0.528+17.0540.000图3 不同时间（(X 3）下黄曲霉菌斑直径 (Y )与温度或湿度的三维响应面图Fig. 3 3D response surface methodology for the diameter of A. fl avus plaque (Y ) in different time point (X 3) against temperature or humidityA: Under 100% humidity [Y =f (X 1,X 3); X 1, temperature]; B: Under 35 ℃ [Y =f (X 2,X 3); X 2, humidity]72816 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol16~17 d 后菌斑的直径可达最大值.表4显示两个不同响应面模型的结论基本一致，增强了模型的可信度. 本实验结果提示在35 ℃、100%湿度的培养条件下，培养16~17 d 可提取黄曲霉毒素. 因此，后继试验按照以上结果培养和提取黄曲霉毒素.2.2 AFB 1的浓度测定按照AFB 1标准曲线的绘制方法[17]（具体见1.2.3），绘制AFB 1的标准曲线（图5）. 由吸光值A 10~A 12与A 0的比值在标准曲线上求得对应的浓度对数值，求导数后得到待测溶液的浓度，最后得到待测溶液的平均浓度为3 312 ng/mL ，即按响应面分析设计的方法提取的AFB 1浓度为3 312 ng/mL.3 讨 论目前虽然已有针对相对湿度和温度建立的黄曲霉生长模型，SamapundoL 等以5个温度梯度（16 ℃、22 ℃、25 ℃、30 ℃和37 ℃）和7个湿度梯度（0.801~0.982）为条件分别培养黄曲霉菌，运用二次方程函数分析发现30 ℃左右黄曲霉生长最迅速，并指出温度和湿度与黄曲霉菌的生长速度有很强的相关性[7]. 彭坚等发现黄曲霉生长的温度模型符合Rosso 模型，并通过该预测模型发现在60%的相对湿度条件下，黄曲霉的最适生长温度为31.4 ℃[8]. 但这些研究并未考虑各相关培养条件组合下时间因子对菌斑直径变化的影响. 本实验首次采用响应面模型研究方法系统研究了不同温度、湿度组合在不同时间点上对黄曲霉菌生长的影响. 首先对实验进行必要的假设：进行孢子接种培养时，不考虑移液枪每枪打在培养基正中央的初始直径的差异，统一假设初始直径为1 mm ；假设椭圆菌斑的直径为椭圆长轴与短轴的平均值. 然后采用统计学方法处理数据并进行显著性分析，最后采用响应面模型研究方法，系统体现了温度和湿度之间的相关性在不同时间点对黄曲霉菌生长的影响，获得了大米培养基条件下黄曲霉产毒的最优方案，即在35 ℃、100%湿度培养条件下，培养16~17 d ，黄曲霉菌产AFB 1的平均浓度为3 312 ng/mL ，而未经试验设计所提取出的AFB 1的浓度为1 101.471 ng/mL [18]. 运用本方案单位面积AFB 1产量是未经试验设计的3倍，本研究方法测得大米培养基中的AFB 1含量至少为165.6 ng/mL. 本实验为进一步探讨在AFB 1胁迫下，各种动物组织特别是肝脏组织中的蛋白质差异表达谱打下了基础，同时也发现了防止储藏大米受黄曲霉毒素污染的备选方案，即大米储藏条件应为：温度低于15 ℃，相对湿度低于90%.References1 Xiao CY (肖传英), Feng GP (冯广鹏), Wei JT (魏金涛), Zheng JY (郑金玉). 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Feed Rev (饲料博览), 2005, 4: 10~13图4 在不同时间（X 3）下黄曲霉菌斑直径（Y ）与湿度或温度的响应等高线图Fig. 4 Contour plots of plaque diameter (Y ) against temperature or humidity in different time point (X 3)A: Under 100% humidity [Y =f (X 1,X 3); X 1, temperature]; B: Under 35 ℃ [Y =f (X 2,X 3); X 2, humidity]图5 AFB 1标准曲线图Fig. 5 AFB 1 standard curve表4 响应面模型结论表Table 4 The result of response surface model analysis项目Item100%湿度条件下，黄曲霉菌斑直径随温度、时间的响应Contour plots of plaque diameter responding to temperature and time under 100% humidity35 ℃条件下，黄曲霉菌斑直径随湿度、时间的响应Contour plots of plaque diameter responding tohumidity and time under 35 ℃建议时间 Proposed time frame16~17 d 16~17 d 估计菌斑直径 Estimated plaque diameter150~160 mm 140~150 mm R 20.92700.9600729 5 期庄振宏等：黄曲霉培养条件的优化及黄曲霉毒素B1的提取5 Daniel EV, Jimmy DB. Clostridium diffi cile toxins: Mechanism of actionand role in disease. Clin Microbiol Rev, 2005, 18 (2): 247~2636 Ira P, D avid F. Pseudomonas exotoxin: Chimeric toxins. 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