常见呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法的研究
发表时间：2015-12-04T16:27:26.723Z 来源：《航空军医》2015年14期作者：彭丹霞1 张星星2（通讯作者）
[导读] 1.湖南省人民医院 2.中南大学湘雅附二医院儿科医学中心常见的呼吸道病毒有人类偏肺病毒、流感病毒、腺病毒等，这些病毒具有传播速度快、发病急等特性。
1.湖南省人民医院湖南长沙 410005；
2.中南大学湘雅附二医院儿科医学中心
【摘要】经临床证实，当前有90%以上的呼吸道疾病是由细菌以外的病原体引起的，以呼吸道疾病最为常见。
常见的呼吸道病毒有人类偏肺病毒、流感病毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒等。
呼吸道疾病是临床中最为常见的疾病，通常具有传播速度快、发病急、潜伏期短的特性，并且当前出现了越来越多的致命性呼吸道病毒，如非典型性肺炎、禽流感等。
一旦发生这类病毒，通常会引起大范围的危害，对于呼吸道病毒的检测成为医院工作中的重要事项。
由于呼吸道病毒引起的临床感染症状具有相似性，所以仅靠常规检测方法很难快速的确定病原，需要一种高度灵敏的快速检测方法。
本文针对于此，研究常见呼吸道病毒的高度灵敏快速检验的方法，探究快速确定病原的途径。
全文介绍了常见呼吸道病毒、以及检验病毒的方法。
【关键词】常见呼吸道病毒；高度灵敏快速检验方法；临场研究
常见的呼吸道病毒有人类偏肺病毒、流感病毒、腺病毒等，这些病毒具有传播速度快、发病急等特性。
这些病毒可以通过呼吸道引发感染，爆发疫情。
高度灵敏的快速检验方法可以有效的为患者提供诊断依据，使医师可以及时的对症下药，并且对卫生监督和疫情的防控具有重要的意义。
通常呼吸道疾病通过空气传播，很难有效的预防，单体就能辐射很大的区域。
所以研究出有效的检验方法至关重要。
1 常见呼吸道病毒
呼吸道病毒专指以呼吸道为入侵门户，在呼吸道粘膜上皮细胞组织增生，引起呼吸道局部感染病变或呼吸道以外组织气管病变的病毒。
主要通过呼吸道传播，能反复感染，可在人群中暴发流行。
当前主要的呼吸道病毒有流感病毒、副流感病毒、呼吸道合并胞体病毒、腺病毒四种。
流感病毒就是流行性感冒病毒，属于正粘病毒科，造成人体的上下呼吸道感染。
通过空气传播，能引起大范围的疫情。
具有鼻塞、流涕、咽痛等临床症状，并造成肺炎、支气管炎等下呼吸道疾病。
根据抗原性，流感病毒分为甲型、乙型和丙型三种。
甲型病毒易发生异变，造成大规模的流行，异型会引起肌炎和胃肠反应，较小规模，致死率较低，丙型会造成人类的轻微上呼吸道感染，很少造成流行。
流感病毒的发病率较高，但致死率很低，但容易造成疫情的流行；副流感病毒属于副黏病毒科，能够引起下呼吸道感染，在儿童中较为常见，病死率略高。
可以形成反复感染的肺炎、支气管炎、下呼吸道疾病等。
副流感病毒主要分为四种类型，为Ⅰ型到Ⅳ型病毒。
前两种主要会引起哮喘、喉炎、气管严和支气管炎。
Ⅲ型的流感病毒会造成肺炎和细支气管感染，也能引起哮喘。
Ⅳ型病毒会造成上呼吸道感染，检测率很低，一般会引起上呼吸道感染，不会引起肺炎。
副流感病毒任何季节都可暴发流行，但以局部区域性为主，在儿科病房、小学、幼儿园等场所多见，爆发通常以Ⅲ型为主；呼吸道合胞体病毒属于副黏病毒科，也是常见的病原体，可通亲密接触、空气飞沫传播。
这一病毒可造成任年龄段的人群感染，引起发热、咽炎、支气管炎、中耳炎等呼吸道病症。
引起的流行性喘憋性肺炎是造成婴儿死亡的主要疾病之一。
根据抗原性，可分为A、B两种类型；腺病毒属于腺病毒科，会造成呼吸道、肠粘膜上皮细胞的溶解性感染，淋巴样和腺样细胞的潜伏感染和啮齿动物细胞的转化感染。
能够引起3岁以下儿童的急性咽炎热和较大儿童的咽结膜炎热、病毒性肺炎、急性呼吸道感染等疾病。
还会造成非呼吸道组织的病变，如阑尾炎、急性胃肠炎等。
当前检测到的腺病毒有52种，分A、B、C、D、E、F六个亚群。
除以上几种病毒外，还有偏肺病毒、人冠状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、流行腮腺炎病毒等。
呼吸道病毒虽然种类繁多，但引起的症状大同小异，引发的社会危害也不一样。
所以，对于呼吸道病毒有效的甄别能够帮助我们有效的对疫情进行防治。
2 常见呼吸道病毒的高灵敏快速检测方法
当前，具有多种的呼吸道病毒检验技术，如聚合酶链反应技术、DNA探针技术、基因芯片技术以及其他分子生物学检验技术，但是均不能满足目前的需求，所以需要我们探索新型的常见呼吸道病毒检验技术。
2.1试验材料
准备的试验材料有病毒毒株，包括阳性毒株和阴性毒株；细胞培养液；主要的仪器有生物芯片便携式可视化扫描仪、超纯水仪、数显电热水浴箱、琼脂糖电泳仪、芯片杂交盒、精密微量移液器、自动化核酸提取系统等；试剂方面，有病毒基因组提取试剂盒、扩增试剂盒等，化学试剂包括氯化钠、磷酸氢化钠、甲酰胺等。
针对常见病毒，提取六种特异性基因作为检测标靶。
利用信息技术将Gene Bank数据库获取的呼吸道病毒毒株的核苷酸序列进行同源性分析，得到碱基对齐图和聚类分析结果。
使用Primer5.0软件结合碱基对齐图查找相关特异性引物。
根据引物设计原则、PCR扩增物片段对杂交动力学造成的影响，确定扩增物的长度在100~500bp之间。
根据八种呼吸道病毒靶基因对比的结果，呼吸道合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒在不同书的病毒之间具有较高的特异性，同属病毒之间的核酸序列进化相似。
所以，探针的设计应可将待测毒株和其它近原属分开，探针的序列能代表本属内不同的毒株。
探针的特性是帮助基因芯片确定假阳性和假阴性的关键，在设计好探针后利用在线Blast对探针进行特异性分析，确定探针和其它病毒和细菌无相似性后，截取最优长度作为备选探针。
然后合成引物和探针，运用标准亚林酰胺化学方法在自动合成仪上进行氨解、过滤、干燥等程序。
可用可视化显色所用的下游引物5’端进行生物素标记。
探针与氨基基团之间可用聚乙二醇磷酰化试连接。
最后进行引物的纯化。
用200μl纯水，溶解粗样，加入200mg的尿素，待充分溶解后，放入16%的聚丙烯酰胺变性凝胶中，用600V的电压电泳2h。
然后将凝胶取出，放在有荧光背景下的硅胶板上，在紫外灯下取出有紫外吸收的条带。
放到试管中捣碎，并用1M的NaCL溶液，用50°C的纯水水浴3h。
水浴后用22ml纯水、1.5ml的20%乙腈溶液过滤，用1.5ml的离心管收集，并用冷冻干燥机抽干。
将制造的引物用毛细管电泳检测，以紫外定量，冷冻保存。
引物制做好后，制造基因芯片，用寡核苷酸探针以去离子水溶液稀释至100μM。
取点样液和制好的寡核苷酸探针各10μL，混合，待用。
进行病毒核酸的提取，以痰液标本13000rpm离心10min，灭菌处理。
用4%的NaOH液化30min，漩涡震荡10min，4°C液化，再行13000rpm离心10min，弃上清，放至200μl的生理盐水保存。
为了提高病毒核酸的提取质量，可用离心柱提取法、磁珠提取法、自动化提取法对比提取。
为了保证试验的质量，可设人核糖核酸酶P基因编码中的Rnase gene作为靶基因，用4条引物和2条内标做对照探针。
为了建立高灵敏度的快速检验方法，可以建立多重的RT-PCR扩增，将八种常见的呼吸道病毒中的6对特异性引物和2对内标引物分至2管，形成多重RT-PCR的组合。
然后行芯片
的杂交和检测。
将芯片放置杂交盒中，在特定环境下杂交1h。
量子电标记银染增强可视化显色，得到对比结果如下：图1 常见呼吸道病毒部分基因序列片段对比
3 小结
通过本次实验得到常见呼吸道病毒的基因序列对比，通过特异性检验可有效的将检测结果准确率提高到96.32%。
以往工作的难点在于快速的辨别各种常见的呼吸道病毒，针对性的采取治理措施，本文介绍的方法实现了快速的辨别，但在准确率和操作上存在一些不足。
希望本文的探索能为卫生监督和防疫工作起到促进作用。
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