takara 胶回收试剂盒说明书

Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。

为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。

但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。

在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。

而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。

Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。

同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。

使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。

琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit适合于D2501-**,D2500-**&D2502-**准备工作1. 浓缩的SPW Buffer需用乙醇按如下稀释:D2500-00&D2501-00&D2502-00 加入20ml 100%的乙醇;D2500-01/02&D2501-01/02&D2502-01/02 每瓶加入100ml 100%的乙醇;注意:稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存;所有步骤必须在室温下进行.操作方案配制琼脂糖EB凝胶,电泳以分离DNA片段.任何类型或等级的琼脂糖都可以使用.我们强烈的推荐使用新鲜的TAE/TBE电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液,旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量;2. 电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来.并尽量去除多余的凝胶.注意:DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒,同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜.3.称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积.一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算:凝胶薄片的重量为0.2g 则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的Binding Buffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化,其间每隔2-3分钟混匀一次;重要提醒:在凝胶完全溶解之后,注意凝胶-Binding Buffer混合物的pH值.如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少.观察混合物的颜色,如果是橙色或红色,则要加入5μl 浓度为5 M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值.经过这一调节,该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色.一般情况下,使用新鲜的电泳缓冲液,凝胶-Binding buffer混合物的PH值的不会升高;4.转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10,000×g离心1min,弃去液体.一个HiBind DNA柱子最多可容纳700μl的溶液,如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl,可先转移700μl溶液至柱子,离心完后,将余下的溶液继续加上柱子上.但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25~30μg DNA.如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱中.5. 将柱子重新套回收集管中,加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中;室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;这一步相当关键,不要忽略此步.6.将柱子重新套回收集管中,加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;注:SPW Wash buffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释.7. 将柱子重新套回收集管中,重复加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟, 弃去滤出液;,将空柱子重新套回收集管中,10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体.这步可以去除柱子基质上残余的乙醇,不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的.8. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上,10,000×g离心1分钟,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度.如果再洗脱一次的话可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低.DNA的产量及质量:把纯化产物的样品稀释一定的倍数后,分别在260nm和280nm下测其光吸收值,回收得到的DNA的浓度可按以下公式来计算: DNA浓度=光吸收260×50×稀释倍数μg/ml长度大于500bp的片段通常能纯化得到80%的产量. 而50bp~500bp的带则可达到55%~80%的回收率.(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸纯度的一个标记.如果此值1.8,则意味着核酸的纯度>90%.另一方面,如果纯化产物的产量较低时,可以用琼脂糖EB电泳估算产物的浓度.载体。

TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。

本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。

因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。

●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。

●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。

PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。

切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。

本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。

这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。

由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。

2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。

2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。

【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。

2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。

TaKaRa Code：D101ApMD®18-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®18-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD®18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。

本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。

因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。

此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。

●制品内容pMD®18-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支Solution I* 75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。

●保存：-20℃●纯度■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。

●用途■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。

■ 对克隆后的PCR产物使用Bca BEST TM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

1）RNA 提取采用试剂Trizol Reagent (购自invitrogen 公司)2）氯仿；异丙醇；70 % 乙醇；0.1 % DEPC；DEPC 处理的超纯水(2) 聚合酶链式反应（PCR）、核酸电泳试剂1) Tris-硼酸储存（5×TBE）缓冲液：54g Tris 碱，27.5 g 硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶于1000 ml 水。

2) 溴化乙啶（10 mg/ml）:100 ml 水中加入1 g 溴化乙啶，磁力搅拌数小时至溶解，避光保存3）点样缓冲液Loading buffer(10×): 0.25 %溴酚蓝，40 %甘油。

4）Ex Taq DNA Polymerase（TaKaRa），琼脂糖DNA 胶回收试剂盒(北京天根生物公司)5）DNA Makers：DL2000，DNA Maker Ⅲ6) 特异引物（上海生工合成）7) 5'RACE 试剂盒购置大连宝生物工程有限公司(3) 目的基因鉴定、培养基及培养液1）液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0g，调pH 至7.0，定容至1L，高压灭菌。

2）固体培养基：加琼脂15g/L，高压灭菌。

3）氨苄50μg/mL；IPTG 25 mg/mL；X-Gal 25 mg/mL 溶于DMF 中4）5×KCM 溶液3.73 g KCl，2.21 g CaCl2，5.08 g MgCl2，定容至100 ml。

总RNA 的提取实验用品的处理：离心管、枪头等塑料制品用0.1 % DEPC于37 ℃浸泡2h，和0.1 %的DEPC 水高压灭菌30min，研体、剪刀、镊子、容量瓶等180℃烘烤6h。

1）称取100 mg小麦叶片，液氮研磨至粉末状，迅速转入含1mL Trizol的1.5 ml离心管中，混匀，室温下静置5 min。

2）加0.2 ml氯仿，剧烈振摇15 sec，20 ℃静置3 min。

胶回收攻略一、这个回收小片断,我还比较在行,我以前的片断只有100bp市售的试剂盒常常有小片断回收效率很低的问题。

PCR产物经过酶切、回收等步骤后，损失太大。

进入连接反应的PCR片断量太小常常是试验失败的原因。

我的做法是，简化步骤、减少核酸在处理过程中的损失，让较多量的PCR产物和质粒片断进入酶连反应——以量取胜。

我的做法是很粗放型的，但是成功率很高。

如果愿意，你可以试试。

大致的做法是：制作100微升PCR产物；酒精沉淀回收PCR产物；PCR产物及载体酶切；跑回收胶；将回收胶上的PCR产物和载体片断切下，回收到一个试管中；冰冻、碎胶，酚、氯仿抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1微升连接酶和1微升连接buffer，4度过夜；转化涂板。

具体的操作：PCR产物回收1. 制备100μL PCR产物。

2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。

加入 900μL 预冷无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。

颠倒数次混匀。

（提示本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。

）3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。

4. 12000rpm 4℃离心15分钟，沉淀核酸。

5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。

室温下吹风干燥。

（提示可将试管至于超净台吹风干燥。

如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。

）酶切直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：PCR产物酶切－制作插入片断10×Buffer 6μLSal I 5μLPCR产物——双蒸水 49μL合计 60μL要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒（小提的质粒即可）3μL进行酶切。

A质粒酶切－制作载体片断10×Buffer 3μLSal I 1μL质粒 3μL双蒸水 23μL合计 30μL混匀。

37℃，酶切3小时。

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。

操作流程1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。

此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

胶块超过300 mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。

注）切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。

3. 切碎胶块。

胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。

4. 称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。

5. 向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：凝胶浓度Buffer GM使用量1.0％3个凝胶体积量1.0％～1.5％4个凝胶体积量1.5％～2.0％5个凝胶体积量6. 均匀混合后室温15-25℃溶解胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。

此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5～10分钟）。

7. 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液（pH5.2）10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。

当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。

8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。

注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

10. 将700 μl 的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。

注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

11. 重复操作步骤10。

12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。

基因工程实验详细步骤一、目的基因LK的扩增——PCR（含电泳）（一）目的基因LK的扩增——NE201（1）实验准备材料：rLK重组质粒（模板）试剂：PCR试剂盒用具：移液枪（2.5μl、10μl、50μl）以及相应枪头（盒）、EP管（100μl）、EP板（大、小）；冰袋两只、手套、废液桶仪器：离心机（14000rpm）、PCR扩增仪（2）反应体系（50μl）试剂（按照加样顺序）用量dH2O23μL重组质粒1μL上游引物F 0.5μL下游引物R 0.5μLTaq酶25μL（3）反应条件预变性95℃，10min变性95℃，30s退火56.6℃，35s延伸72℃，40s最终延伸72℃，10minTIP：*吸取或加入液体时，枪头尽量少伸入，可避免气泡产生；若有气泡，需10000rcf离心1min 再进行下一步实验*勤换枪头，避免污染试剂或产物*任何移液枪用完后及时调回最大量程*仪器用完后及时关闭（二）LK PCR产物的电泳——NE217（1）实验准备材料：LK PCR产物试剂：去离子水、50×TAE缓冲液、电泳用琼脂糖、6×Loading Buffer、DL1000marker（D526A）、Ultrapower DNA Stain染液用具：钥匙、称量纸、橡皮筋、100ml锥形瓶、50ml量筒；制胶槽、制胶卡、制胶梳（18teeth）；移液枪（10μl、1000μl）及相应枪头（盒），100μl EP管，EP板（大、小）；冰袋两只、手套（包括塑料和麻布）、废液桶仪器：电子天平、微波炉、电泳仪（含电泳槽）（2）制胶（3%）1. 称取电泳用琼脂糖0.6g（即总体积20ml 的3%），小心倒入100ml锥形瓶中2. 取TAE缓冲液400μl于50ml量筒中，去离子水定容至20ml（实为电泳缓冲液）3. 将量筒中液体转入锥形瓶中，盖上吸量纸，用橡皮筋封好，再用步骤2中用剩的枪头扎一个小孔4. 将制胶梳（18 teeth）、制胶卡、制胶槽洗净并用吸水纸擦干，组装好5. 至于微波炉中，注意观察，煮沸后立即拿出（戴上麻布手套），轻轻晃匀，重复2-4次，至胶完全澄清均一为止6. 及时将胶转入准备好的制胶槽，凝固30min后，连着横条纹塑料板一起放入电泳槽中（胶孔靠近负极）（3）加样和电泳1. 在EP管内分别加入A. DL1000marker 5μl，染液1μl；B. PCR产物5μl，6×loading buffer1.2μl，染液1μl2. 将样品全部转入胶孔中。

1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4o C，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4o C，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。

此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。

提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。

OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。

RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。

2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。

其体系为：Total RNA1μg5× gDNA Eraser Buffer2μLgDNA Eraser1μLRNase Free dH2O补齐至10μL 条件为：42o C，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。

其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLRNase Free dH2O补齐至20μL 操作条件为：(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。