显微成像方法与技术2-2

显微成像技术的发展与应用近年来，科技日新月异，人们的生活也在不断发生变化。

显微成像技术作为科技领域的一个重要分支，在医学、生物、物理等领域得到了广泛的应用，并持续地不断发展。

本文将探讨显微成像技术的发展与应用，并分析它们的意义及未来的前景。

一、显微成像技术的发展显微成像技术是一项重要的科技创新，其发展历史可以追溯到17世纪。

当时，人们开始使用简单的显微镜观察微观世界。

19世纪，发明了复合显微镜，可以增强显微镜的分辨率，进一步促进了显微成像技术的发展。

20世纪，电子显微镜的诞生，为显微成像技术带来了一场革命，具有出色的分辨率和灵敏度，即使可以观察到原子尺度的物质。

随着计算机技术的不断进步，显微成像技术的精度和速度也得到了极大的提高。

二、显微成像技术的应用1、医学应用显微成像技术在医学领域中得到了广泛的应用，特别是在癌症的检测和治疗方面。

显微成像技术可以帮助医生将肿瘤细胞分解成微小的分子级部分，以便更准确地确定癌细胞的类型和位置，为疾病的治疗提供更好的依据。

2、生物领域应用显微成像技术在生物学领域应用广泛，能够帮助科学家研究细胞和生物分子的结构及定位。

现代显微成像技术能够使用荧光标记来标记特定的生物分子，从而揭示它们在细胞内的位置和功能。

这种技术在药物研发、疾病治疗和基因研究中得到了广泛的应用。

3、材料科学领域应用显微成像技术对特定材料的结构进行分析和图像化，对材料的分析和评估提供重要的信息。

底层的结构和相互作用方式对材料的性能和机能有着决定性的影响，显微成像技术可以在这一领域发挥独特的作用。

三、显微成像技术的未来随着显微成像技术的不断发展，它在医学、生物、材料科学等领域的应用范围将不断扩大。

研究者们也在不断努力改进技术的分辨率，使其可以观察到更细微的结构。

预计，在未来几年，人工智能和机器学习等技术的不断发展，将为显微成像技术的提高提供支持，从而实现对更细微的生物和科学结构进行更加准确的分析和评估。

近代显微成像技术的研究进展与应用狄伶【摘要】The development of microscope imaging technology was introduced, and the imaging principle and application of fluorescence microscopy, confocal microscopy and super-resolution microscopy were outlined. The technology of stimulated emission depletion (STED) was clarified in the super-resolution microscopy. With the rapid development of computer technology and photo-electricity technology, a new generation of microscopy of living cells is developed, and cells tracking, real-time observation, 3D reconstruction, fluorescence quantification and four-dimensional dynamic analysis can be carried out at molecular and ion levels.%本文简述显微成像技术的发展历史,介绍荧光成像、共聚焦显微成像和超分辨显微成像技术的工作原理及应用.超分辨显微成像技术中主要介绍受激发射损耗技术.随着计算机技术和光电技术的飞速发展,新一代显微成像技术对活细胞微观生命活动实现了分子和离子水平的形态定位、实时动态观察、三维结构重组、荧光定量分析和四维动态分析.【期刊名称】《中国医疗设备》【年(卷),期】2018(033)002【总页数】4页(P107-110)【关键词】显微成像技术;共聚焦显微镜;受激发射损耗;超分辨显微成像技术【作者】狄伶【作者单位】上海交通大学分析测试中心,上海 200240【正文语种】中文【中图分类】TH74引言显微成像技术是一种借助物理方法观察微小物体的技术手段，它的发展与物理学领域对光的认识密不可分。

资料2-1 放大镜的使用方法放大镜的使用方法有两种：一种是将需要观察的物体放置在一个固定的位置上，再将放大镜靠近物体的一侧，然后沿着肉眼与物体之间的直线方向，缓缓地移动放大镜，直至看清楚物体的细微结构为止；另一种方法是将放大镜放置在一个固定的位置上，将需要观察的物体放置在放大镜之下（靠近放大镜），然后沿着肉眼与放大镜之间的直线方向缓缓地移动物体，直至看清楚物体的细微结构为止。

资料2-2 显微镜使用的注意事项1.取送方法因为反光镜是通过镜柄插放在镜臂下面的，目镜是插放在镜筒上的，所以它们很容易滑落而受到损害。

取送显微镜一定要一手握住镜臂，一手托住镜座，在任何情况下都不允许用一只手提着显微镜。

另外，也不允许学生取下反光镜和目镜到处乱照。

2.镜头的保护目镜和物镜平时放在显微镜箱内的专用的盒内，课间要用专用的塑料袋或布袋随时罩好。

镜头脏了，只能用专用的擦镜纸擦拭，擦拭时要顺着一个方向擦。

如果擦拭后仍不干净，可蘸一点二甲苯再擦。

注意，绝不能把镜头直接放到二甲苯中浸泡，这样会使镜头开胶，导致镜片脱落。

3.粗、细准焦螺旋的使用在调节粗、细准焦螺旋使镜筒下降时，一定要用眼睛直接看着镜筒缓缓下降。

否则，有可能砸坏物镜和玻片标本。

显微镜使用时间过长，镜筒容易出现下滑现象，要及时检查和维修。

4.转换器的使用转动转换器时，不要用手指扳物镜。

这容易使物镜镜头松动，改变焦距，影响观察的清晰度。

正确的方法是：手指握准转换器的边缘转动。

资料2-3 电子显微镜电子显微镜是一种精密分析仪器，是利用高速运动的电子束代替光波的一种显微镜。

工作原理为在一个高真空系统中，由电子枪发射电子束，穿透被研究的试样，经电子透镜聚焦放大，在荧光屏上显示一放大的物像，称为通用式电子显微镜；而用电子束在试样上逐点扫描，然后用电视原理进行放大成像显示在电视显像管上的，称为扫描式电子显微镜。

我国在1965年试制成功20万倍电子显微镜，后来又成功研制了80万倍电子显微镜。

单分子定位显微技术（Single Molecule Localization Microscopy，简称SMLM）是一种基于荧光显微技术的高分辨率成像方法，它的原理是通过利用单个荧光分子的闪烁信号来定位样品中的单个分子，从而实现高分辨率成像。

SMLM技术可以实现分子级别的可视化，其分辨率可以达到10纳米以下，远高于传统显微技术。

由于其高分辨率和高灵敏度，SMLM 技术已经成为生物学、化学、材料科学等多个领域中重要的研究工具。

一、原理SMLM的原理基于单个荧光标记的瞬时发光特性。

当激光或其他光源激发荧光标记时，标记会发射荧光光子。

这些光子在相机或光探测器上被捕获，并转化为电子信号。

在SMLM 中，通过分析这些光子的时间和空间分布，可以确定每个荧光标记的位置。

SMLM的关键在于利用光学显微镜的成像系统将荧光标记限制在光学焦点内，使得每次只有单个标记被激发发光。

因此，可以记录每个标记的光子发射时间和位置信息，并将这些信息用于精确定位标记的位置。

SMLM技术包括多种方法，其中最常用的是单分子激发的STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）和PALM（photoactivated localization microscopy）。

在SMLM过程中，需要解决许多技术挑战，包括背景噪声的影响、荧光标记的失活和漂移等问题。

为了解决这些问题，研究者们开发了各种算法和图像处理技术，如滤波、校正和重建方法等。

这些技术的应用可以提高SMLM的空间分辨率和信噪比，并为更深入的细胞生物学研究提供了新的工具。

图 1 STORM其中，STORM是最常用的SMLM技术，其基本原理是利用亚波长分辨率下荧光发光的闪烁特性，对单个发光染料的位置进行定位，进而构建出超分辨率的图像。

STORM技术将样品在一定范围内随机激发，从而使样品中的荧光染料分子以随机的方式发光。

利用图像处理算法，可以对发光点的位置进行高精度的计算，得到超分辨率图像。

光学显微镜技术第一章概述第一节显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第二节显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。

复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。

2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。

3.高级型：万能显微镜。

4.共焦激光扫描显微镜（Confocal）。

第三节光学显微镜的发展简史1625年法布尔提出显微镜的概念1610年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜1611年开普勒说明了显微镜的原理1665年虎克制造出放大140倍的显微镜，提出“Cell”的概念1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪阿贝提出显微镜的完整理论1902年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用第四节显微镜的基本光学原理一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。

色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。

色差的校正（1）采用单色光为光源。

（2）利用透镜的性质。

四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。

目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。

显微镜成象原理：第二章、显微镜的主要光学技术参数第一节数值孔径（Numerical Aperture，NA）数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（η）和孔径角（u）半数正弦的乘积。

用公式表示：NA= ηsin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。

显微镜光学原理及技术参数详解目录1 第一章：显微镜简史 (2)2 第二章显微镜的基本光学原理 (2)2.1 折射和折射率 (2)2.2 透镜的性能 (2)2.3 影响成像的关键因素—像差 (2)2.3.1 色差（Chromatic aberration） (3)2.3.2 球差(Spherical aberration) (3)2.3.3 慧差(Coma) (3)2.3.4 像散（Astigmatism） (3)2.3.5 场曲（Curvature of field） (4)2.3.6 畸变（Distortion） (4)2.4 显微镜的成像（几何成像）原理 (4)2.5 显微镜光学系统简介 (5)3 第三章显微镜的重要光学技术参数 (5)3.1 数值孔径 (6)3.2 分辨率 (6)3.3 放大率 (7)3.4 焦深 (7)3.5 视场直径（Field of view） (7)3.6 覆盖差 (8)3.7 工作距离 (8)4 第四章显微镜的光学附件 (8)4.1 物镜 (9)4.2 目镜 (11)4.3 聚光镜 (11)4.4 显微镜的照明装置 (12)4.5 显微镜的光轴调节 (13)5 第五章各种显微镜检术介绍 (14)5.1 金相显微镜 (14)5.2 偏光显微镜（Polarizing microscope ） (17)5.3 体视显微镜（Stereo microscope） (19)1第一章：显微镜简史随着科学技术的进步，人们越来越需要观察微观世界，显微镜正是这样的设备，它突破了人类的视觉极限，使之延伸到肉眼无法看清的细微结构。

显微镜是从十五世纪开始发展起来。

从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜，到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜，以及相差，荧光，偏光，显微观察方式的出现，使之更广范地应用于金属材料，生物学，化工等领域。

2第二章显微镜的基本光学原理2.1折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。

简述相机显微成像的流程
相机显微成像流程简述如下：
1. 光线通过显微镜物镜聚焦，将被观察物体放大成倒立实像。

2. 实像经过目镜再次放大后，若采用传统光学显微镜，则人眼通过目镜直接观察；若需拍摄记录，则将显微镜配置数码成像组件（如CCD或CMOS）。

3. 成像传感器捕捉到的光信号经过滤色镜分解为RGB三原色，并转化为电信号。

4. 电信号通过模拟前端（AFE）进行放大和模数转换（ADC），生成数字图像信号。

5. 数字信号传输至内置图像处理系统进行色彩校正、噪声抑制等处理，最终形成清晰的显微图像输出至计算机或其他显示设备。

总结：光线经显微镜聚焦后由成像传感器捕获并转换为数字信号，再经处理生成可存储和显示的显微图像。

显微镜的正确调试和使用在了解了显微镜各主要部件的名称、构造和功能之后，为了更好地发挥显微镜的各种功能，提高工作效率，保证在显微观察及显微照像过程中取得最佳效果，使用人员必须了解和掌握显微镜正确的调试方法和使用方法。

尤其在新一代显微镜中，具备了多种功能，能进行多种显微镜检方法观察，正确的试调方法和使用方法就显得尤为重要。

下面以Axioplan万能研究显微镜为例，简述调试及使用方法。

1. 显微镜照明光路系统的调整为了使显微镜的视野能受到均匀而又充分的照明，在显微镜初次安装和调试时，就必须把照明光路系统调整好，这是正确使用显微镜，并获得正确、可*结果的重要手段和最基本的要求。

此外，正确掌握照明光路系统的调整，是使用显微镜过程中更换光源灯泡后所必经的步骤，也是在日常使用过程中不时地检验显微镜性能的必要手段。

显微镜照明光路系统的调整主要有以下4项内容： (1) 照明光源灯室在显微外的初步调整① 首先将灯室的外壳打开，压弹簧夹子将卤素灯泡装入插座中，安装时避免手指直接接触灯泡（可用柔软的布或纸隔住），以免灯泡上留有指纹等脏物，影响灯泡的使用寿命。

② 把灯室摆在桌面上，接通电源后，用专用的螺丝刀调节灯的调焦旋钮孔（标有“←→”），使灯丝投影在1-2m外的墙上，将灯丝成像调至清晰；然后调节灯的高低位置调节丝孔（标有“──”），使灯丝位置高低适当；再调节灯的左右位置调节螺丝孔（标有“──”），使灯丝左右位置合适。

(2) 光源发光体（灯丝）在显微镜内位置的检验和校正目的是为了把发光体的像端端正正地调入物镜的视域范围内，从光源的角度去确保显微镜的视域受到充分而均匀的照明，这是调整库勒照明系统的前提条件。

需要的基本工具：对中望远镜购置显微镜时已配备。

① 拔掉灯库内的毛玻璃套筒，把灯室装回显微镜上；② 选用10×物镜，开亮光源程序找样品并调焦清晰，再换用40×物镜把样品调焦清晰（40×物镜可以看清灯丝的全貌）；③ 把聚光镜的孔径光阑和视场光阑均开到最大；④ 拔掉其中一个目镜，换上对中望远镜，抓住白色部分，另一手伸缩黑色接目镜，就可在视野中看到灯丝像；⑤ 如灯丝位置不合适，调“──”孔，把灯丝像沿水平方向调好，调“──”孔，把丝像沿垂直方向调好，直至将灯丝像调至刚好充满物镜孔径的光圆像；⑥ 调整完毕后，将毛玻璃套筒插回原位，拔掉对中望远镜，换回目镜作下一步调整。