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去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损作者：王德超郑玉琴孙建华史晨辉董金波刘维钢【摘要】目的：研制理想的能够修复骨缺损的骨材料，为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。
方法：体外扩增诱导兔骨髓基质干细胞，将其与去细胞牛松质骨复合培养。
造成兔桡骨中段 10 mm 骨缺损模型，分复合细胞组、单纯材料组、空白对照组。
通过大体观察、放射学检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。
结果：去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损，12 周时缺损区完全被新骨代替，骨髓腔完全通畅，优于单纯材料组的修复效果，单纯材料组优于空白对照组。
结论：去细胞牛松质骨具有良好的成骨能力，有可能成为理想的骨支架材料。
【关键词】骨修复材料；去细胞牛松质骨；组织工程〔Abstract〕Objective To prepare an ideal scaffold material for the repair of bone defect, for the clinical use in the bone reconstruction field. Methods Rabbit marrow stem cells (MSCs) were cultured and expanded in vitro. The MSCs were mixed with acellular bovine cancellous bone (ABCB). The rabbits were prepared as model of bone defects, divided into 3 groups:named complex group, acellular bovine cancellous bone group, and blank control. The animals were sacrificed and new bone regeneration in the defects was investigated by gross specimen inspection,X-ray examination and histological observation. Results At 12 weeks, the radial defects repaired by named complex group, and their marrow cavities formed, which is better than acellular bovine cancellous bone group. Acellular bovine cancellous bone group is better than blank control. Conclusion Acellular bovine cancellous bone may be used as a kind of ideal scaffold material.〔Key Words〕Bone repair material; Acellular bovine cancellous bone; Bone tissue engineering研制理想的生物材料替代自体骨移植用于修复骨组织缺损是医学和生物材料科学领域的一个重要课题。
分类号R683.4 学校代码10601 密级公开编号Y1002107硕士学位论文兔传代骨髓间充质干细胞的筛选及其成骨能力的研究学科专业：外科学研究方向：骨组织工程研究生姓名：茹嘉学号：*******学位类型：科学学位导师姓名：李强教授二O一三年四月独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者签名：签字日期：年月日----------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。
本人授权桂林医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》、《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。
（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日目录兔传代骨髓间充质干细胞的筛选及其成骨能力的研究. ............. .. (5)中文摘要 (5)ABSTRACT (7)英汉缩略对照 (10)前言 (15)1 材料与方法 (15)1.1 实验材料及实验试剂 (15)1.2 实验方法 (15)2 结果 (23)2.1原代细胞观察 (23)2.2 传代细胞观察 (23)2.3 组织学染色CD44免疫学染色 (23)2.4 CD44免疫学染色 (23)2.4 MTT检测细胞增殖周期 (24)2.5 流式细胞仪检测细胞周期 (24)2.6 倒置显微镜观察诱导后细胞形态 (24)2.7Ⅰ型胶原免疫组化染色 (24)2.8 碱性磷酸酶酶标法检测 (24)2.9 钙结节茜素红染色 (25)3 讨论 (26)3.1 BMSCs的分离与纯化方法 (27)3.2 BMSCs体外培养及形态学观察 (29)3.3 BMSCs细胞增殖 (30)3.5 流式细胞仪检测BMSCs细胞周期 (31)3.6 BMSCs向成骨细胞分化 (33)4 结论 (36)参考文献 (37)附图 (42)综述…………………………………………………………………… .46 攻读学位期间发表的学术论文目录………………………………… .61 致谢…………………………………………………………………… .62兔传代骨髓间充质干细胞的筛选及其成骨能力的研究中文摘要目的：1. 本研究从兔骨髓液中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs），进行体外培养，旨在建立一套行之有效的体外分离，培养BMSCs的方法。
脂肪干细胞复合真皮脱细胞基质修复兔关节软骨缺损的实验研究舒雄;郑蕊;杰永生;陈磊;靳少锋;綦惠;孙磊【摘要】目的探讨脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合小牛真皮脱细胞基质(ADM)参与修复兔膝关节软骨缺损的可行性.方法取自体新西兰兔的脂肪组织,采用酶消化分离培养ADSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,FACS检测细胞表面特异性表达以鉴定细胞,行成脂和成骨诱导鉴定.小牛真皮通过脱细胞、交联和冻干制备小牛ADM,ADSCs达到一定数量后接种于ADM得到细胞支架复合物.24只新西兰大白兔随机分A、B、C共三组,A组关节软骨缺损处外科缝合细胞支架复合物,B组软骨缺损处外科缝合ADM,C组软骨缺损不做任何处理.分别于术后第12周处死动物,修复处行大体、组织学检测. 结果成功分离鉴定新西兰兔的脂肪干细胞.经重塑后真皮脱细胞基质支架材料表面光滑、孔隙均匀.ADSCs与ADM复合后,缺损处类软骨组织填充,修复区表面光滑;II型胶原免疫组化显示,复合支架已被吸收,再生的软骨是阳性.结论新型小牛ADM支架材料与ADSCs生物相容性好,ADSCs与ADM复合向软骨诱导后可良好地修复关节软骨缺损,具有替代正常软骨的潜力.%Objective To evaluate the healing behavior of rabbits articular cartilage defects repaired with tissue engineered cartilage constructed by the calf acellular dermal matrix (ADM) seeded with rabbit adipose derived stem cells (ADSCs).Methods Rabbit ADSCs were isolated by enzyme, cultured and expanded from subcutaneous adipose tissue. FACS and multi-lineage differentiation were used to characterize the cultured stem cells. Calf epidermis was prepared by decelluarizing, cross-linking and lyophilizing to calf ADM which reached a certain number and then seeded in ADM toobtain cell scaffold complexes. 24 New Zealand white rabbits were divided into A, B and C groups randomly. Then engineered cartilage was surgically sutured cartilage defect position of rabbits in the group A. ADM was surgically sutured for the group B and nothing for the group C. The rabbits were killed in the 12th week. Restored tissues were evaluated using naked eyes, histology.Results Rabbit ADSCs were isolated and identified successfully. After modification, the surface of ADM was smooth with uniform pores. In the group A, articular cartilage defects of the rabbits were filled with chondrocyte-like tissue in which cells were positive of HE staining and type II-collagen either in expression. In the group B, the defect was filled with the fibrous tissue. No tissue was found in the group C.Conclusion The new calf ADM scaffolds possesses a good biocompatibility with rabbit ADSCs. The complex of ADSCs and ADM after cartilage induction can be used to repair articular cartilage defects, which has the potential to substitute for the normal cartilage.【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2017(012)002【总页数】6页(P143-148)【关键词】脂肪干细胞;真皮脱细胞基质;支架;关节软骨;组织工程【作者】舒雄;郑蕊;杰永生;陈磊;靳少锋;綦惠;孙磊【作者单位】100035 北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院;100035 北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院;100035 北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院;100035 北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院;100035 北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院;100035 北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院;100035 北京市创伤骨科研究所/北京积水潭医院【正文语种】中文关节软骨损伤是临床常见病和多发病，由于关节软骨是无血管、淋巴管及神经的单一结缔组织，营养来源于周围关节滑液的滋润，一旦损伤其再生修复能力十分有限。
骨髓间充质干细胞及其复合物修复兔桡骨缺损的实验研究李明;曹豫江;张德文;罗聪;倪滨;江标【期刊名称】《中国矫形外科杂志》【年(卷),期】2006(14)24【摘要】[目的]通过新西兰大白兔骨髓间充质干细胞离体培养后与去抗原牛松质骨复合植入新西兰大白兔桡骨缺损处,比较修复节段性桡骨缺损的效果,初步探讨治疗骨缺损的组织工程学方法。
[方法]新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(MSCs)离体培养、纯化、扩增后在等同于细胞培养的条件下与去抗原牛松质骨(BCB)复合培养,制成MSCs/BCB复合物并经电镜扫描证实复合物有细胞生长。
制成同种异体新西兰大白兔桡骨干15mm节段性动物模型,MSCs/BCB复合物通过手术移植入动物模型桡骨缺损处,通过X线放射学、组织学、生物力学检测对比实验组与对照组、空白组骨缺损修复情况。
[结果]术后2、4、8、12、16周实验组与实验对照组放射学检查评价新骨生成有显著性差异(P<0.01)。
术后组织学检查新骨生成速度、生成量均有显著性差异(P<0.01)。
16周生物力学三点抗弯曲实验载荷、弯曲应力检测,实验组与实验对照组新骨生成有显著性差异(P<0.01),实验组标本与正常基本一致。
空白对照组各时点均无新骨形成,最后缺损由纤维组织充填。
[结论]骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨组织工程中适宜的种子细胞。
去抗原牛松质骨能够与兔骨髓间充质干细胞体外复合培养,移植入异体新西兰大白兔后未见明显免疫排斥反应,是可以选择的细胞载体。
MSCs/BCB复合物植入修复兔桡骨缺损能够加速新骨形成,修复效果明显优于单纯BCB植入。
【总页数】5页(P1896-1899)【关键词】骨髓间充质干细胞;去抗原牛松质骨;细胞培养;骨移植;骨缺损【作者】李明;曹豫江;张德文;罗聪;倪滨;江标【作者单位】重庆医科大学附属儿童医院骨科【正文语种】中文【中图分类】R687【相关文献】1.自体骨髓间充质干细胞藻酸钙载体复合物对兔膝关节软骨缺损修复影响的实验研究 [J], 于灏;辛畅泰2.自体骨髓间充质干细胞藻酸钙载体复合物对兔膝关节软骨缺损修复影响的实验研究 [J], 于灏;辛畅泰3.不同载体结合兔骨髓间充质干细胞移植联合高压氧修复海水浸泡兔桡骨开放性骨缺损的实验研究 [J], 王崎;程迅生;陈肖松;马武秀;陈聪聪4.SF／PLCL 纺丝材料复合骨髓间充质干细胞修复兔桡骨骨缺损的实验研究 [J], 郑欣;李东亚;陈一心;邱旭升;朱彦丞;施鸿飞;王骏飞;熊进5.温冻存羟基磷灰石/骨骨髓间充质干细胞复合植骨材料修复兔桡骨缺损的实验研究 [J], 马万里;张继波;孔令菊;刘建生;郑德宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子移植治疗糖尿病兔下肢缺血的实验研究杨亚冬;张文元;赵佳骏;张科技;房国坚【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2015(44)6【摘要】目的用包裹血管内皮生长因子(VEGF)的纳米球与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,以期使糖尿病兔下肢缺血症状改善,缺血部位形成新的血管.方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化BMSCs.采用超声乳化-溶剂挥发法制备包载VEGF的PLGA纳米球,并检测其各指标.按100mg/kg耳缘静脉注射四氧嘧啶制备糖尿病兔模型,14天后空腹血糖＞16mmol/L确定为糖尿病模型.成模的糖尿病兔双侧下肢股动脉结扎制作下肢缺血模型,并分4组在股动脉结扎离断区进行多点注射治疗.PBS组、BMSCs组、VEGF 组和BMSCs+ VEGF组,同时设正常对照组.主要观察指标:治疗后各组兔子活动情况、大体解剖情况及下肢缺血区血管形成情况.结果制备的PLGA纳米粒基本呈球形,分散较好,平均粒径为438.97±15.60nm.载VEGF的PLGA纳米粒包封率为87.4％,载药量为43.7μg/g.24h释放率55.48％.共选用28只雌兔制作糖尿病模型,死亡14只,成模12只,2只血糖没达到糖尿病模型标准.死亡率为50％,模型成功率为42.86％,不敏感率7.14％.移植后1个月发现注射PBS组的1只兔子胫骨有一1.0cm×1.5cm的溃疡,行走时呈拖行,另2只呈跛行.注射VEGF组3只兔子均呈跛行.注射MSC组有2只跛行,1只行走正常.注射BMSCs+ VEGF组2只行走正常,活动自如,仅1只略呈跛行.从大体解剖结果及切片结果都可以看出移植BMSCs组、VEGF组及BMSCs+ VEGF组在结扎股动脉后,可形成侧支循环,使股动脉远端保持充盈,血供良好,尤其是移植BMSCs+ VEGF组形成的侧支较多.而PBS治疗组股动脉远端未见充盈,只有回流的股静脉增粗.结论用包裹VEGF的PLGA纳米球与BMSCs共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,对糖尿病兔下肢缺血区血管有促进生成作用,能改善动物模型下肢缺血的症状.【总页数】5页(P47-51)【作者】杨亚冬;张文元;赵佳骏;张科技;房国坚【作者单位】310013杭州,浙江省医学科学院生物工程研究所;310013杭州,浙江省医学科学院生物工程研究所;310013杭州,浙江省医学科学院生物工程研究所;310013杭州,浙江省医学科学院生物工程研究所;310013杭州,浙江省医学科学院生物工程研究所【正文语种】中文【中图分类】R329【相关文献】1.血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病后肢缺血 [J], 章涛;刘艳枚;张潜;蔡争;赵开飞;方宁;刘金伟;余丽梅;石荣书2.内皮祖细胞移植对糖尿病兔下肢缺血区血管生成相关基因表达的影响 [J], 于萍;李强;刘颖;李静宜;王薇;孙玉倩;张巾超3.骨髓干细胞移植治疗糖尿病兔下肢缺血效果观察 [J], 孟建波;康胜群;康素娴;杨彦;周晨光4.人脐带间充质干细胞移植改善糖尿病兔下肢缺血 [J], 樊明世;杨晓凤;吴雁翔;张轶斌;许忆峰;宋楠;黄胜男;张悦5.Neuropilin-1在内皮祖细胞移植治疗后糖尿病兔缺血下肢中的表达 [J], 于萍;李强;刘颖;李静宜;王薇;孙玉倩;张巾超因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
血管局部移植骨髓间充质干细胞对兔血管成形术后内膜增生及内皮功能的影响刘志江;石蓓;王正龙;龙先萍;陈攀科【期刊名称】《上海医学》【年(卷),期】2013(36)5【摘要】目的探讨兔颈动脉血管成形术后,骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对损伤血管内膜增生及内皮功能的影响。
方法新西兰大白兔58只,分入BMSCs组(24只)、球囊损伤组(24只)及正常对照组(10只)。
采用密度梯度离心和贴壁培养法体外培养BMSCs,携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的腺病毒转染标记后备用。
颈总动脉球囊损伤后,BMSCs组以1×107/kg的细胞数经颈外动脉移植到损伤血管局部,球囊损伤组注入等量的磷酸盐缓冲液(PBS)。
术后7d对血管内膜面EGFP行免疫组织化学染色,检测移植BMSCs的归巢。
术后14d采用免疫组织化学染色检测血管内膜血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。
术后28d,采用放射免疫法和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别测定血浆内皮素-1(ET-1)及血清一氧化氮(NO)水平。
术后7、14、28d,采用苏木素-伊红染色(H-E)测定血管内膜面积及内膜面积/中膜面积。
结果术后7d,在BMSCs组的血管内膜有表达EGFP的BMSCs归巢。
术后14d,BMSCs组的血管内膜有连续性CD31的表达,球囊损伤组无表达;BMSCs组PCNA阳性细胞数显著少于球囊损伤组(P<0.01)。
术后28d,BMSCs组的血浆ET-1水平显著低于球囊损伤组(P<0.01),血清NO水平显著高于球囊损伤组(P<0.01)。
BMSCs组在术后7、14、28d的内膜面积、内膜/中膜面积均显著小于球囊损伤组同时间点(P值分别<0.05、0.01)。
结论 BMSCs血管局部移植可促进兔颈动脉血管成形术后损伤内皮的修复,抑制血管新生内膜的增生,可改善损伤血管内皮功能。
【总页数】5页(P453-456)【关键词】骨髓间充质干细胞;内膜增生;内皮功能【作者】刘志江;石蓓;王正龙;龙先萍;陈攀科【作者单位】遵义医学院第一附属医院心内科【正文语种】中文【中图分类】R654.3【相关文献】1.人受体活性修饰蛋白1基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对兔血管成形术后新生内膜的影响 [J], 龙仙萍;赵然尊;石蓓;许官学2.骨髓间充质干细胞移植对大鼠血管成形术后内膜增生及炎症因子表达的影响 [J], 束波;范芳3.骨髓间充质干细胞移植对兔腹主动脉成形术后血管内膜的影响 [J], 吴向军;宋艳丽;耿文真;王庆元;崔家玉4.骨髓间充质干细胞移植对烟雾吸入性损伤兔肺血管内皮生长因子以及血管生成素1和血管生成素2的影响 [J], 朱峰;郭光华;陈雯;彭燕;王年云;邢娟娟5.转染人血管内皮生长因子165基因的骨髓间充质干细胞移植改善兔心肌梗死后心功能 [J], 盛小刚;宋卉;冯建章;陈秋雄;吴书林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
三种细胞因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化陈毅;刘丹平【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)021【摘要】背景:已证实血管内皮细胞种植于组织工程材料上在体内可增殖分化形成血管,但获取内皮细胞时创伤较大,且来源极其有限.目的:观察在血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1体外联合诱导下,兔骨髓间充质干细胞能否向血管内皮细胞分化.设计、时间及地点:2006-11/2007-06在辽宁医学院附属第一医院中心实验室完成的细胞对照观察.材料:清洁级8周龄日本大耳白兔1只用于骨髓间充质干细胞的分离培养.血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1均为Peprotech公司产品.方法:兔麻醉后抽取骨髓液,贴壁法+胰酶消化分离培养获得足够数量的骨髓间充质干细胞,分为两组,诱导组向含10%胎牛血清的DMEM培养液中加入10μg/L血管内皮细胞生长因子、1μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L胰岛素样生长因子1,诱导2周.对照组单纯加入含10%胎牛血清的DMEM培养液.主要观察指标:对诱导后细胞进行形态观察、NO含量测定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色以及电镜观察Weibel-Palade小体形成情况.结果:诱导5d后细胞呈集落样分布,形态趋于圆形;未诱导细胞均匀散在分布,呈长梭形和三角形.诱导14d后,诱导组细胞培养上清液中NO含量明显高于对照组(t=3.75, P<0.05).诱导组表达血管内皮细胞特有表面标志Ⅷ因子,超微结构可见Weibel-Palade小体;对照组Ⅷ因子相关抗原呈阴性表达.结论:兔骨髓间充质干细胞经上述3种细胞因子体外联合诱导后,可向血管内皮细胞方向分化.【总页数】4页(P4093-4096)【作者】陈毅;刘丹平【作者单位】辽宁医学院附属第一医院骨科,辽宁省锦州市,121000;辽宁医学院附属第一医院骨科,辽宁省锦州市,121000【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.人骨髓间充质干细胞体外向血管内皮细胞诱导分化的研究 [J], 杜晓;陈小平;张开明;冯海燕;吴镭2.不同浓度肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化 [J], 罗伟;肖恩华;罗建光;尚全良;伍玉枝;李艳辉;谭艳3.体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化 [J], 贾立山;周云;张亚;张建;张婷;严向明4.血管内皮细胞生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮样细胞 [J], 刘德伍;李晓亮;张志安5.兔骨髓间充质干细胞体外诱导血管内皮细胞 [J], 常青;程燕;高静媛;梁芳倩;于晓龙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
