流式细胞仪操作规程_SOP

BD FACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序目的：规范BDFACSCalibur流式细胞仪操作与维护程序，正确使用设备，保证实验顺利进行、操作人员人身安全和设备安全。

适用范围：本规程适用于BD FACSCalibur流式细胞仪的使用操作。

责任者：操作人员：负责按照本规程操作仪器设备，对仪器进行日常维护，并作使用记录。

保管人员：负责监管仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护、保养。

科室负责人：负责对仪器设备的综合管理。

内容：1.每日开机程序1.1在气压阀减压的状态下检查鞘液桶，确认：1.1.1鞘液充满状态，约3L1.1.2盖紧盖子1.1.3安上金属挡板1.1.4管路畅通，无扭曲1.2.检查废液桶，确认：1.2.1废液桶充满400ml漂白剂1.2.2管路畅通，无扭曲1.3打开流式细胞仪。

1.4打开电脑。

1.5气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。

1.6做Prime。

1.7等待机器预热5~10分钟后可开始试验。

2.每日关机程序2.1用3mlFACSCIean洗液加入样品管中上样，将样品支撑架置于旁位，以外套管吸入1ml。

2.2将样品支撑架置于中位，以HI RUN运行10分钟，使内管吸入约1ml。

2.3将样品管换成蒸馏水重复1-2步。

2.4放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

2.5选择Standby模式10分钟，将激光冷却后可关掉主机。

2.6退出所有应用软件，关闭电脑。

2.7将流式细胞仪的压力阀置于减压状态。

3.每月维护程序3.1将FACSClean洗液1~2L装入鞘液桶。

3.2旁路鞘液过滤器（过滤器上的快速接口从SANLINEFILTER端断开，将鞘液白色管路液路取下联到SANLINE FILTER 端口），以防伤害。

3.3将盛有3ml FACSClean 洗液的试管置于样品支架上，以HI RUN 30 分钟。

3.4将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤3，以HI RUN 60 分钟。

3.5将鞘液桶装满鞘液，恢复过滤器。

流式细胞仪操作规程流式细胞仪是一种用于单个细胞分析的高通量仪器，广泛应用于生物医学研究、药物开发和临床诊断等领域。

为了确保流式细胞仪的正常运行和准确结果的获取，需要制定一套规范的操作规程。

以下是流式细胞仪操作规程的一些基本要点：一、实验前准备：1.确保流式细胞仪处于稳定状态，并将其连接到电源并打开电源。

2.检查仪器的液氮箱和压力容器，确保液氮和气源充足。

3.准备实验所需的标本样品和相应试剂。

4.检查流束对齐和测量准备：校准激光、确定流速、检查流束质量控制。

二、流式细胞仪样品制备：1.使用无菌技术制备样品，并严格遵循相关操作规范。

2.样品的准备应考虑到细胞的数量和稳定性，避免细胞聚集、损伤或死亡。

3.样品的制备应注意避免氧化和污染的发生，以确保结果的准确性。

三、样品装载和分析：1.使用无菌技术将样品加载到流式细胞仪中，并确保样品注射器和管道清洁和无气泡。

2.对于多个样本的分析，应注意正确的样品顺序和识别，以避免混淆。

3.设置合适的仪器参数和测量条件，例如流速、激发和发射光源、滤光片设置和增益调节等。

4.开始样品分析之前，应进行负空白检测和仪器的系统背景校正。

5.开始实验后，密切观察结果窗口，并根据需要进行相应的数据记录和保存。

四、实验后操作：1.实验结束后，关闭流式细胞仪和相关辅助设备，并进行正常关机程序。

2.将仪器和试剂的残留物清洁干净，并按照相关操作规范进行废弃物的处理。

3.维护仪器的常规保养，例如清洁仪器表面、更换滤光片、标定仪器等。

4.及时记录和整理实验数据，并进行必要的数据分析和结果解释。

五、安全注意事项：1.在操作过程中，应遵守相关的生物安全和化学安全规范，例如穿戴好实验室服装、戴手套、戴眼镜等。

2.对于辐射性或有毒性样品的操作，应采取额外的防护措施，例如使用密封容器、穿戴防护服等。

3.在使用激光和其他高能源光源时，注意防护眼睛和暴露部位，避免直接观察激光光源。

总结：流式细胞仪是一种复杂的仪器，需要严格的操作规范来确保实验结果的准确性和数据的可靠性。

流式细胞仪的使用程序------血液病实验诊断中心一.开机程序1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。

2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。

打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS 或FACSFlow),合上压力阀。

确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。

3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。

排出过滤器内的气泡。

4.如果需要打印,打开打印机电源。

5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。

7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。

做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。

待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。

二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。

从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x 轴和y轴参数。

3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。

4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。

. 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测, EXP用于细胞表面标志分析。

cytoflex操作规程CytoFLEX流式细胞分析仪是一种高性能、多参数流式细胞仪，广泛应用于细胞分析、免疫学研究、荧光染色等领域。

为了保证操作安全和数据准确性，以下是CytoFLEX 操作规程。

1. 开机准备a. 检查仪器电源是否插入正确，打开电源开关。

b. 检查电脑是否连接到CytoFLEX流式细胞分析仪。

c. 启动分析软件，如CytExpert。

d. 检查流式细胞分析仪的滤光片配置是否正确。

2. 设定仪器参数a. 在主界面上选择“Acquisition”进行实验参数设置。

b. 选择合适的波长和功率来激发和检测样品中的荧光染料。

c. 根据样品类型和实验要求，设置正确的流速和取样量。

3. 样品制备a. 根据实验要求，选择合适的细胞悬液和染色方法。

b. 遵循标准的样品制备过程，包括细胞计数、离心和悬浮液的制备。

c. 样品处理过程中要保持无菌条件，避免污染和细胞损伤。

4. 样品加载a. 在样品管中加入合适的染料和细胞悬液。

注意避免气泡的产生。

b. 将样品管放入样品架中，确保样品管与固定夹密封紧密。

5. 调节仪器设置a. 使用设置好的仪器参数进行样品调试。

b. 如有需要，调整观察点、光强和阈值，以获得最佳的数据。

6. 开始实验a. 点击软件界面上的“Acquisition”按钮，开始采集样品数据。

b. 实时监控样品流速和染料发光情况，如有异常情况要及时停止实验检查。

7. 数据保存和分析a. 实验完成后，保存数据文件到指定的位置。

b. 使用分析软件对采集到的数据进行后续分析和图表绘制。

8. 清洁和关机a. 关闭采集软件和电脑。

b. 使用清洁剂和纸巾擦拭仪器外壳、玻璃仪器件和样品台面。

c. 关闭CytoFLEX流式细胞分析仪的电源开关。

以上是CytoFLEX操作的基本规程，用户在使用时要按照操作要求仔细操作，确保数据的准确性和仪器的正常运行，同时在实验过程中遵循实验安全规范，确保操作的安全性。

流式细胞仪操作流程(单标)一、开机(务必按照此顺序开机)1、打开下面的小门，推上电源2、打开插线板电源开关3、开电脑4、打开流式细胞仪开关二、软件准备1、打开软件2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。

（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen——new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。

3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方图。

以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。

4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。

三、上机操作1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data，此时流式细胞仪开始工作。

2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。

3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中出现P1，并且其中的细胞变成红色。

4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。

流式细胞仪的使用程序分子病毒实验室一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。

2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。

打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFIow），合上压力阀。

确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3.将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热5-10分钟。

排出过滤器内的气泡。

4.如果需要打印，打开打印机电源。

5.打开电脑 , 等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6.执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。

7.分析样品时，先用 FACAFIow或PBS进行HIGH RUN约2分钟。

做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个 50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。

待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

预设获取模式文件(Acquisition Template Files)从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个1.获取模式文件。

2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。

从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和y 轴参数。

3.选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram （直方图）。

4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。

. 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStationG3\BD Applications \CELLQuest \EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测， EXP用于细胞表面标志分析。

流式细胞仪操作规程目录１:淋巴细胞亚群测定及绝对计数２:活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T得检测3:HLA-B２7测定4:CD55／CD5９测定5:干细胞检测与绝对计数６:白血病免疫分型测定7:淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFＮ—γ/IL－４测定8:细胞周期分析９:活化血小板检测１０:血小板抗体测定11:红细胞抗体测定１2:粒细胞抗体测定淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号:200 年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期: 年月日复审人:规程编写者:审批者:批准日期: 年月日文件分发部门与／或个人院档案室保管者:检验科主任:检验科实验室:淋巴细胞亚群测定方案(Protocｏl) １.选参数4色点击点击3色点击(命名,点击save) 2、画图结果此图为ＣD45圈门如果做绝对计数,则填写Flow-Count得浓度选中cｅｌl/ｕl即可方法流式细胞仪(BｅckmaｎCoulteｒ,贝克曼库尔特)原理:双／三色直接免疫荧光法、荧光素标记得各种单克隆抗体加入到全血中,与白细胞膜上相应得抗原结合,经过溶血、洗涤(与固定)等步骤后,在流式细胞仪上进行分析,从而得到相应各亚群得百分数。

活化淋巴细胞表面抗原为ＣD3+/CD25+与CD3＋/ＨLA—ＤR+、CD3+／CD45RＯ+就是记忆型Ｔ细胞、CD3+/CD45RA+就是纯真型T细胞、HLＡ-B２7测定点击点击键入文件名,点击Ｓavｅ2.画图结果１、positｉvｅ(+)X－Ｍean=１７、1 2.nｅgａｔｉve(—)X—Meaｎ=1.２X－Ｍeａｎ=５、8CＤ55/CD５9测定方案(Protｏcol)(同ＨLA—B2７)结果１、RBC: normal2。

ＲＢC: aｂnｏｒｍaｌ３。

WBC干细胞检测与绝对计数方案(Prｏtocol)同淋巴细胞亚群检测结果(Resｕlt)白血病免疫分型测定Ｔ细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL－4检测正常参考值Thｌ(IFN—γ):17、３9±5。

一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。

它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。

在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。

流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。

BECKMAN-COULTER 公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACS Vantage 和FACS Calibur。

EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。

二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。

2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。

3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm。

4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。

5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

流式细胞仪使用规范流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的细胞分析仪器，广泛应用于细胞学、免疫学、生物学、医学等领域。

流式细胞仪可以对细胞进行快速、准确的多参数分析，能够检测和分离不同细胞类型、测定细胞数量、评估细胞活性以及研究细胞表面标记物等。

为了保证流式细胞仪的正常使用，以下是一些流式细胞仪的使用规范和注意事项。

1.准备工作：a.检查仪器：确认仪器的状态，包括是否通电、通气、光源是否正常工作等。

b.清洁样品室：使用无菌纯水或适当的清洁剂擦拭样品室，确保没有杂物或污染物。

c.校准仪器：根据仪器规定进行标定和校准，确保仪器的准确性和稳定性。

2.样品准备：a.细胞处理：合理处理样品，保证单细胞悬浮状态。

可以通过胰酶消化、筛选等方法获取单细胞悬浮液。

b.细胞计数：使用合适的细胞计数仪进行细胞计数，计算出所需的细胞悬浮液浓度。

c.细胞染色：根据实验需求对样品进行适当的荧光染色或抗体标记，以便在流式细胞仪中检测和分析。

3.流式细胞仪操作：a.设置参数：根据实验设计和研究目的，设置合适的仪器参数，包括激光器选择、激发波长、检测波长、门控设置等。

b.样品加载：将样品注入流式细胞仪样品室，避免气泡的产生，并确保样品完整进入样品室。

c.数据采集：开始数据采集前，进行流式细胞仪的标定、峰位校正和峰间校正，以保证数据的准确性和可靠性。

d.数据分析：对采集到的数据进行分析和解读，根据实验要求选取合适的分析策略和软件进行数据处理。

4.清洁和保养：a.实验后清洁：实验结束后，及时清洁仪器，避免样品残留和交叉污染。

b.仪器维护：定期检查仪器的部件和附件，保证其正常工作。

如需要更换部件或常规维护，请按照厂家指南进行操作。

c.长时间停用：如果流式细胞仪长时间不使用，应按照厂家指南进行仪器的合理关闭和长期存储。

5.安全注意事项：a.避免直接接触激光线：在进行样品加载和设置参数时，避免接触激光线以避免损伤眼睛。

b.使用无菌操作：在样品加载和处理过程中，使用无菌操作和材料，避免细菌污染和交叉感染。

流式细胞仪使用程序1.目的规范流式细胞仪的相关使用操作、以及维护操作。

2.适用范围适用于本实验室使用流式细胞仪。

3.职责操作人员应熟练掌握并自觉遵守本标准操作程序。

如需获得更多信息，请参阅该仪器用户手册。

4.支持性文件流式细胞仪使用说明书。

5.操作规程5.1仪器开/关机程序5.1.1开机程序5.1.1.1 检查仪器鞘液桶和废液桶。

5.1.1.2 打开流式细胞仪。

5.1.1.3 气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。

5.1.1.4 打开电脑。

5.1.1.5 等待机器预热5—10分钟后可开始实验。

5.1.2关机程序5.1.2.1 用4ml10%漂白剂作样品，将样品支撑架置于旁位，以外管吸入2ml。

5.1.2.2 将样品支撑架置于中位，以HI RUN 5分钟，使内管吸入2ml。

5.1.2.3 将样品换成蒸馏水重复1-2步。

5.1.2.4 放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

5.1.2.5 选择Standby模式10分钟。

5.1.2.6 关闭电脑，再关掉仪器。

5.2仪器校验和分析参数设置程序（FACSComp操作程序）5.2.1CaliBRITE Beads 的准备5.2.1.1 在装有1ml鞘液的FALCON管加一滴充分混匀CaliBRITE Beads，并标上unlabeled；若配有双激光做四色，则须在unlabeled管中再加一滴APC-beads；5.2.1.2 在另一装有3ml鞘液的FALCON管加入unlabeled-、FITC-、PE-、PerCP-、和APC-beads（若做四色）各一滴，混匀，在管壁上标上mixed（PerCP不很稳定，最好在上机前加入）；5.2.1.3 避光放置，准备上机。

5.2.2软件环境的设置5.2.2.1 从苹果菜单进入，选择FACSComp软件；5.2.2.2 在Sign In视窗中填入下列信息：操作者、机构、实验室主任（操作者是必须填入的，计算机将保存这些信息），点击Accept；5.2.2.3 进入Set Up视窗，在Assay Selection中，选择你需要的Assay：Lyse/Wash、Lyse/No Wash或HLA-B27 Calib；在CaliBRITE Beads Lot Ids中，根据每一种beads所对应的编码输入Lot ID；在Automatic Saving Options中，你可以选择自动保存或不保存Summary Report，你可以通过单击Location来更改文件名以及保存的位置；最后在Set Up视窗的右下角点击Run。

流式仪操作规程
1. 首次操作时务必在负责人的指导下进行。

2. 操作前需检查所有瓶中的液体，鞘液桶补满超纯水（2L），废液桶倒空，清洗液和消毒液不是空的。

3. 清洗液和消毒液配置方法：清洗液为1% BD FACS Cleaning solution(原液为10%，即稀释十倍使用)，消毒液为BD detergent solution concentrate。

4. 开机前，确保样品支架上放置的EP管内至少装500uL ddH2O。

5. 仪器启动期间，软件界面上仪器当前状态会显示黄色的灯，该过程中仪器会用鞘液冲洗液流管路，持续大约13分钟，直到显示绿灯表示仪器和软件连接完成。

6. 根据实验设计选择软件选项，进行上样。

7. 上样完毕后，用SIP程序清洗进样针，根据提示先上2ml 1% FACS Clean，再上2ml ddH2O。

8. 保证清洗液和消毒液的量，在进样针上放2ml ddH2O，轻触（不能超过3秒）仪器上电源键，仪器自动运行13min cleaning the fluidics程序后自动关机。

9. 清理桌面，写好仪器使用记录。

10.将房间卫生整顿好，垃圾带出实验室，负责人检查后方可离开。

流式细胞仪操作流程流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对单个细胞进行快速、准确的细胞分析和分类。

本文将详细介绍使用流式细胞仪的操作流程。

一、实验准备在进行流式细胞仪实验之前，需要做好以下准备工作：1. 准备样品：收集和准备待分析的细胞样品，确保样品质量符合要求。

处理样品时要注意细胞的保存和处理条件，以避免样品的污染或破坏。

2. 准备反应体系：根据实验的需要，按照标准操作规程制备所需的反应液和缓冲溶液。

3. 检查和校准仪器：在使用流式细胞仪前，需要对仪器进行检查和校准，确保仪器状态良好，获得准确的实验结果。

二、仪器开机和设置1. 打开流式细胞仪电源，并等待仪器启动完成。

2. 进行仪器的初始化设置，包括选择所需的参数和实验模式等。

3. 设置流式细胞仪的激发和检测通道，根据实验需要选择适当的滤光片和荧光探针。

调整激光功率和检测灵敏度，确保后续实验过程中的信号质量。

三、样品加载和检测1. 将样品转移到适当的离心管中，并进行样品标记。

根据实验需要可以使用荧光标记物、抗体等对细胞进行特异标记。

2. 打开流式细胞仪的样品载架，将样品离心管安置在载架上，并将载架插入流式细胞仪的样品槽中。

3. 启动数据采集软件，设置样品参数和实验条件。

选择合适的采集速度和事件数目，确保获得足够的数据。

4. 开始数据采集，点击软件上的“实时运行”按钮，流式细胞仪将开始读取样品中的细胞信息，并将其转化为电子信号。

5. 采集完成后，保存数据并关闭数据采集软件。

四、数据分析1. 导出数据文件：根据实验需要，将采集到的数据文件导出到数据分析软件中进行进一步处理。

2. 进行数据筛选和清洗，去除噪音污染和非特异信号。

3. 根据实验的目的和问题，选择合适的数据分析方法，对细胞数据进行统计学和生物学分析。

4. 生成结果图表：根据数据分析结果，生成合适的图表或图像，用于展示实验结果和研究发现。

5. 结论和讨论：根据数据分析结果，撰写实验结论和讨论，解释实验结果并提出相应的科学推论。

WORD格式流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测3：HLA-B27测定4：CD55／CD59测定5：干细胞检测和绝对计数6：白血病免疫分型测定7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定8：细胞周期分析9：活化血小板检测10：血小板抗体测定11：红细胞抗体测定12：粒细胞抗体测定WORD格式淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200年月日起实施第1版(共3页)本规程每2年复审一次复审日期：年月日复审人：规程编写者：审批者：批准日期：年月日文件分发部门和／或个人院档案室保管者：检验科主任：检验科实验室：淋巴细胞亚群测定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理：双/三色/四色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4；+抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8；+NK细胞：CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。

标本采集与处理受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。

采集部位静脉采血抗凝剂EDTA或肝素抗凝血要求1．样本量1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）⼀、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。

确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续⼯作3个⼩时左右）、盖紧⿊盖、管道畅通、废液桶有⾜够空间容纳本批标本排弃的废液。

如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中⽓压。

2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。

3.⽓压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中⽓泡。

⼆、运⾏FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三⾊标准微球样本。

⼀般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加⼊1滴质控⼩微球，也可以根据实际情况调节浓度。

2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。

选择所需校正内容，如果使⽤的微球是新⼀批产品要输⼊微球的批号。

3.在软件界⾯左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。

4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。

功能键设置在“RUN”。

5.仪器⾃动检查，并做电压、补偿等设置。

6.FACSComp软件运⾏完毕，显⽰结果通过测试。

7.做Set up。

8.打印校正结果，退出FACSComp程序。

备注：在质控过程中，如果提⽰收集细胞速度慢可以提⾼细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，⼀定要⽤“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。

在使⽤仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。

三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。

1.（2）对实验样本进⾏命名；（3）对实验通道进⾏预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。

备注：如果界⾯被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。

3.画图选择画图⼯具（⼀般选择散点图），Inspect界⾯会⾃动弹出，对⼏个常⽤选项进⾏设定：将散点图选中（⽤⿏标点击散点图边框才能够选中图形），将更改横纵坐备注：第⼀个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。

流式细胞仪操作步骤一、样品准备1. 确认样品是否符合实验要求，如细胞浓度、荧光标记等。

2. 根据实验需求，选择合适的试管和细胞样品。

3. 确认样品中是否有杂质或污染物，必要时进行离心和洗涤。

4. 尽可能缩短样品处理时间，避免细胞活性受到影响。

二、样品上机1. 打开流式细胞仪，确认仪器正常工作。

2. 将样品加入到流式细胞仪的样品管中。

3. 根据实验需求，设置合适的流速和压力。

4. 开始采集数据，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。

三、参数设置1. 根据实验需求，选择合适的荧光标记和检测参数。

2. 根据细胞类型和特性，设置合适的门控和阈值。

3. 确认仪器校准和定标工作已完成。

4. 根据需要，设置多色分析，以便于进行细胞分群和定量分析。

四、数据采集1. 在采集数据时，观察仪器工作状态，确保数据准确可靠。

2. 根据实验需求，确定采集的数据量，确保数据具有代表性。

3. 记录采集数据的时间和条件，以便于后续数据分析。

4. 在采集数据时，注意观察细胞活性、浓度和分布情况，及时调整实验条件。

五、数据分析1. 使用专业软件对采集的数据进行处理和分析。

2. 根据实验需求，对数据进行去噪、归一化和定量分析。

3. 进行细胞分群、细胞周期和细胞凋亡等分析。

4. 对数据进行统计学分析和可视化展示。

六、结果输出1. 根据分析结果，输出相应的图表和数据表格。

2. 对结果进行解释和注释，以便于读者理解和应用。

3. 如果需要，可将结果整理成报告形式，提供给相关人员参考和使用。

七、质量控制八、实验室清理。

《流式细胞术操作规程》一、操作准备1.准备所需材料和试剂：包括流式细胞仪、标记抗体、细胞悬液、PBS缓冲液、显微镜玻片、培养基等。

2.检查仪器：确保流式细胞仪各项功能正常，包括激光、光电倍增管等。

3.样本处理：根据实验需要，选择适当的细胞处理方法，如细胞孵育、酶解消化等，确保获取到高质量的细胞悬液。

二、细胞标记1.标记抗体的选择：根据实验需求，选择适当的标记抗体，包括单抗、荧光染料、生物素等。

2.细胞标记试剂的制备：根据实验方案，将标记抗体按照要求的浓度进行稀释，制备成相应的标记试剂。

3.细胞标记操作：将所需细胞悬液分散在适量的PBS缓冲液中，加入标记试剂，轻轻摇晃混合，静置于室温下孵育一段时间，使标记抗体与细胞表面结合。

三、流式细胞术操作1.调整流式细胞仪参数：根据实验需求，设置细胞悬液的流速、激光功率、波长和光电倍增管放大倍数等参数。

2.流式细胞术管套的准备：取一个净化过的管套，用流式细胞术管套清洁剂反复洗涤，然后用蒸馏水清洗，最后用细胞稀释液冲洗一遍。

3.样本装入：将已标记好的细胞悬液加入清洗过的流式细胞术管套中，再用细胞稀释液冲洗一下，确保样本进入流式细胞仪前不会发生凝集或沉淀。

4.样本检测：将样本放入流式细胞仪中，启动仪器开始检测。

通过选择适当的波长和参数，记录并分析细胞的标记情况，如荧光强度、细胞计数、细胞大小等。

5.数据分析：根据实验需求，使用相关软件对所得的数据进行处理和分析，生成数据图表和归纳、总结实验结果。

四、实验结束与清洁1.实验结束：在完成实验后，将仪器设置恢复到初始状态，关闭仪器和电源，清理工作台和废弃物。

2.仪器清洁：使用适当的清洗剂和纯水，清洁仪器内部和外部的各个部分，如样品流路、流式细胞仪的探头等，确保仪器干净整洁。

3.数据保存：将实验所得数据保存到与实验相关的记录文件夹中，以备后续数据分析和验证。

以上是流式细胞术的操作规程。

在进行实验前，要确保仪器的正常运行和合适的细胞标记试剂的选择，严格按照操作规程进行操作，保证实验的顺利进行和数据的准确性。

流式细胞仪的日常操作规范
(总1页)
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流式细胞仪的日常操作规范
一、仪器开/关机程序
1、开机程序
检查仪器鞘液桶和废液桶。

打开流式细胞仪。

气压阀置于加压位置，并排除管路中气泡。

打开电脑。

等待机器预热5—10分钟后可开始实验。

2、关机程序
用4ml10%漂白剂作样品，将样品支撑架置于旁位，以外管吸入2ml。

将样品支撑架置于中位，以HI RUN 5分钟，使内管吸入2ml。

将样品换成蒸馏水重复1-2步。

放置盛有1ml蒸馏水的试管于样品支撑架上。

选择Standby模式10分钟。

关闭电脑，再关掉仪器。

二、维护保养
1、每日保养
用蒸馏水作样品，将样品支架支撑置于旁路，以外管吸入2ml
将样品支撑架置于中位，以HI RUN 5分钟，使内管吸入2ml.
选择Standby模式10分钟。

关闭电脑，再关掉仪器。

2、每月保养
将10%漂白剂装入鞘液桶。

旁路鞘液过滤器,以防损害。

将盛有3ml10%漂白剂的试管置于样品支架上,以HI RUN 20-30分钟。

将鞘液和样品换成蒸馏水重复步骤。

流式细胞仪操作规程目录
1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数
2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测
3：HLA-B27测定
4：CD55／CD59测定
5：干细胞检测和绝对计数
6：白血病免疫分型测定
7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定8：细胞周期分析
9：活化血小板检测
10：血小板抗体测定
11：红细胞抗体测定
12：粒细胞抗体测定
淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪)
医院检验科
操作规程文件号：
200 年月日起实施
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期：年月日
复审人：
规程编写者：
审批者：
批准日期：年月日
文件分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检验科主任：
检验科实验室：
淋巴细胞亚群测定
点击
点击
3色
点击
（命名，点击save）画图
此图为CD45圈门
填写Flow-Count的浓度
活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定
HLA-B27测定
点击
点击
X-Mean=17.1 negative(-)
X-Mean=1.2 X-Mean=5.8
CD55/CD59测定
2.RBC: abnormal
干细胞检测和绝对计数
白血病免疫分型测定
T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测
细胞周期分析
2.画图
血小板膜表面抗体测定
红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）
粒细胞抗体测定。

FACSCalibur流式细胞仪简明操作规程1.开机程序开启稳压电源、变压器，打开流式细胞仪电源；开启计算机，桌面不显示跳动的提示，认为细胞仪和电脑连接成功；确认鞘液筒有2/3满，废液桶近似空的，桶盖是旋紧的（所有管线及管路装置连接通畅，无扭曲、折叠）；将气压阀方向调在加压位置，用手感觉鞘液桶在慢慢鼓起；PRIME排除液流过滤器中的气泡；HIGH RUN 鞘液或超纯水两分钟；开始分析样品。

2.上机操作确保流式细胞仪处于“Run，Hi”状态；上样前，确认样本细胞是否已过滤，去除检品中的细胞团块，以防止管路堵塞；将样本的试剂管在旋涡器上正立混匀5秒；支持架置于旁位，上样，支持架置于正位；点击软件右下方“Acquire”；分析完成后，换样，重复操作。

3.关机程序清洁加样针的外管和内管，防止加样针堵塞或有染料残留；取3ml浓度为0.5%-1%的次氯酸钠（洗液）上样，将样品支持架置于旁位，以外管吸去约1ml，将样品支持架置于中位，再HIGH RUN 10分钟（内管吸去1-2ml）；取 3ml ddH2O 于上样针，将样品支持架置于旁位，用外管吸取1-2ml液体将样品支持架置于正位，按RUN HI，时间需长于5分钟，如8-10分钟；最后留约 1ml ddH2O 在试管中，置于上样位；按Standby以冷却激光，五分钟后关闭细胞仪（务必等五分钟后再FACSCalibur 电源，以延长激光光源寿命。

）；倒掉废液，将气压阀放在减压位置，将鞘流液筒充填至2/3满；确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据已储存备份，关程序，关闭苹果计算机；填写使用记录。

4.日常维护方法标本检测结束后都应清洗机器。

关闭仪器之前，必须清洁进样针，及进样针与套管间的区域。

做好月保养工作，进行系统管道清洗，每月至少一次。

每月至少一次质控，通过标准微球来监测仪器的工作状态定期对设备的各种功能进行检查。

将清洗以及检查、维护记录在案。

使用注意事项该仪器仅限仪器管理人员和通过仪器操作培训的人员操作；样品务必过滤后上机；使用完毕后及时清洗管路。

流式细胞仪操作规程一、开机程序1、检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。

2、打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入 400ml 漂白水原液。

打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用超纯水，特殊情况需要用PBS），合上压力阀。

确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3、将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热 5－10 分钟。

排出过滤器内的气泡。

4、如果需要打印，打开打印机电源。

5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6、执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。

7、分析样品时，先用 FACAFlow 或 PBS 进行 HIGH RUN 约 2 分钟，以去除可能的管路残片。

二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1、从苹果标志中选择 CELLQuest，建一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2、选取屏幕左列绘图工具中的 Dot plot，绘出一个或多个 Dot Plots（点图）。

从 Dot Plot 对话框中选取 Acquisition 作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和 y 轴参数。

3、选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram（直方图）。

4、将此视窗命名后储存于 FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder\EXP 文件夹中（也可以自己取名，但每个实验人员只能建立一个文件夹），下次进行相同实验时可直接调用。

三．用 CELLQuest 进行仪器的设定和调整1、从苹果画面中选取 CELLQuest，进入 CELLQuest 后在 File 指令栏中打开合适的获取模式文件。

2、从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取 Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。