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《基因操作原理》课程教学大纲课程编码：13019课程名称：基因操作原理课程英文名称：Princeples of Gene Manipulation先修课程：生物化学、遗传学、分子生物学等适用专业：生物技术生物科学总学时：56 讲课学时56 实验学时0 实习学时0总学分：3.5一、课程性质、地位和任务“基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。
重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、λ噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术； PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术； DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。
本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。
”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。
二、课程基本要求能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。
本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。
如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。
重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。
三、教学内容及安排绪论：基因操作的理论基础（2学时）本章重点与难点: 掌握与基因操作有关的基本概念0.1基因的概念0.1.1 什么是基因0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性0.1.3 基因的重叠与可变性0.2基因的结构组成0.2.1启动子0.2.2 SD序列0.2.3 转录终止区0.2.4 其它0.3基因克隆的通用策略0.3.1 基本步骤0.3.2 亚克隆第1章基因操作工具酶 (10学时)本章重点与难点:要求掌握和了解限制酶与常用工具酶的种类\活性和用途, 让学生知道“基因操作原理”是靠什么“工具”来完成的。
基因编辑的原理和方法基因编辑是一种人工改变DNA序列的技术，可以使基因按照我们的意愿进行修改，这种技术具有非常广阔的应用前景。
例如，基因编辑可以用于创造更为健康的生育环境，培育肥沃的作物和食品来满足人类不断增长的需求，还可以对一些人类遗传疾病进行治疗。
基因编辑的原理基因编辑技术主要基于“CRISPR-Cas9系统”， CRISPR是“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” 的缩写，即“短反向重复间隔区簇”，是一种细菌和古菌天然的免疫系统，可以识别并清除入侵的病毒基因。
而Cas9则是CRISPR反应的核心酶。
CRISPR-Cas9系统基于RNA-DNA互补对原理，通过依靠CRISPR-Cas9切割引物将外源DNA选择性地剪切，来实现基因编辑。
基因编辑的方法1.基因敲除法通过敲除Gene来验证其重要性，敲除只能删除基因或其部分序列，不能精确编辑。
2.基因点突变法通过在DNA序列内添加或删除单个碱基或数个碱基，来精确定位要修改的基因位点，然后插入、删除、替换外源DNA，并通过Cas9导向这种行为，使得基因序列随之发生改变。
3.基因插入法通过外源DNA在特定的基因位点上插入一个新的基因，使得原基因序列受到影响，随之发生改变。
4.默认激活然后禁用法通过使基因内部的元素初始隐形存在，然后将其激活，以使外源DNA嵌入基因序列中，发挥其正常功能。
基因编辑技术已经是许多学科技术的热点研究方向，但是目前仍存在许多可优化的地方。
需要更多的科学家加入和致力于这项技术的研究和发展，使得我们的生活变得更为美好。
基因操作的原理和过程基因操作（Genetic engineering）是一种利用基因技术对生物体的遗传物质进行修改和重组的技术手段。
通过基因操作，可以对生物的基因进行剪接、修饰或移除，并向生物中引入新的基因或基因片段，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
基因操作在农业、医学、生物工程等领域都有广泛的应用，它不仅可以提高生物的抗病性、耐性和产量，还可以用于研究基因的功能和调控机制。
基因操作的原理是基于对生物体的基因组进行修改和优化，具体分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：首先需要确定要操作的基因，可以是现有生物体中的某个基因，也可以是外源基因。
有时也会选择修改某个特定区域的基因片段。
2. 基因克隆和构建载体：利用分子生物学技术，将目标基因从生物体中分离提取。
然后，将目标基因插入到载体DNA中，构建成重组载体。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化目标细胞：将构建好的重组载体导入到目标细胞中。
可以通过多种途径实现细胞的转化，如化学转化、电转化、冷冻复苏等。
4. 基因表达和筛选：在转化成功后，目标基因会在细胞内进行表达，从而改变生物的遗传特征和表现形式。
为了筛选出表达目标基因的细胞，可以在重组载体中引入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
5. 验证和分析：在筛选出表达目标基因的细胞后，需要对其进行验证和分析。
可以通过PCR、酶切、同源重组等技术手段来验证基因操作的结果，并进一步分析基因的功能。
基因操作的过程中有一些关键技术和工具，如PCR技术、限制性内切酶、连接酶、DNA测序等。
这些技术和工具的应用使得基因操作的过程更加高效、准确。
基因操作的应用领域广泛，涉及农业、医学、生物工程等多个领域。
在农业领域，基因操作可以用于改良农作物的品质和产量，提高抗病虫害的能力，延长保存期限等。
比如，通过引入抗病虫害基因，使植物对害虫和病毒的侵害产生免疫反应。
在医学领域，基因操作可以用于治疗遗传性疾病、癌症等疾病。
比如，通过修正患者的遗传突变，可以恢复正常的基因功能。
基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。
通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。
在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。
基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。
这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。
利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。
基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。
其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。
基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。
在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。
基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。
其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。
（这份材料根据老师给的PDF课件整理，仅供参考）第一章编码产生一种有生物学功能产物---蛋白质（多肽）或RNA所需信息的一段DNA称基因。
Include:1.编码蛋白质肽链或RNA所必需的核苷酸序列(open reading frame)2.保证转录所必须的调控序列(S-D)3. 5’-和3’-非翻译序列(leader and trailer)4.内含子(intron)Recombinant DNA（重组DNA）：是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
这项技术可概括为∶分、切、连、转、选。
两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达。
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
Genetic Engineering（基因工程）重组DNA技术与基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种大规模生产生物活性物质工程细胞。
Development of gene engineering：第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程第二章目的基因的获得（DNA的准备）1.从基因组直接获得2.RT-PCR 方法获得3.人工合成法DNA抽提的基本原理•1 获得细胞，裂解细胞三种破壁、膜的方法比较：非离子型去污剂法较温和．适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈．只能抽提小于10kb的质粒，当然在熟练方法的前提下，碱性SDS法也能抽提较大的质粒。
非离子型去污剂的变性能力较弱，常用的TritonX—100等，常用的离子型去污别是SDS。
在选择去污剂类型对应根据变性剧烈程度的要求而定。
2 分离（质粒DNA与染色体DNA的分离）3 纯化（去除RNA）•RNA与DNA相比在化学及生化性质上有差别，因此可选用RNA酶处理．以保留DNA分子而专门分解RNA。
3 纯化（去除蛋白）•常用的去除蛋白质的试剂有酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇。
PCR的基本原理：变性、复性、半保留复制PCR三步曲：1. DNA热变性90～97℃ 2. 引物退火45～55℃ 3. 引物延伸72℃左右How many copies?1.到第3个循环才有目的片断（指用长DNA作为模板）.2.早期并不严格按2倍增长3.30 循环时约有1,073,741,764 个目的产物(~1×109).4. 有约60 不是目的长度的片断.5.大于35 个循环时不能明显增加产物量进入平台期的原因:1.反应试剂用完2.产物之间相互退火3. Taq酶活性降低优化PCR反应：1.引物的退火温度.2.Mg2+ 的浓度.3. 延伸时间.4.模板和Taq的量能否扩增RNA?• Not directly — the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. • mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase.• cDNA is a template for PCR — it need not be double-stranded.TA 克隆：1.Taq扩增PCR产物物末端加个A；2.可以与末端为T的载体直接连接引物设计要求：引物长度在20个碱基左右；.引物G/C 含量约 45–55%；2条引物退火温度差别不要超过1°C；引物内部最好没有反相互补序列；2条引物之间不能有互补序列；引物内部不能有重复序列。
PCR存在的问题：1 . 可信度（ F i d e l i t y ）： P C R 反应过程中的错配现象，给PCR克隆、变异导入带来麻烦。
2.扩增的DNA长度：一般扩增1～2 kbp以下的DNA片段。
3.扩增的DNA量：对有些检测、克隆时，DNA量往往达不到要求。
4. PCR扩增困难：当DNA富含GC或具有复杂二级结构时，PCR很难扩增。
5.PCR反应速度：当急于得到实验结果时，PCR反应速度较慢。
2-3 分子杂交1 Southern Blotting2 Northern Blotting3 Western Blotting（一）Southern Blot 基因组DNA与DNA探针的杂交功能：1 研究某一基因在基因组中的拷贝数2 研究异源物种是否有类似基因（ZooBlooting）•原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
Southern Blot Southern Blot 操作步骤：DNA →琼脂糖电泳→印迹转移→预杂交→杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色二、Northern Blooting RNA与DNA探针的杂交功能：1 分析mRNA的分子量大小 2 分析mRNA表达量3 分析mRNA表达的组织分布4 分析mRNA的发育表达化5 研究mRNA的不同剪切方式Northern blot的步骤：•1 RNA电泳（包括制备变性胶和RNA样品的处理）•2 转膜（把RNA从胶上转移到膜上）•3 杂交（用标记同位素的DNA探针与膜进行杂交）杂交前一般要进行预杂交，消除非特异性杂交•4 洗膜、曝光、冲片三、Western Blot 蛋白与蛋白的杂交，如蛋白与抗体的杂交功能：1 分析蛋白的分子量大小 2 分析蛋白表达量3 分析蛋白表达的组织分布4 分析蛋白的发育表达变化5 研究蛋白前体的后加工方式WesternBlot原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。
ELISA原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml 水平），并且重复性好。
类型：（1）间接法测抗体(2) 双抗体夹心法测抗原(3)竞争法测抗原cDNA法克隆目的基因的基本策略双链cDNA的克隆双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：1.平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收2.平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，分子可这样重组通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段3.加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收cDNA法克隆目的基因的局限性：1.并非所有的mRNA分子都具有polyA结构2.细菌或原核生物的mRNA半衰期很短3.m RNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难4.仅限于克隆蛋白质编码基因第3章基因工程酶的操作限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。
限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。
如EcoRI来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于B.amyloliquefaciens已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：I、II、III型。
他们在酶反应中所需要的辅因子和切割DNA的位点都不相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。
II型限制酶的识别序列大多是具有双重对称结构性结构,或称回文序列(Palindromic Sequence)大部分II型限制性内切酶的识别序列长度为4-8个核苷酸。
识别长度决定了剪切DNA的频率（1/4n，n为识别的长度）。
识别长度愈长，则切点少、产生片段少而长度长，酶特异性高。
限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构切割位点专一作为工具酶的限制性内切酶有固定的切割位点；产物具有特定的末端结构当一个DNA分子被限制酶切开后形成两个末端，全部产物具有相同的末端结构。
即一种限制性内切酶切割任何DNA只产生一种固定形式的末端结构，在DNA连接酶的作用下，磷酸二酯键可以修复而成为一个重组的DNA分子；而不同限制酶则形成不同末端结构。
任何一种限制酶切割DNA链时，总是水解核苷酸3’、5’-磷酸双酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’为游离羟基。
由于切割位点不同，所有的限制酶可产生两类末端结构①平末端（Blunt End）指酶切片段为齐头末端结构。
②粘性末端（Cohesive End）酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基长度的单链结构，而片段两端突出的单链具有互补的序列。
粘性末端又可分为5‘-粘性末端与3’-粘性末同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。
例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。
这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。
酶反应条件按手册或商品说明书反应缓冲液：根据不同酶使用高、中或低盐缓冲液。
