南开大学基因操作原理 复习要点

基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。

2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。

应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。

宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。

4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。

（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。

（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。

限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。

简答题:1.puc19蓝白筛的原理2.简述pcr的原理和标准热循环3.给定真核质粒(1)确定是真核表达载体还是原核表达载体(2)是否需要对准读码框(3)载体上的f1 ori，pUC ori，Sv40 ori 的作用分别是什么实验设计题A蛋白在正常293T细胞中不表达，但在干扰素的作用下能让293T细胞大量表达A蛋白。

A 蛋白基因序列已知，但不能直接合成。

构建原核表达载体（带有His tag和T7promotor）使A蛋白在大肠杆菌中进行表达，同时获得A蛋白。

现代生物技术发展对微生物发酵工程的影响答:1、阐述一下现代生物技术都有哪些？现代生物技术有基因工程，细胞工程，合成生物学，生物信息学，基因组学、蛋白质组学、蛋白质工程等。

2、突出重点强调：其中基因工程和细胞工程是生物技术的主导领域和热点领域，常常是发酵工程和酶工程的基础。

3、重点强调的优点：传统的发酵工程利用天然微生物进行发酵生产初级代谢产物和次级代谢产物，由于生物技术的出现和日益革新，发酵工程所涉及的范围得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。

基因工程技术已趋于成熟，所得工程菌已得到应用，并已开发不少产品投入市场，如胰岛素、干扰素等。

在氨基酸工程菌组建上也获得成功。

酶工程的固定化细胞发酵的优点在于简化生产工序、降低成本、节约原材料和能源、提高产量和收率以及改善环境污染的能力，在各领域中得到广泛应用。

4、其他新兴学科在这些技术中的辅助和应用：合成生物学的开创和发展，为微生物发酵工程中菌种的选育、构建提供了基础。

这一新兴学科主要建立在将有功能活性的生物功能性小部件拼凑在一起发挥功能利益最大化。

这在微生物发酵过程中的菌种培育和筛选阶段起到了极其巨大的作用。

虽然现在这一技术还未被广泛应用到实际工业生产中，但其潜在的商业价值可见一斑。

生物信息学是21世纪的新兴学科。

它是研究神武信息的采集、处理、存储、传播和分析等各方面学科。

随着生命科学和计算机科学的迅猛发展，两者的结合将揭示大量而复杂的生物数据所赋予的生物学奥秘。

基因操作原理重难点总结1. 基因克隆的宏观策略：答：⑴已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目标基因)：根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因；⑵定位在质粒上的基因克隆：利用识别六碱基的限制性内切酶酶解质粒DNA，电泳分离，然后用特异探针进行杂交，确定基因片段进行克隆；⑶定位在染色体组上的基因克隆：①杂交方法：ⅰ.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。

再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。

ⅱ.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，再进行克隆筛选。

②免疫抗体法：利用鸟枪法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。

③利用简并引物的PCR方法：对目标基因的蛋白质进行N-端氨基酸残基分析。

根据氨基酸序列反推目标基因设计简并引物，以基因组DNA 为模板进行PCR扩增，获得目标基因。

④转座子插入失活克隆法：用转座子对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用转座子序列信息设计特异探针，进行TAIL-PCR双向扩增，从而获得完整基因。

⑤质粒拯救法：利用带有复制起始位点的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序。

⑥功能克隆法(基因表达产物应有明显的表型效应)：利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。

⑦通过双杂交系统克隆新基因：通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。

⑧通过蛋白质组学技术克隆基因：通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因。

2. 设计从某一生物中克隆某一基因的技术路线：答：原核生物：从样品中抽提总DNA，部分酶切，构建合适载体——将目标DNA片段与载体连接——转入宿主细胞培养——可以根据该目标基因所表现出的特定表型筛选，或是利用核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法筛选。

基因工程技术的原理与应用例题和知识点总结一、基因工程技术的原理基因工程技术，简单来说，就是在分子水平上对基因进行操作的技术。

其核心原理包括以下几个关键步骤：1、目的基因的获取目的基因是我们想要研究或应用的特定基因片段。

获取目的基因的方法多种多样，常见的有从基因文库中筛选、通过 PCR 技术扩增以及人工化学合成等。

2、基因载体的选择基因载体就像是一辆“运输车”，负责将目的基因运送到受体细胞中。

常用的基因载体有质粒、噬菌体和病毒等。

它们具有能够在宿主细胞中自主复制、稳定存在等特点。

3、基因重组将获取的目的基因与选择好的基因载体进行连接，形成重组 DNA分子。

这个过程需要用到特定的限制性内切酶和 DNA 连接酶，以确保目的基因能够准确无误地插入到载体中。

4、重组 DNA 导入受体细胞将构建好的重组 DNA 分子导入到受体细胞中，使其能够在受体细胞内稳定遗传和表达。

导入的方法包括转化、转导、显微注射等。

5、目的基因的检测与鉴定导入受体细胞后，需要对目的基因是否成功导入、是否表达以及表达水平等进行检测和鉴定。

常用的方法有核酸分子杂交、PCR 检测、蛋白质检测等。

二、基因工程技术的应用例题1、胰岛素的生产糖尿病患者需要定期注射胰岛素来控制血糖。

传统的胰岛素提取方法产量低、成本高。

通过基因工程技术，科学家将人的胰岛素基因导入到大肠杆菌中，让大肠杆菌能够大量合成胰岛素，大大提高了胰岛素的产量，降低了成本，为糖尿病患者带来了福音。

2、转基因抗虫棉棉花在生长过程中常常受到棉铃虫等害虫的侵害。

利用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌中的 Bt 毒蛋白基因导入到棉花细胞中，使棉花能够自身合成毒蛋白，从而具有抗虫的特性，减少了农药的使用，保护环境的同时提高了棉花的产量。

3、基因治疗对于一些由于基因突变导致的遗传性疾病，如血友病、囊性纤维化等，基因治疗为患者带来了新的希望。

通过将正常的基因导入患者的细胞中，以替代或修复突变的基因，从而达到治疗疾病的目的。

基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。

通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。

在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。

基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。

这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。

利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。

基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。

其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。

基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。

在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。

基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。

其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。

基因工程技术的原理与应用例题和知识点总结一、基因工程技术的原理基因工程，也称为重组 DNA 技术，是一种在分子水平上对基因进行操作和改造的技术。

其基本原理是在体外将不同来源的 DNA 分子进行剪切、拼接和重组，然后将重组的 DNA 分子导入到受体细胞中，使其在受体细胞中表达和遗传。

基因工程的操作主要包括以下几个步骤：1、目的基因的获取从生物体的基因组中直接分离：对于一些结构和功能比较清楚的基因，可以通过限制性内切酶将其从基因组 DNA 中切割下来。

人工合成：如果已知基因的核苷酸序列，可以通过化学方法人工合成目的基因。

PCR 扩增：利用聚合酶链式反应（PCR）技术，以少量的 DNA 为模板，快速扩增出大量的目的基因。

2、基因载体的选择和构建基因载体是能够携带目的基因进入受体细胞的工具。

常用的基因载体有质粒、噬菌体和病毒等。

载体需要具备自我复制能力、多个限制性内切酶切点、标记基因等特点。

3、目的基因与载体的连接通过限制性内切酶切割目的基因和载体，产生相同的黏性末端或平末端。

然后利用 DNA 连接酶将目的基因和载体连接起来，形成重组 DNA 分子。

4、将重组 DNA 分子导入受体细胞常用的导入方法有转化（细菌）、转染（动物细胞）和农杆菌介导转化（植物细胞）等。

5、重组体的筛选和鉴定由于导入受体细胞的重组体中可能存在未成功重组的分子，因此需要进行筛选和鉴定。

常用的筛选方法有抗性筛选、标记基因筛选、核酸分子杂交筛选等。

二、基因工程技术的应用例题1、基因工程在农业领域的应用抗虫棉的培育：将苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因导入棉花细胞中，培育出具有抗虫特性的棉花品种。

举例：某地区常年遭受棉铃虫的侵害，导致棉花产量大幅下降。

科研人员通过基因工程技术，将一种能够编码产生杀虫蛋白的基因导入棉花植株中。

经过筛选和培育，获得了抗虫棉新品种。

在种植过程中，这种抗虫棉能够有效地抵御棉铃虫的危害，减少了农药的使用量，提高了棉花的产量和质量。

生物化学相关的和DNA结构功能相关的不是重点，即前两章。

基因诊断，基因操作，经典遗传学试验，诱变，重组比较重要，即后几章。

最后几节课一定要好好听，不停很吃亏的：）答疑一定尽量去，应该会有收获的。

讲义上打星号的一定一定重点掌握，十之八九是考试内容。

题型：名词解释（3*10）问答（70）* 黄曲霉毒素,EMS 作用原理,以及它是否能诱导琥珀密码子无意突变回复为野生型? *ddNTP法测序的原理，步骤，以及如何排序*LAC 操纵子的IPOAYA几个基因表达的调控*顺式显性*缺失突变作图，以及重组子顺反子相关概念综合运用*southern杂交，限制性内切酶相关的基因诊断*CDNA文库的构建*作为载体应该具有哪些特性*启动子-10，-35RNA聚合酶识别和结合起始转录位点*重组修复*人dgal*IS因子*断裂基因*转换和颠换概念一定掌握*极性突变*多顺反子MRNA*摆动学说（一个氨基酸有多个对应密码子的原因名词解释：阻断交配重复基因点突变一般性转导外显率缺失环交叉遗传超倍体单体诱变剂问答：F因子的特点。

举两个例子说明基因间交互作用。

染色体的结构变异有几种类型，并分别简要说明。

绘图：人14号染色体和21号染色体发生易位后，在减数分裂配对时的形态，有哪些分离方式形成哪些配子？计算：1.有序四分子分析2.三点测交分析名解IS 转录因子 PRIBNOW BOX 多复制子多顺反子MRNA 共转染重组修复问答羟胺引起的突变及能否将三种无意突变回复载体的条件及用lacz插入判断重组子质粒画图限制酶切测定插入的质粒和另一种方法乳糖操纵子那个经典的判断能否产生LAC酶用PCR 的方法测镰刀贫血画图重叠基因及SANGER 法rii突变体互补测定缺失一种基因一种酶的学说的那个判断反应顺序及缺失体调控DNA复制中的酶和蛋白增强子和转座子的区别选择：常染色体显性遗传；隐性遗传；21三体综合症；细胞质遗传；孟德尔的贡献；名解：显性性状；半显性；母系遗传；上位性；互补基因；连锁群；先证者；双三体；拟显性；制图函数问答：发表对“进化的本质是遗传和变异”的看法；设计实验验证基因的显隐性关系；重组后基因型比率的计算；后代基因型比率的计算；三点测交；育种设计；。

第一章基因操作原理的理论基础第一节基因操作原理 (1)第二节基因的结构——理论基础 (2)第一节基因操作原理基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning）。

由于政府对基因操作有一定的法律约束，大多数国家对此都有一个精确的法律定义。

比如在英国将基因操作定义为将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒、质粒或其它载体系统中，再整合到那些本来不含该类物质的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。

（引自Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD & SB Primrose , 1985）。

强调外源核酸分子（一般情况下都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然种的界限，将来自不相关物种的基因放入一个宿主中是基因操作的重要特征。

另一个特征是繁殖。

这里所说的基因操作并不是一个法律概念，除了包括基因克隆外，还包括基因的表达、调控、检测和改造等与基因研究相关的内容。

本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。

基因操作原理在生物学科发展中具有重要地位。

这门课以前叫“分子克隆Ⅰ”，“分子克隆Ⅱ”为实验课。

但无论叫什么，本门课程到底要讲些什么，它的地位如何？20 世纪是生物学发展最为迅速的时期，1953 年由于认识了DNA 的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。

在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平，同时由于遗传学的兴起与发展，DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。

分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。

基因工程的原理与应用例题和知识点总结基因工程，作为现代生物技术的核心领域，正以前所未有的速度改变着我们的生活和未来。

它就像是一把神奇的钥匙，为人类打开了探索生命奥秘和解决诸多难题的大门。

一、基因工程的原理基因工程，简单来说，就是按照人们的意愿，把一种生物的基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。

要实现这一过程，需要以下几个关键步骤：1、提取目的基因目的基因是我们想要研究或应用的特定基因。

提取的方法多种多样，比如可以从基因文库中获取，也可以通过PCR 技术（聚合酶链式反应）进行扩增。

2、基因表达载体的构建这是基因工程的核心步骤。

就好比要把珍贵的宝石镶嵌在合适的底座上，我们要把目的基因连接到合适的载体上，形成一个能够在受体细胞中稳定存在和表达的基因表达载体。

载体通常是一些小型的 DNA分子，如质粒。

3、将目的基因导入受体细胞这就像是把准备好的礼物送到收件人的手中。

导入的方法根据受体细胞的不同而有所差异。

例如，对于植物细胞，可以使用农杆菌转化法、基因枪法等；对于动物细胞，可以采用显微注射法；对于微生物细胞，则常用感受态细胞法。

4、目的基因的检测与鉴定导入之后，还需要确定目的基因是否成功进入受体细胞并且发挥了作用。

常用的检测方法包括 DNA 分子杂交、分子杂交和抗原抗体杂交等。

二、基因工程的应用基因工程的应用领域极为广泛，给农业、医学、工业等多个领域带来了深刻的变革。

1、农业领域（1）培育抗虫、抗病、抗逆的作物新品种通过将抗虫、抗病基因导入农作物，减少了农药的使用，降低了环境污染，同时提高了农作物的产量和质量。

（2）改良农产品品质比如，通过基因工程技术，可以增加水果的甜度、延长蔬菜的保鲜期等。

2、医学领域（1）生产药物利用基因工程技术，可以让微生物或动物细胞大量生产人类所需的药物，如胰岛素、生长激素等。

（2）基因治疗针对一些遗传性疾病，通过将正常基因导入患者体内，以纠正或补偿缺陷基因，达到治疗疾病的目的。

基因工程原理复习重点（1）1. 基因家族（Gene family）又叫多基因家族（Multigene family），系指同一生物体中，从同一祖先基因经过复制、突变而来的一组具有相似的核苷酸序列结构、相似产物、相似功能的基因群体。

从广义上讲，同一基因家族的各个成员也可看作是重复基因。

但两者相比，基因家族不同成员之间的序列差异毕竟要比重复序列的大一些，也就是说序列一致性程度还是较低一些。

2. 基因簇（Gene cluster）系指原核生物基因组中，由不同的或相关的一组相邻基因组成的一种特殊的排列组合方式。

3.基因家族与基因簇二者的区别属于同一多基因家族的各个成员，可以存在于不同的染色体上，也可以是存在于同一条染色体上。

同一基因家族成员的判断标准：a．多重性；b．紧密的连锁性；c. 核苷酸序列同源性；d. 相关的表型与功能。

基因簇的特点：a．同一基因簇的不同成员，在遗传上往往是紧密连锁的；b．同一基因簇的不同成员，可以是同属于同一个操纵子的不同结构基因，也可以是属于不同操纵子的不同结构基因。

c．同一基因簇的不同成员，可以是来自同一基因家族的不同成员，也可以是来自不同基因家族的不同成员。

4. 基因图（Gene map）：是描述染色体或DNA大分子上，不同基因的排列顺序及其间隔距离的一种线性图。

5. 基因作图（Gene mapping）：按照遗传学的方法或者是物理学的方法绘制基因图的过程，叫做基因作图。

基因作图有时也叫做基因定位。

它涉及如下两个具体的内容：a.其一是确定被研究的目的基因与细胞染色体之间的关系，也就是说将目的基因定位在某条特定的染色体分子上。

b.其二是测定目的基因与所在染色体的其它基因之间的间隔距离，以及它们之间的线性排列顺序，亦即是确定目的基因在染色体上的位置。

基因图包括遗传图和物理图两种。

两者之间的本质差别在于前者表示的是以重组率为单位的基因间的相对距离，而后者表示的是以碱基对（bp）为单位的基因间的实际距离。

0、基因工程的技术基础和理论基础1）理论基础：40年代确定遗传信息携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，明确了物质基础50年代确定DNA的双螺旋模型和半保留复制机理，明确自我复制和传递60年代提出中心法则和操纵子学说，破译遗传密码，阐明信息流向和表达。

2）技术基础：60年代的琼脂糖凝胶和Southern转移杂交技术，用于DNA分离和检测60年代初70年代末，发现限制性内切酶和DNA连接酶，实现体外切割70年代中期，实现DNA分子的核苷酸序列分析技术80年代实现体外重组DNA并进入宿主细胞1、基因工程研究的主要内容或步骤①从生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；②在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制载体分子上，形成重组DNA分子；③将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起增殖；④从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得了细胞重组DNA分子的受体细胞克隆；⑤从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；⑥将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要物质。

2、三位一体的基因概念①基因既是携带生物体遗传信息的结构单位，又是控制一个特定性状的功能单位。

②基因是染色体上的实体③基因象链珠(bead)一样，孤立地呈线状地排列在染色体上基因是功能、突变、交换“三位一体”的最小的、不可分割的、基本的遗传单位。

3、一位一体的基因概念基因是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。

基因内可以较低频率发生基因内的重组和交换。

4、顺反子假说1个顺反子决定1条多肽链。

能产生1条多肽链的是1个顺反子，Cistron是基因的同义词。

在一个顺反子内，有若干个突变单位：突变子(muton)。

在一个顺反子内，有若干个交换单位：交换子（recon）。

5、全同等位基因在同一基因座位(locus)中，同一突变位点（site）向不同方向发生突变所形成的等位基因(homoallele)。