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熏蒸法测定土壤微生物量碳的改进

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林启美等 :熏蒸法测定土壤微生物量碳的改进
K2Cr2O7 进 行 消 煮 , 含 碳 量 低 于 5 000μg
时 ,回收率在 9815 %～10516 %之间 ;若用
01036 和 01072 mol·L - 1 K2Cr2O7 进行消
表 1 加入碳的回收率 Tab. 1 Recovery of t he added C
1. 1 土壤 10 种土壤采自北京郊区菜园地 ,用土
钻采 0～20 cm 表层土壤 ,采样地点和土壤 理化性质见文献[ 10 ] 。采集的湿土迅速过 2 mm 筛 ,去掉植物残体和可见的土壤动 物 ,并调节至 50 %的田间持水量 。放入封 闭的铁桶内 ,桶内放少量水和稀碱 ,以保持 桶内的湿度和吸收释放的 CO2 ,室温下培
方法 1 :吸取 8 ml 浸提液于 150 ml 三 角 瓶 中 , 加 入 2 ml 010667 mol ·L - 1 K2Cr2O7 、70 mg HgO 和 15 ml 浓硫酸与磷 酸的混合液 (2 :1) ,于电炉上缓缓加热回流 消煮 , 冷 却 后 再 加 入 25 ml 蒸 馏 水 , 用 010333 mol·L - 1 FeSO4 - H2 SO4溶液 ( 014 mol·L - 1 H2 SO4) 滴定 。
刘焕龙
(北京市农业学校 ,100085)
Modif ication of Fumigation Extraction Method for Measuring Soil Microbial Biomass Carbon. Lin Qimei ( Depart ment of S oil and W ater Sciences , Chi na A gricult u ral U niversity , Beijing 100094) , Wu Yuguang ( The Instit ute of Plant N ut rition and A gricult ual Resou rces , Beiji ng A cademy of A 2 gricult u re and Forest , 100081) , L i u Huanlong ( Beiji ng A gricult u ral Sckool , 100085) . Chi nese Jou rnal of Ecology ,1999 ,18 (2) :63 - 66. Bot h K2 Cr2O7 - H2 SO4 additional heating met hod and t he traditional K2 Cr2O7 - HgO - H2 SO4 H3 PO4 met hod were used in measuring t he carbon in soil K2 SO4extract . It was found t hat t he for2 mer met hod is much more safe , simple and fast t han t he later one. The results obtained by t he K2 Cr2O7 - H2 SO4 additional heating met hod are also more accurate and precise t han t hose by t he traditional K2 Cr2O7 - HgO - H2 SO4 - H3 PO3 one . Thus ,t he K2Cr2O7 - H2 SO4 additional heating met hod can be used in t he routine analysis measurement of soil microbial biomass carbon.
稀释
倍数 , W 烘干土重 ( g) ,01012 碳
的毫摩尔质量 (g) ,106 换算系数 。
土壤生物量碳 ( mg·kg - 1) = 2164 ×
Ec 式中 : Ec 熏蒸与不熏蒸土壤中有机碳 的差值 ,2164 校正系数 。 1. 4 碳的回收率测定
吸取 10ml 含 有 50 、100 、500 、1000 、 2000 、5000μg 碳的葡萄糖水溶液于消煮管 中 ,分别加入 10 ml 01009 、01018 、01036 、 01072 mol ·L - 1 K2Cr2O72 H2 SO4 溶 液 ( H2 SO4浓度为 12 mol·L - 1) , 同上方法消 煮 10 min ,分别用 0105 mol·L - 1 FeSO4 溶 液 (前两个重铬酸钾浓度) 和 012 mol·L - 1 FeSO4 溶液 (后两个重铬酸钾浓度) 滴定至 终点 ,同时做空白 。所有测定都做 3 次重 复 ,用烘干土重表示 。
土壤有机 C 量 (mg·kg - 1) = 01012/ 4
×106 ×M ×(V0 - V) ×f/ w
式中 : M
FeSO4 溶 液 的 浓 度 ( mol ·
L - 1) ,V0
滴定空白所消耗的 FeSO4溶
液的体积 ( ml) ,V 滴定土壤样品所消
耗的 FeSO4 溶液的体积 ( ml) ,f
48. 2 51. 1 55. 7 60. 3 102. 3 98. 5 93. 6 90. 2 477. 0 498. 0 595. 5 567. 5 1 152 987 1 102 1 156
ud 2 112 1 979 1 972
ud ud 4 945 4 895
96. 4 102. 2 111. 4 120. 6 102. 3 98. 5 93. 6 90. 2 98. 4 99. 6 119. 1 113. 5 115. 2 98. 7 110. 2 115. 6
105. 6 98. 8 98. 6
98. 9 97. 9
注 :ud 无法测定.
煮 ,回收率在 9012 %～12016 %之间 ,变幅 较大 。10 ml 土壤浸提液中一般含有 50～ 2000μg 碳 , 采用 01018 mol ·L - 1 K2Cr2O7 进行 消 煮 , 0105 mol ·L - 1 FeSO4 滴 定 , FeSO4消耗量约为 20～10 ml ,滴定终点比 较容易判断 , 所以以后的测定都采用 01018 mol ·L - 1 K2Cr2O72H2 SO4 溶 液 ( H2 SO4 浓度为 12 mol ·L - 1 ) 进行消煮 , 0105 mol·L - 1 FeSO4 滴定 。 2. 2 不同消煮方法对生物量碳测定的影 响
称取相当于烘干土重 20 g 湿土 ,放入 100 ml 的小烧杯中 ,连同盛有 60 ml 左右 无酒精氯仿的小烧杯 (里面放入少量抗暴 沸物质) , 一起放入真空干燥器内 ,真空干 燥器底部加入少量水和稀碱 ( 1 mol ·L - 1 NaOH) 。用 真 空 泵 抽 成 真 空 , 使 氯 仿 沸 腾 ,并持续 2 min , 关闭真空干燥器的阀 门 ,将真空干燥器放入 25 ℃的培养箱中 , 保持 24 h 。取出氯仿 ( 倒回瓶中重复使 用) ,除尽干燥器底部的碱 ,再用真空泵反 复抽气 ,直到土壤闻不到氯仿味为止 。加 入 015 mol·L - 1 K2SO4 溶液 (1 :2 和 1 :4 土 水比) ,振荡 30 min (25 ℃,200 r ·min - 1 ) 后迅速用中速滤纸过滤 ,滤液立即测定或 放入 - 15 ℃下保存 。在熏蒸开始的时候 , 另取等量的土样 ,同上述方法用 015 mol· L - 1 K2 SO4 溶液浸提 ,同时做空白 。 1. 3 浸提液中碳的测定
Key words :soil microbial biomass carbon ,fumigation extraction met hod , additional heating boiling.
自从 J enkinson 和 Powlson[1 ] 创造熏 蒸培养方法测定土壤微生物量碳 ,发展到 用多种方法来测定土壤微生物量 ,如土壤 ATP 含 量 分 析 方 法[2] , 基 质 诱 导 呼 吸 法[3 ] ,精氨酸氨化法[4 ] ,熏蒸浸提法[5 ] ,脂 肪酸 、DNA 、RNA 等微生物细胞成分分析 方法[6～8 ] , 其 测 试 技 术 已 有 了 长 足 的 进 步 。尤其是熏蒸浸提方法 ,由于比较简单 快速等许多优点 ,已被广泛应用 。浸提液 中 碳 测 定 最 初 用 K2Cr2O72HgO2H2SO42 H3 PO4 消煮法 ,不仅费时费力 、效率低 ,而
由于 K2SO4 浸提液中的碳主要是简
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单的小分子的有机碳化合物 ,比较容易氧 化 。将 1 : 4 土 水 比 的 浸 提 液 , 分 别 用 K2Cr2O7 - HgO - H2 SO4 - H3 PO4 回流法
方法 2 : 吸取 10 ml 浸提液于 150 ml 消煮管 (直径 24 mm , 长 295 mm) ,加入 10 ml 01018 mol·L - 1 K2Cr2O72H2 SO4 溶液 ( H2 SO4 浓度为 12 mol·L - 1) ,放入一些抗 暴沸物质 ,摇匀后置于 175 ±1 ℃的磷酸浴 中煮沸 10 min ,冷却后将溶液转移到 150 ml 的三角瓶中 ,使总体积约为 80 ml ,加一 滴邻 啡 罗 啉 指 示 剂 , 用 0105 mol ·L - 1 FeSO4溶液滴定至终点 。
2 结果和讨论
2. 1 碳的回收率 葡萄糖中的碳呈还原形态 , 可被
K2Cr2O7 氧化为 CO2 , 余下的 K2Cr2O7 用
FeSO4 来滴定 ,此反应一般用在土壤有机 质的测定 ,所得结果的准确性和重现性主 要取决于 K2Cr2O7 的加入量 ,一般要求氧 化碳所消耗的 K2Cr2O7 量不得大于加入量 2/ 3 ,否则碳将氧化不完全 。表 1 的结果表 明 :用 01009 mol·L - 1 K2Cr2O7 进行消煮 , 含碳量低于 2 000μg 时 ,回收率在 9614 % ～11513 %之间 ,加入的碳量高于 2 000μg 时 , 测 定 无 法 进 行 ; 用 01018 mol ·L - 1

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土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法及应用土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。

近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。

由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。

测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。

熏蒸提取法（FE法）由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。

Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol·L-1K2SO4提取液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。

Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol·L-1K2SO4提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换系数KEC(取值0.38)来计算土壤微生物碳。

Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。

该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。

林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。

对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数KEC的取值，有很多研究进行了大量的研究。

测定KEC值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。

生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)

生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)

一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。

将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。

得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。

纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。

注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。

硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。

六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。

过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。

磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。

邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。

2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。

氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮

氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮

氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。

首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。

将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。

另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。

其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。

浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。

熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。

微生物量碳、氮的转换系数为0.45。

土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。

土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸

土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。

将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。

盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。

关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。