下载文档原格式
.；. 实验室前期准备工作细胞房在使用前30min先开机净化实验人员进出细胞房时，必须关闭前一扇门以后，再开启后一扇门；实验人员进细胞房前必须穿反身衣，佩戴手套，病毒操作需戴双层手套及双层口罩；实验人员进细胞房后，需用75%酒精消毒；慢病毒感染目的细胞“多聚阳离子Polybrene”可通过中和细胞与病毒颗粒间的静电排斥而促进其帖附，进一步提高病毒感染效率。
但Polybrene并非所有细胞都适用，以下Polybrene预处理步骤仅适用于对Polybrene无明显毒理反应的细胞，不加Polybrene的细胞可直接跳过此步骤。
Polybrene 的工作终浓度为2~10μg/ml，一般常用5μg/ml（以下以5μg/ml为例）特定细胞对Polybrene 的适用情况可咨询汉恒生物病毒技术工程师。
”细胞准备：将状态良好的目的细胞接种到6孔板，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%之间。
感染前，将接种细胞的6孔板从培养箱中取出，吸去细胞原有培养基，加入新鲜的完全培养基，再加入Polybrene。
①以6孔板为例，在加入2ml新鲜完全培养基后，加入汉恒生物提供的母液浓度为10mg/ml 的Polybrene 1μl；轻轻8字混匀后放入培养箱中孵育30min。
②30分钟后，从细胞培养箱中拿出细胞；同时，从冰箱中取出慢病毒，缓慢冰上溶解，将病毒液按不同MOI加入细胞中（操作应尽量放在冰上），轻轻8字混匀，37℃的培养箱中继续培养约12h。
③感染后第二天（约12小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养48h。
④感染后48h，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观察GFP表达效率；对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液筛选稳定转导的细胞株⑤慢病毒感染4天后收集细胞，进行WB检测，判断过表达效率。
慢病毒转染
1、实验前一天，以每毫升3-5×10 4个目的细胞接种96孔培养板中的12孔，体积为90ul。
（不使用边上的孔，保持细胞状态良好）
2、感染预实验共分为四组，每组三个不同的MOI：1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml
3、实验开始，配备1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml，如病毒滴度为1×108TU/ml，取5ul病毒液稀释到45ul的ENi.S.中，在进行一次10被稀释即可。
4、取2ul10mg/mlpolybrene稀释到400ul，备用。
5、将10ul三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。
6、再设定需要添加polybrene的孔中加入10ulpolybrene稀释液。
7、混匀后继续培养，8-12小时候观察细胞生长状态，并更换为新鲜培养基。
8、感染3-4天后，观察荧光表达情况。
9、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
选取效果最优的一组实验条件按相同的实验方法进行正式转染实验。
实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤和元生物|2016-03-1513:51慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。
慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
以24孔为例：第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。
保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。
通常，24孔板内以5-8*10^4cells/孔的密度铺板。
第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量选择合适MOI值，进行病毒感染。
加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。
2弃去部分培养基将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉，保证加入病毒和感染增强剂后，每孔中仍保持500ul的液体量。
3加入慢病毒加药量计算方法（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
4添加感染增强剂polybrene,保证终浓度为5ug/mlPolybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。
Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10μg/ml）。
过长时间暴露于Polybrene（>12小时）可对某些细胞产生毒性作用。
5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。
如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。
弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1 原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
慢病毒感染细胞实验原理及步骤1. 实验原理慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。
2. 主要材料细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、青霉素-链霉素溶液、慢病毒、Polybrene助转染试剂3. 主要试剂配制（1）PBS磷酸盐缓冲液：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）细胞生长培养液：临用前根据需要在培养基中加入10%胎牛血清，再按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 ug/mL，置于4℃冰箱保存。
4. 实验步骤（1）胰酶消化细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为0.5~1×105/ml（根据情况酌情调整），每孔200ul细胞悬液接种至24孔板，培养箱培养过夜。
次日进行慢病毒感染，此时细胞的融合度约为70%左右。
（2）准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用瞬时离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
根据实验按照MOI准确计算慢病毒用量，将其稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
慢病毒感染细胞实验方法一、实验概述培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。
若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。
若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。
二、实验材料1.主要试剂试剂名称试剂来源cat.No.胎牛血清Ausbian VS500TDMEM Corning 10-013-CVR胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制2.主要仪器仪器名称仪器来源cat.No.荧光显微镜奥林帕斯IX71CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2三、实验步骤1．准备目的细胞（1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。
（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。
（3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。
（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
2．目的细胞慢病毒感染（1）贴壁细胞：a.处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成3-5×104个/mL细胞悬液，并根据表1接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15-30%左右。
慢病毒感染步骤包装细胞系：293FT生长培养基：DMEM+10%HI FBS+1%P/S+0.5mg/mlG4184mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐慢病毒培养基：DMEM+10%HI FBS（无抗生素）4mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐目的细胞培养基：DMEM 或者其他培养基+10%FBS，不含抗生素。
转染过程：第一天：准备DNA-lipofectamine 2000复合物a.准备一个5ml EP管，各加入1ug pLP 1 , pLP 2，pLP/SVG以及1ug的慢病毒表达质粒，在50ul(250ul)的OPTI-MEM培养基里面。
b. 准备一个5ml EP管，加入10ul(6ul) lipofectamine 2000,在50ul(250ul) OPTI-MEM培养基里面.(轻轻混匀，室温放置5min)c.将步骤a和步骤b轻轻混匀d.室温放置20min,使其充分形成脂质体复合物，可能会出现浑浊，但是不影响转染e.在形成脂质体复合物的过程中，消化，计数293FT，将细胞稀释在慢病毒培养基中，调整至1.2x106/ml。
f.在6孔板中，加入DNA-脂质体复合物100ul（500ul）以及慢病毒培养基0.9mlg.添加0.9ml细胞悬液（大约1x106）至6孔板中。
轻轻混匀，37℃培养过夜。
第二天换液，将培养液（含脂质体）换掉，加入慢病毒培养基2ml,培养48h,观察细胞融合状况。
注意：换液动作一定要轻，换液不用PBS洗第三天将待转染的细胞（BE2-C，SHEP1）用不含抗生素培养基培养，并用合适的浓度，等到第二天大约在30%的密度第四天a.收293FT细胞产生的病毒上清液，用0.45um的微孔滤膜过滤，然后再向293FT细胞里面加入慢病毒培养基b.感染细胞，加入1ml的慢病毒培养基以及1ml的病毒液，终浓度为4ug/ml polybernec.剩下的病毒液用1.5ml的离心管于-80℃保存，可以保存一年，当用的时候需要融化的时候，室温溶解比37℃溶解要好。
慢病毒转染细胞的操作步骤
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml 新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒感染目的细胞实验步骤
1. 感染预实验
以 24 孔培养板为例，同时进行目的细胞和工具细胞的感染预实验。
工具细胞可选择 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞。
实验材料：培养基、24 孔培养板，移液枪，枪头， EP 管，细胞计数板、冰盒、废液缸等。
（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）
Day1：
准备细胞：培养细胞至对数生长期，细胞以胰酶消化计数后，用细胞计数测出细胞密度，每孔接种5×104个细胞，添加细胞培养液至500µL。
通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。
（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）
Day2：
（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的细胞：从培养箱中拿出细胞，置于显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：
A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；
B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；
C. 混匀后，细胞培养板置于37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。
Day3：
更换培养液：感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。
（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。
）
Day4：
继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。
Day5：
观察（评估）慢病毒颗粒感染效率：盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。
（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。
）
根据荧光情况，可以初步从 MOI 梯度摸索实验中，找出最适合目的细胞的 MOI 值。
2. 摸索细胞的最适药物筛选浓度
细胞的种类与状态均会影响慢病毒颗粒转导效率，部分细胞可能与慢病毒颗粒有相互抵抗的现象，导致感染效率低。
当您在感染后 72、96 小时后发现感染效果仍不理想，建议对感染后的细胞进行药物筛选（药筛），以收集较多感染成功的细胞。
慢病毒颗粒携带的基因整合到目的细胞基因组是随机发生的非同源性重组，当抗性基因表达时，目的基因不一定也能表达，在进行药筛处理后，还要以 qRT-PCR 作进一步鉴定。
在进行正式的抗生素筛选前，建议您先对空白细胞的最小致死浓度进行摸索、优化。
以 293T 细胞+Puromycin 为例，从相关文献查
得 Puromycin 对 293T 细胞的最小致死浓度为2 µg/mL。
在 2 µg/mL附件多设置几个浓度梯度，可以得出较精确的的筛选浓度。
（1）准备 24 孔培养板，按每孔 1-5×104细胞数 (约等于 20%-35% 融合度) 接种 293T 空白细胞，对其中 6 个孔进行铺板；
（2）一般 Puromycin 母液的浓度是 10 mg/mL，用细胞培养基将 Puromycin 母液稀释 1000 倍，可获得终浓度为 10 µg/mL的 Puromycin 稀释液；
（3）按表 5 所示，每孔添加相应的细胞培养基和 Puromycin；
（4）24 孔培养板置于37℃、5% CO2 培养箱，培养过夜；
（5）按表 4 的药筛时间和观察时间建议，定期在荧光显微镜下观察细胞状态。
当空白细胞刚好能全部死亡时，该浓度的抗生素可作为最适药筛浓度。
3. 实验体系的放大和正式实验；
根据预实验结果，放大慢病毒颗粒细胞感染实验，实施正式实验。
通过慢病毒颗粒感染细胞的预实验，我们大致获得慢病毒颗粒感染目的细胞的优化条件。
正式实验所用的细胞数往往比预实验多，慢病毒颗粒用量也需要适当放大。
放大原则是保持细胞密度一致，按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大培养液体积和慢病毒颗粒用量。
有两种放大方法可供参考：
按底面积放大（适用于贴壁细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和底面积成正比，且 MOI 不变，
所需慢病毒颗粒用量也和底面积成正比。
假设预实验使用 96 孔板（底面积 0.3 cm2），使用1 μL慢病毒颗粒（滴度1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（底面积 10 cm2），则：底面积的放大倍数≈ 33
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×33 = 33 μL慢病毒颗粒（滴度1×108 TU/mL）
注：请确保细胞均匀、单层分布，不成簇生长。
按培养体积放大（适用于悬浮细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和感染体积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和培养液体积成正比。
假设预实验使用 96 孔板（培养体积100μL），使用1 μL慢病毒（滴度1×108 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（培养体积 2 mL），则：培养体积的放大倍数 = 20
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×20 = 20 μL慢病毒颗粒（滴度1×108 TU/mL）
注：请确保细胞生长状态良好。
